Name: Stereotaktische Mikroinjektion von viralen Vektoren ausdrücken Cre-Rekombinase, um die Rolle der Zielgene in Cocaine konditionierte Platzpräferenz Studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Lernen Sie die stereotaktische Mikroinjektion viraler Vektoren zur Untersuchung von Genfunktionen in der konditionierten Platzpräferenz bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht präzise Gen-Knockouts während Akquisition, Extinktion und Reinstanzierung.

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Die Autoren bedanken sich bei Anni Lee und Maureen Byrne für ihre Hilfe danken, die Gründung der erweiterten Klimaanlage Platzpräferenz Protokoll.

Alle Vorgänge werden in Übereinstimmung mit dem Weill Cornell Medical College Institutional Animal Care und Use Committee Regeln durchgeführt. 1. Vorbereitung und Einstellung für Stereotaktische Lieferung von viralen Vektoren <ol><li> Wenn ein Instrument, sterilen Tupfer oder Hand tragen sterile Handschuhe durch den Kontakt mit einem nicht-sterilen Oberfläche verschmutzt ist, verwerfen oder erneut sterilisieren das Instrument mit einem Wulst heißen Sterilisator, entsorgen Sie den Tupfer oder ändern, um neue sterile Handschuhe. </li><li> Legen Sie eine Maus Käfig mit Decken auf einem Heizblock für post-operative Erholung erwärmen. </li><li> Einrichten elektrischen Rasierer für Scherkopf und Ethanol und Jod, um die Kopfhaut zu sterilisieren. </li><li> Wischen Sie Ohr Bars und Mund halten der stereotax mit 70% Ethanol. </li><li> Mit einem 5 ul Hamilton Spritze, auszuarbeiten 5 ul viralen Vektor (1 x 10 6 Viruspartikel / ul) und Einrichten in Spritzenhalter auf stereotax. </li><li> Mikrowelle Heizkissen oder drehen Heizkissen auf einend am stereotax. Mit einem sauberen saugfähigen Unterlage, um das Risiko von Verbrennungen zu verringern. Überwachung der Maus Körpertemperatur (zwischen 97-99,5 ° F) häufig den ganzen Vorgang. </li><li> Injizieren Maus (mit einem Gewicht von 22-35 g) mit einer Mischung aus Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (20 mg / kg). Sobald eine Maus ist betäubt, um Prise Schwanzspitze überprüfen die Maus Reflexe und beachten Sie jegliche Bewegung oder Reaktion, um sicherzustellen, dass die Maus ausreichend betäubt ist. </li><li> Shave Kopf zwischen den Ohren und Augen. </li><li> Reinigen Sie rasierten Kopf mit wechselnden Ethanol und Jod sterile Wattestäbchen. </li><li> Übertragen Maus Heizkissen auf stereotax. </li></ol> 2. Stereotaktische Mikroinjektion von viralen Vektoren <ol><li> Tragen Sie sterile Handschuhe während der Operation. Werden Handschuhe an irgendeinem Punkt durch Berühren unsterilen Oberflächen kontaminiert sind, die Handschuhe wechseln. </li><li> Null Zahn bar und Ohr bar Skalen. </li><li> Set Zähne Zahn in bar. </li><li> Schrauben in der Mündung. Wenn wackeln oder Whisker Umzugment jederzeit festgestellt wird, verwaltet ein IP Auffrischimpfung (~ 0,05 cm) von einer Mischung aus Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (20 mg / kg). </li><li> Schrauben in Ohr Bars. </li><li> Schmieren Sie die Augen mit Puralube. </li><li> Kopfhaut aufgeschnitten, nur hinter den Ohren mit einem Skalpell. </li><li> Platz Bulldogge Clips an den Ecken der Kopfhaut zu schälen die Haut vom Schädel. Bregma und Lambda sollte gut sichtbar sein. </li><li> Stellen Sie sicher, Nahtmaterial von Bregma Lambda ist gerade ausgerichtet. Wenn die Naht ist krumm nachjustieren Positionierung des Kopfes. </li><li> Überprüfen Sie, ob alle Einstellungen auf dem stereotax Null sind. </li><li> Setzen Nadelspitze in Ort bei Bregma. </li><li> Messen Sie alle Koordinaten für beide Bregma und Lambda. Dazu gehören dorsal / ventral, medial / lateral und anterior / posterior-Koordinaten. </li><li> Stellen Sie den Kopf, bis die ventralen Koordinaten für Bregma und Lambda innerhalb 0,02 mm von einander sind. </li><li> Einmal ausgerichtet, gehen von Bregma medial aus den medialen / lateralen (M / L) Koordinaten. Stellen Sie sicher,die linken und rechten Seiten in 0,02 mm zueinander ausgerichtet sind. </li><li> Re-Zentrum Nadelspitze auf Bregma und von dort aus bewegen sich in der anterioren / posterioren (A / P) in Richtung auf die gewünschte anterioren / posterioren Koordinate. </li><li> Gegebenenfalls Winkel Nadel in einer Richtung und sicherzustellen, dass die stereotax gesperrt ist. Gehe nach links M / L-Koordinate (+ / - 1,52) </li><li> Messen Sie die Position des ventralen Spitze des Schädels als Referenz zu verwenden, nachdem das Bohrloch gebohrt. </li><li> Bohren eines Bohrlochs mit einem sterilen Bohrer an den gewünschten Koordinatensystem. Prüfen Sie, ob die Nadel durch den Schädel geben ununterbrochen. </li><li> Senken Sie die Nadel an die gewünschte ventralen Koordinate. </li><li> Sobald die Koordinaten erreicht ist, dip 0,015 mm unten ~ 10 Sek. eine kleine Tasche für den viralen Vektor zu erstellen. </li><li> Injizieren Sie die gewünschte Lautstärke von viralen Vektor mit einer Rate von ~ 0,1 ml / min. Warten Sie 3 min für viraler Vektor vollständig diffundieren. Heben Sie die Nadelspitze 0,015 mm und warten Sie eine weitere 2 min. </li><li>Tauchen der Nadel (wenn dies abgewinkelten Injektionen) in die entgegengesetzte Richtung. Wieder, notieren Sie die Bauchlage als Referenz für die Oberseite des Schädels. </li><li> Wiederholen Sie die gleichen Schritte wie auf der ersten Seite zu viralen Vektors auf der gegenüberliegenden Seite zu injizieren (wenn dies bilateralen Injektionen). </li><li> Bewerben Knochenwachs zu beiden Löcher, um sie zu versiegeln mit dem hölzernen Ende einer sterilen Watteträger Spitze. </li><li> Naht die Kopfhaut. </li><li> Bewerben Blockade der verwundeten Bereich. </li><li> Entfernen Maus von stereotax und in erwärmt Käfig auf Heizblock für 45 min erholen. </li><li> Monitor für Anzeichen von Schmerzen einschließlich: verminderte Aktivität oder Ruhelosigkeit, verminderte Futter-und Wasseraufnahme oder erhöhte Lautäußerungen. Buprenorphin (0,05-0,2 mg / kg) kann zweimal täglich für eine Woche verabreicht werden, wenn notwendig, zur Schmerztherapie. Akzeptable Alternativen sind: Meperidin (20-60 mg / kg), Pentazocin (10 mg / kg), Nalbuphin (4-8 mg / kg). </li></ol> 3. Klimatisierte Platz Vorlieben: Acquisition, Extinction und Wiedereinsetzung <ol><li> Platz Mäuse in die zentrale Kammer eines Drei-Kammer Platzpräferenz Vorrichtung (Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA) für eine 60 sec Eingewöhnungszeit mit Guillotine Türen geschlossen. </li><li> Nach Gewöhnung, offene Türen und Guillotine erlauben Mäuse freien Erforschung aller 3 Kammern für 1.200 sec, mit der Zeit in jeder Kammer aufgezeichnet mit MedPC IV Software (Med Associates, Inc.) verbracht. </li><li> Weisen Mäuse Klimakammern auf ihre Leistung während der Pre-Test. Mit einem vorgespannten Design, Paar Medikamentengabe während der folgenden 3 Tagen mit dem Fach, das am wenigsten bevorzugte während der Baseline-Vortest war. </li><li> In den nächsten 3 Tagen Klimaanlage, injizieren Mäusen mit Kokain (10 mg / kg; ip) am Vormittag und beschränken sie auf ihren zugewiesenen Kammer für 1.200 sec unmittelbar nach der Injektion. Zurück Mäuse ihre Käfige nach der Sitzung. Nach 4 Stunden, injizieren Mäuse mit Kochsalzlösung (0,01 ml / gKörpergewicht) und beschränken sie auf die gegenüberliegende Kammer für die 1.200 Sek. Nachmittagssitzung. </li><li> Um für den Erwerb zu testen, geschlossen Ort Mäuse in der zentralen Kammer mit Guillotine Türen für einen 60 sec Eingewöhnungszeit. Offene Türen und Guillotine ermöglichen die freie Exploration 1.200 sec, mit der Zeit in allen Kammern durch MedPC IV Software (Med Associates, Inc.) aufgezeichnet verbracht. Berechnen Vorlieben, indem die Menge an Zeit in der Saline-gepaart Kammer von der Höhe der Zeit in der Kokain-gepaarten Kammer verbracht wird. </li><li> Um die Platzpräferenz löschen, setzen Mäuse auf zwei 20 min Sitzungen des freien Exploration täglich in der gleichen Apparatur, um mindestens 2 Stunden getrennt, beginnend 24 Stunden nach der Prüfung für den Erwerb. Zeit in allen Kammern verbracht sollten wieder aufgenommen werden, und die Größe des anfänglichen CPP sollte, dass jedes Aussterben Sitzung verglichen werden. </li><li> Bestimmen Sie, ob Mäuse haben die Arzneimittel-induzierte Bevorzugung durch die Beurteilung, ob Präferenz für ein par erloschendere Kammer über zwei aufeinanderfolgende Tage Aussterben ist deutlich niedriger im Vergleich zum Erwerb Vorlieben der Gäste. </li><li> Wiedereinsetzung der Mäuse mit einer Anfangsdosis von Kokain (5 oder 10 mg / kg; ip) und an das Gerät eine freie Exploration erneut aussetzen und notieren Sie die Zeit in jedem Abteil verbracht. </li><li> Verwalten Euthasol Euthanasie-Lösung (150 mg / kg). Transkardial perfundieren Mäuse mit 4% Paraformaldehyd (PFA) und führen Sie eine histologische Untersuchung, um die korrekte Platzierung Mikroinjektion validieren. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Regional-und zeitlich-spezifische Gen-Ablation über stereotaktischen Mikroinjektion von viralen Vektoren mit CPP kombiniert das Aussterben und Wiedereinstellung Phasen beinhaltet ermöglicht die Untersuchung der spezifischen Beiträge von Genen zu drei verschiedene Phasen der Sucht-Verhalten. Während konditionellen Knockout, die erreicht werden, indem die traditionelle Cre-loxP-System sorgt für räumlich-zeitlich beschränkt Genablation, stereotaxically Mikroinjizieren Cre-Rekombinase in diskrete Hirnareale von floxed Mäuse...

Kokain ist eine stark verstärkende Psychostimulanzien. Nach wiederholter Exposition auftreten mehreren molekularen und zellulären Anpassungen in Lohn-relevante Schaltkreise im Gehirn, die glaubten, in zwanghaften führen, sind Drogen-sucht Verhalten, woraufhin hohen Rückfall, die eine schwerwiegende klinische Problem 1 darstellen. Kokain übt diese langanhaltende Auswirkungen auf das Verhalten von der Regulation der Genexpression. Um die Anpassungen, die an chronischer Kokainkonsum entstehen studieren, haben präklinischen Tiermodellen wurde intensiv genutzt. Ein solches Modell ist das konditionierte Platzpräferenz (CPP) Paradigma. Dieses Modell beinhaltet die Entwicklung eines gelernt Assoziation zwischen einer zuvor neutralen Umgebung und der lohnenden Eigenschaften von Kokain. Nach mehreren Paarungen von Kokain mit einer bestimmten Kammer werden Tiere frei erkunden die Kokain-gepaarten und nicht-Kokain-gepaarten Umgebungen und wenn sie die Droge-gepaarten Fach lieber, man sagt, sie erwarb eine Kokain-induzierte Plac habene Vorlieben. Darüber hinaus ist nach einer vom Aussterben Einarbeitungszeit kann dieses Paradigma verwendet, um kontext-spezifischen Wiedereinsetzung von Kokain-seeking Verhalten zu studieren. Im Vergleich zu anderen Verhaltensmodelle der süchtig-ähnliches Verhalten, wie psychomotorische Sensibilisierung, die verwendet werden, um langfristige Kokain-induzierte Verhaltens-und molekulare Plastizität 2,3 und Selbstverwaltung (SA) zu studieren ist, das gedacht wird, genauer nachahmen süchtig -ähnliches Verhalten beim Menschen gefunden wird, ist die CPP Paradigma ein einfaches Verfahren, um Kokain kontextuellen Lernen 4 studieren. CPP-Protokolle lassen sich bequem erweitert werden, um Auslöschung und Wiedereinstellung Phasen umfassen, ähnlich wie SA, die für die Untersuchung der Mechanismen, die Gier nach Drogen und Rückfall 5-7 und von denen angenommen wird, um Aspekte von dem, was geschieht in der menschlichen rekapitulieren Drogen-sucht Verhalten und Drogen erlauben - und Cue-induzierten Rückfall 8-10. Ein Mechanismus zugrunde liegt, dass dieKokain-induzierte Verhaltensänderungen Plastizität, die charakteristisch für jede der verschiedenen Phasen von CPP, einschließlich Erwerb, Löschung und Wiedereinstellung ist, ist die Aktivierung eindeutige Signaturen der Genexpression in verschiedenen Hirnregionen. Um direkt zu testen, welche Gene in Lohn-relevanten Hirnregionen vermitteln Verhaltensänderungen Kokain-induzierte, ist es sinnvoll, in der Lage sein, sie zu manipulieren selektiv in einem regional-spezifische Art und Weise. Eine Möglichkeit, dies zu erreichen ist, um rekombinante virale adenoassoziierten (rAAV)-Vektoren, die express Cre-Rekombinase mit stereotaktischen Chirurgie, in verschiedene Hirnareale von Mäusen, die Zielgene von LoxP Websites (floxed Mäuse) flankiert microinject. Dieses Verfahren ermöglicht eine sehr genaue zeitliche und regionale Kontrolle darüber, wann und wo Gene abgetragen werden, in beiden Teilen und nicht teilende Neuronen, ohne eine Immunantwort 11-13. Dieser Grad der Kontrolle stellt einen wichtigen Vorteil gegenüber herkömmlichen Cre-loxP Technologie der Zucht floxed Mäuse wit Mäusen, die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle eines endogenen Gen-Promotor, dadurch gekennzeichnet, daß der Zeitpunkt und die Verteilung der Gen-Deletion kann mehr genau reguliert werden. Außerdem umgeht viralen Vektor-vermittelte Gen-Knockout Potenzial für Entwicklungsstörungen kompensatorische Effekte, die auftreten, mit traditionellen Ko-Strategien können. Neben Kokain CPP, die hier beschrieben wird, Mikroinjektion von rAAV-Cre in das Gehirn von Mäusen floxed, um die Rolle von spezifischen Genen kann zu Verhaltensstörungen ubiquitär Paradigmen, die einzelnen Phasen, einschließlich Selbstverwaltung und psychomotorische Sensibilisierung beinhalten angewendet werden zu beurteilen. Zum Beispiel hat unser Labor die rAAV-Cre-Technologie verwendet, um die Rolle von Ca v 1.2 L-Typ-Ca 2 +-Kanäle in Kokain psychomotorische Sensibilisierung 14 studieren. Insbesondere wurde rAAV-Cre in den Nucleus accumbens (NAC) von Mäusen, die mit dem Gen Ca v 1.2 floxed, Mikroinjektion zu zeigen, dass Ca v </sub&gt; 1.2 Handeln in dieser Region vermittelt die Expression Phase der psychomotorischen Sensibilisierung 14,15. Doch die rAAV-Cre-Strategie kann nicht verwendet werden, wenn Mäuse mit einem floxed Gen von Interesse nicht vorhanden sind, wie es unsere Erfahrung bei der Beurteilung der Rolle der Ca v 1.3 L-Typ-Ca 2 +-Kanäle in psychomotorische Sensibilisierung. Daher stellt eine Einschränkung bei der Verwendung rAAV-Cre selbst wenn bedingte Mäusen nicht für ein bestimmtes Gen von Interesse vorhanden sind. Allerdings rAAVs dass express siRNA Knockdown auf Zielgene verwendet werden können, wie wir es getan, um die Rolle von Ca v 1.3 Kanäle 14,15 untersuchen haben. Mikroinjizieren rAAV-Cre in diskrete Hirnregionen floxed Mäusen und dann testen sie in der CPP Paradigma ermöglicht Untersuchung der spezifischen Gene, die die verschiedenen Phasen der süchtig-ähnliches Verhalten und wo sie tätig sind, zu vermitteln. Verwenden Sie dieses Paradigmas ist in unserem Verständnis geholfen, wie wiederholte Kokain Verwaltung im Wesentlichen die br entführtains Lohn-Schaltung verursacht maladaptive Veränderungen in der molekularen Signalwege und Genexpression, dass zu den süchtigen Zustand 1,16,17 führen.

<table><tbody><tr><td>Aktivitätskammern für konditionierte Ortspräferenzen</td><td>Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA</td><td>MED-CPP-MS</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktisches Ausrichtungssystem für Maus</td><td>David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA</td><td>Modell 900</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritzen</td><td>Hamilton Company, Reno, Nevada, USA</td><td>7634-01</td><td></td></tr><tr><td>rAAV2-Cre-GFP</td><td>Vektor BioLabs, Philadelphia, PA, USA</td><td>7016</td><td></td></tr><tr><td>rAAV2-GFP</td><td>Vektor BioLabs, Philadelphia, PA, USA</td><td>7004</td><td></td></tr></tbody></table>

stereotaktische mikroinjektion von viralen vektoren ausdrücken cre-rekombinase, um die rolle der zielgene in cocaine konditionierte platzpräferenz studieren

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Mikroinjizieren rekombinante virale adenoassoziierten (rAAV) Vektoren, die Cre-Rekombinase in verschiedene Maus Hirnregionen gezielt Knockout Gene von Interesse ermöglicht verbesserte zeitlich und regional-spezifische Kontrolle der Gen-Deletion, im Vergleich zu bestehenden Methoden. Während bedingte Löschung kann auch durch Kreuzen Mäusen erreicht werden, dass express Cre-Rekombinase unter der Kontrolle von spezifischen Gen-Promotoren mit Mäusen, die ein floxed Gen stereotaktischen Mikroinjektion zum Targeting von diskreten Hirnarealen bei Experimentator festgelegten Zeitpunkten von Interesse ermöglicht. Im Zusammenhang mit der Kokain klimatisierten Platzpräferenz und andere Kokain Verhaltensparadigmen wie Selbstverwaltung oder psychomotorische Sensibilisierung das kann Rücktritt, Aussterben und / oder Wiedereinstellung Phasen beinhalten, ist diese Technik besonders nützlich in der Erforschung der einzigartigen Beitrag der Zielgene zu diesen unterschiedlichen Phasen der Verhaltensmodelle von Kokain-induzierte Plastizität. InsbesondereDiese Technik ermöglicht die selektive Ablation von Zielgenen in diskreten Phasen des Verhaltens zu ihrem Beitrag zu dem Verhalten in der Zeit zu testen. Letztlich ermöglicht dieses Verständnis für eine gezieltere Therapie, die am besten in der Lage, die stärksten Risikofaktoren, die sich präsentieren in jeder Phase der Suchtverhalten anzusprechen sind.

CPP Nach Durchführung CPP auf mikroinjizierten Mäuse, sollte man sicherstellen, dass die Kohorte der Kontrolle injizierten (rAAV-GFP) Mäusen haben normalerweise Präferenz für die Droge-gepaart Kammer (1A, 1B) erworben. Mäuse werden als erworben Präferenz für eine bestimmte Kammer haben, wenn Kokain Vorlieben (Zeit in der Kokain-gepaarten Kammer minus Zeit in der Saline-Zweikammer aufgewendet) ist deutlich höher im Vergleich zum Ausgangswert Vorlieben der Gäste (Abbildun...

Dieser Artikel beschreibt, wie man virale Vektoren in Mäusegehirn microinject und dann in einem konditionierten Platzpräferenz Paradigma, das eine Akquisition, Aussterben und Wiedereinstellung Phase umfasst testen.

Stereotaktische Mikroinjektion von viralen Vektoren ausdrücken Cre-Rekombinase, um die Rolle der Zielgene in Cocaine konditionierte Platzpräferenz Studieren

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Zielgene während definierter Phasen des Conditioned-Place-Preference-Paradigmas gezielt zu ablätieren, um deren Beitrag zu diesem Verhalten im zeitlichen Verlauf zu überprüfen. Dies wird erreicht, indem zunächst stereotaktisch ein rekombinanter, an Adeno-assoziiertes Virus gebundener Vektor, der die Cre-Rekombinase exprimiert, injiziert wird. Anschließend werden die Mäuse in ihrem Heimkäfig 10 bis 14 Tage lang zur Erholung gehalten, um eine maximale C-Reaktivierung zu gewährleisten.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Mäuse im konditionierten Ortspräferenztest zu untersuchen, einschließlich der Phasen der Erwerbung, Extinktion und Wiederherstellung. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Durchführung einer histologischen Untersuchung der mikroinjizierten Mäuse, um die korrekte Platzierung der Mikroinjektion zu überprüfen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Veränderungen im Erwerbs-, Extinktions- und/oder Wiederherstellungsverhalten als Reaktion auf einen Gen-Knockout mittels des konditionierten Ortspräferenz-Verhaltenstests zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem CRE-Lock-P-Kreuzungssystem liegt darin, dass sie eine spezifischere zeitliche Steuerung und anatomische Genauigkeit der gezielten Gen-Ausschaltung ermöglicht und somit die Untersuchung des Genverlusts in jeder Phase des Verhaltens erlaubt. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur Behandlung suchtkrankhaften Verhaltens, da sie ein besseres Verständnis der genetischen Grundlagen ermöglicht, die dafür verantwortlich sein könnten, dass die Exposition gegenüber kontextuellen Reizen kokainbezogene Erinnerungen auslöst, welche Heißhunger und Rückfälle bei Süchtigen hervorrufen können. Um zu beginnen, stellen Sie einen Mauskäfig mit Einstreu auf eine Wärmeplatte, um diesen für die postoperative Erholung aufzuwärmen.Richten Sie einen Elektrorasierer zum Rasieren des Kopfes sowie Ethanol und Jod zur Sterilisation der Kopfhaut ein. Wischen Sie die Ohrstifte und den Maulhalter des Stereotaxiegeräts mit 70 %igem Ethanol ab, wobei eine Hamilton-Spritze mit einem Volumen von fünf Mikrolitern verwendet wird. Ziehen Sie fünf Mikroliter Vektorvirus in die Spritze auf und befestigen Sie diese in einem Spritzenhalter am Stereotaxiegerät.Platzieren Sie ein mikrowellenerhitztes Wärmekissen oder ein elektrisches Heizkissen nach der Injektion des Mauses mit einem intraperitonealen Gemisch aus Ketamin und Xylazin auf den Stereotaxieapparatur. Führen Sie gemäß dem Textprotokoll einen Schwanzkneiftest durch, um den Sedierungsgrad zu überprüfen. Rasieren Sie anschließend den Kopf zwischen den Ohren und den Augen und reinigen Sie die Fläche mit sterilen Wattestäbchen durch abwechselndes Waschen mit Ethanol und Jod.Bringen Sie dann die Maus auf die beheizte Unterlage auf dem Stereotaxiegerät null. Platzieren Sie den Zahnhalter und justieren Sie die Ohrstifte, setzen Sie die Zähne der Maus in den Zahnhalter ein und schrauben Sie die Schnauzenhalterung und die Ohrstifte fest. Falls ein Zappeln oder Bewegen der Schnurrhaare festgestellt wird.Verabreichen Sie eine Auffrischungsdosis des Ketamin-Xylazin-Cocktails. Danach befeuchten Sie die Augen, um ein Austrocknen zu verhindern. Öffnen Sie anschließend mit einem Skalpell den Kopfhautschnitt bis hinter die Ohren.Befestigen Sie Bulldog-Klammern an den Ecken der Kopfhaut, um die Haut vom Schädel abzulösen. Stellen Sie sicher, dass Bgma und Lambda leicht sichtbar sind. Achten Sie darauf, dass die Naht von Bgma nach Lambda ausgerichtet ist, und positionieren Sie den Kopf gegebenenfalls neu.Nachdem bestätigt wurde, dass die Stereotaxie-Einstellungen auf Null gesetzt sind, platzieren Sie die Nadelspitze am BMA. Messen Sie die dorsoventralen, mediolateralen und anteroposterioren Koordinaten sowohl für das BMA als auch für Lambda. Passen Sie dann den Kopf an, bis die ventralen Koordinaten von BMA und Lambda weniger als 0,02 Millimeter voneinander abweichen.Zentrieren Sie die Nadelspitze erneut auf bgma und bewegen Sie sich von diesem Punkt aus in anterioren-posterioren Richtung zu der gewünschten Koordinate. Bohren Sie anschließend ein Loch an der gewünschten Koordinate. Überprüfen Sie, ob die Nadel ungehindert durch den Schädel eindringen kann, und senken Sie dann die Nadel auf die gewünschte ventrale Koordinate ab.Nach Erreichen der Koordinate 0,015 Millimeter unterhalb dieser Position für etwa 10 Sekunden verweilen, um eine kleine Tasche für den viralen Vektor mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,1 Mikrolitern pro Minute zu bilden. Nach einer Wartezeit von drei Minuten, damit sich der virale Vektor ausbreiten kann, das gewünschte Volumen des viralen Vektors injizieren, die Nadelspitze um 0,015 Millimeter anheben und weitere zwei Minuten warten. Sobald die Injektionen abgeschlossen sind, Knochenwachs auftragen, um beide Löcher zu verschließen, und anschließend die Kopfhaut vernähen. Abschließend einen Nervenblock auf die verletzte Stelle anwenden.Entfernen Sie die Maus aus dem Stereotaxieapparat und stellen Sie sie für 45 Minuten bis eine Stunde zur Erholung in einen warmen Käfig auf einen Wärmeklotz. Lassen Sie die Maus mindestens 10 Tage lang erholen, um eine maximale Reaktivierung zu ermöglichen. Geben Sie dem Tier bei Bedarf nach der Erholung Wasser, weiches Futter und zweimal täglich Buprenorphin zur Schmerzlinderung. Stellen Sie die Mäuse für eine 62-minütige Gewöhnungsphase mit geschlossenen Schiebern in die zentrale Kammer einer dreikammerigen Ortspräferenz-Apparatur.Nach der Gewöhnung öffnen Sie die Türen der Guillotinetürme und lassen die Mäuse alle drei Kammern für 1200 Sekunden frei erkunden. Verwenden Sie die Med-PC-Software, um die Zeit, die die Tiere in jeder Kammer verbringen, anhand der Anweisungen aus dem Textprotokoll aufzuzeichnen. Weisen Sie die Mäuse den Konditionierungskammern anhand ihrer Leistung während des Vortests zu.In den nächsten drei Tagen injizieren Sie 10 Milligramm pro Kilogramm Kokain während einer Morgensitzung und bringen Sie die Tiere unmittelbar danach in ihrer zugewiesenen Kammer für 1200 Sekunden zusammen. Bringen Sie die Mäuse für vier Stunden in ihre Heimkäfige zurück, injizieren Sie anschließend physiologische Kochsalzlösung und sperren Sie die Mäuse unverzüglich in der gegenüberliegenden Kammer für 1200 Sekunden ein. Um den Erwerb zu testen, stellen Sie die Mäuse in die zentrale Kammer mit geschlossenen Schieber-Türen für eine 62 Sekunden dauernde Habituation. Öffnen Sie die Guillotinetüren und ermöglichen Sie eine freie Erkundung für 1200 Sekunden oder bis zur Aufzeichnung. Die in allen Kammern verbrachte Zeit wird zur Berechnung der Präferenz verwendet, indem die in der Salin-Kammer verbrachte Zeit von der in der Kokain-Kammer verbrachten Zeit subtrahiert wird. Nach Durchführung des CPP-Tests an mikroinjizierten Mäusen gilt, dass diese eine Präferenz für eine bestimmte Kammer entwickelt haben.Wenn die Kokainpräferenz, definiert als die im Kokain-Paar-Kammer verbrachte Zeit minus die im Saline-Paar-Kammer verbrachte Zeit, signifikant höher ist im Vergleich zum Basislinien-Präferenzwert. Falls injizierte Mäuse als Kollektivkontrolle keine Präferenz für die Kokain-Paar-Kammer zeigen oder eine Aversion zeigen, wird die Platzierung unverzüglich mittels Histologie überprüft, und jene Mäuse mit inkorrekter Platzierung werden aus der Studie ausgeschlossen. Wenn die Präferenz von der kontrollinjizierten Kohorte normal erworben wird, wird das Paradigma durch Beginn der Extinktion erweitert.Mäuse gelten als das drogeninduzierte Präferenzverhalten für eine bestimmte Kammer erloschen zu haben. Wenn die Kokainpräferenz über zwei aufeinanderfolgende Extinktionsstage signifikant niedriger ist im Vergleich zum Erwerbspräferenzwert zu diesem Zeitpunkt, kann eine Wiederherstellung mittels einer Drogengabe (Priming-Dosis) erfolgen. Wenn der Präferenzwert nach der Gabe der Priming-Dosis statistisch nicht von demjenigen während des Erwerbs zu unterscheiden ist, wird gesagt, dass diese Kohorte das drogeninduzierte Präferenzverhalten für die mit der Droge assoziierte Kammer mittels quantitativer PCR wiederhergestellt hat.Diese Abbildung zeigt, dass das Gen von Interesse tatsächlich in mikroinjizierten Mäusen ausgeschaltet wurde, nachdem RAAV Cree GFP in den Nucleus accumbens injiziert wurde, der die L-Typ-Calciumkanal-Isoform CAV 1.2 Flocks von RAAV aufweist. Bei mit Cree injizierte Gewebeproben zeigt sich eine signifikante Abnahme der Genexpression im Vergleich zu Mäusen, die mit A-A-V-G-F-P injiziert wurden, wie hier dargestellt. Die immunhistochemische Analyse des Nucleus accumbens auf GFP zeigt eine korrekte bilaterale Platzierung der mikroinjizierten RAAV Cree nach diesem Verfahren.Andere Techniken wie die quantitative Echtzeit-PCR und die Western-Blot-Analyse können durchgeführt werden, um Fragen bezüglich des Effekts einer Gen-Reduktion auf die Expressionslevel anderer Gene von Interesse zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie man Zielgene im Maushirn gezielt ablasiert, indem man stereotaktische mikroinjizierte virale Vektoren verwendet, um die Rolle dieser Gene bei der Akquisition, Extinktion und Wiederherstellung des konditionierten Ortspräferenz-Paradigmas selektiv zu testen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Behavior

Verhalten

Quelle: Chen, S., et al., Stereotaxische Chirurgie zur genetischen Manipulation in striatalen Zellen von Neugeborenen-Mausgehirnen. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt die stereotaktische Injektion eines viralen Vektors, der für Cre-Rekombinase und grünes Fluoreszenzprotein (GFP) kodiert, in das Striatum eines genetisch veränderten Maus-Welpen, um eine Genmanipulation zu erreichen, indem eine loxP-flankierte STOP-Kassette herausgeschnitten und das rote Fluoreszenzprotein oder RFP als Reporter...

Stereotaktische Mikroinjektion eines viralen Vektors zur Genmanipulation in einem Striatum eines Maus-Jungtiers

Quelle: Pereira, M. et. al., In vivo direkte Reprogrammierung von residenten Gliazellen in Interneuronen durch intrazerebrale Injektion viraler Vektoren. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die stereotaktische Injektion eines Adeno-assoziierten Virus in die Großhirnrinde einer transgenen Maus, um Cre-abhängige neuronale Reprogrammierung und fluoreszierende Reportergene in Gliazellen zu bringen.

Stereotaktische Injektion von viralen Vektoren für die Reprogrammierung von Gliazellen in einem Mausmodell

Quelle: Fricano-Kugler, C. J., et al. Design, Verpackung und Verabreichung von CRISPR-Retro- und Lentiviren mit hohem Titer durch stereotaktische Injektion. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die stereotaktische Virusinjektion zur präzisen neuronalen Geneditierung im Gehirn von Mäusen. Das Protokoll gewährleistet eine genaue Virusabgabe an den Gyrus dentatus und ermöglicht die Fluoreszenzmarkierung und den CRISPR-vermittelten Gen-Knockout, um neuronale Schaltkreise, Genfunktionen und...

Stereotaktische Virusinjektion zur gezielten neuronalen Geneditierung im Gehirn von Mäusen

MicroRNAs haben eine bedeutende Rolle in der Struktur des Gehirns und Funktion. Hier beschreiben wir eine Methode, um durchzusetzen Hippocampus miRNA-Überexpression mit stereotaktische Injektion eines gentechnisch miRNA-Expression lentivirus. Dieser Ansatz kann als eine relativ schnelle Weg zu der Beurteilung...

Stereotaktische Injektion von microRNA-exprimierenden Lentiviren der Maus Hippocampus CA1 Region und Beurteilung der Behavioral Outcome

Virale Vektoren können für gezielte Genmanipulation. Wir demonstrieren, ein Verfahren zur bedingten Genexpression oder Ablation im Rückenmark der Maus, stereotaktische Injektion unter Verwendung eines viralen Vektors in der dorsalen Horn, ein bekannter Ort der synaptischen Kontakt zwischen primären somatosensorischen Afferenzen und Neuronen des zentralen Nervensystems.

Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors für Conditional Gene Manipulation im Maus-Rückenmark

Stereotaktische Injektion von Lentiviren ausdrücken cDNAs oder shRNAs die Genexpression in spezifischen Hirnarealen von Mäusen zu modulieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur stereotaktischen Injektionen mit Verhaltensaufgaben, wie der Open Field Test (OFT) und Forced Swim Test (FST) zu kombinieren.

Anwenden Stereotaktische Injektionstechnik zu genetischen Auswirkungen auf die Tier Behaviors Studie

Nagetiere sind ein geeignetes Modell, um die molekularen Substrate von Verhalten und komplexen psychiatrischen Störungen zu untersuchen. Die Mikroinjektion des Gehirns bei wachen Nagetieren kann zur Aufklärung von Krankheitssubstraten verwendet werden. Es wird eine effiziente und anpassbare Mikroinjektionsmethode für das Gehirn sowie die Ausführung eines operanten Paradigmas vorgestellt, das die Motivation quantifiziert.

Nagetier Gehirn-Mikroinjektion, um molekulare Substrate motiviertes Verhalten Studieren

Optogenetische Ansätze sind weit verbreitet zu manipulieren neuronale Aktivität und bewerten die Auswirkungen auf die Gehirnfunktion verwendet. Hier wird eine Technik erläutert , dass bei in - vivo - Expression des optischen Aktivator Channelrhodopsin, ermöglicht eine ex vivo Analyse der synaptischen Eigenschaften bestimmter großer Reichweite und lokale neuronale Verbindungen in Angst bezogenen Schaltungen.

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Schaltkreise in Hirnschnitten

Der CRISPR / Cas9 System bietet das Potenzial, um gezielte Genom Bearbeitung zugänglich und erschwinglich für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Dieses Protokoll soll zeigen, wie Viren zu schaffen, die ein Gen von Interesse unter Verwendung des CRISPR / Cas9 System Knockout wird, und sie dann stereotaxically in die erwachsenen Maus Gehirn zu injizieren.

Planung, Verpackung und Lieferung von hohen Titern CRISPR Retro und Lentiviren über stereotaktische Injektion

Wir beschreiben ein Protokoll der stereotaktischen Operation mit einer hausgemachten Kopf fixiert Vorrichtung zur microinjecting Reagenzien in das Striatum von Neugeborenen mäusegehirnen. Diese Technik ermöglicht Genmanipulation in neuronalen Zellen bestimmter Regionen des Neugeborenen mäusegehirnen.

Stereotaktischen Chirurgie für Genmanipulation in Striatale Zellen des Neugeborenen Mäusegehirnen

Die hier beschriebenen Methoden skizzieren ein Verfahren, mit dem die Kokain-induzierte Plastizität in einem verhaltensrelevanten Schaltkreis bei Ratten optogenetisch umgekehrt wird. Eine anhaltende niederfrequente optische Stimulation der Thalamo-Amygdala-Synapsen induziert eine langfristige Depression (LTD). In vivo führte eine optogenetisch induzierte LTD bei Kokain-erfahrenen Ratten zu einer anschließenden Abschwächung der Cue-motivierten Drogensuche.

Verwendung von Optogenetik zur Umkehrung der Neuroplastizität und zur Hemmung der Kokainsuche bei Ratten

Lernen Sie die stereotaktische Mikroinjektion viraler Vektoren zur Untersuchung von Genfunktionen in der konditionierten Platzpräferenz bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht präzise Gen-Knockouts während Akquisition, Extinktion und Reinstanzierung.

Stereotaktische Mikroinjektion von viralen Vektoren ausdrücken Cre-Rekombinase, um die Rolle der Zielgene in Cocaine konditionierte Platzpräferenz Studieren (Video) | JoVE Journal

Stereotaktische Mikroinjektion von viralen Vektoren ausdrücken Cre-Rekombinase, um die Rolle der Zielgene in Cocaine konditionierte Platzpräferenz Studieren

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