Stereotaktische Mikroinjektion von viralen Vektoren ausdrücken Cre-Rekombinase, um die Rolle der Zielgene in Cocaine konditionierte Platzpräferenz Studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Zielgene während diskreter Phasen des Paradigmas der Ortspräferenz selektiv abzutragen, um ihren Beitrag zu diesem Verhalten im Laufe der Zeit zu testen. Dies wird durch erste stereotaktische Mikroinjektion des rekombinanten Eno-assoziierten viralen Vektors, der die Cree-Rekombinase exprimiert, erreicht. Anschließend dürfen sich die Mäuse 10 bis 14 Tage lang in ihrem Heimkäfig erholen, um eine maximale C-Reaktivierung zu gewährleisten.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Mäuse in der konditionierten Ortspräferenz zu testen, einschließlich der Akquisitions-, Extinktions- und Wiedereinsetzungsphase. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, eine histologische Untersuchung von mikroinjizierten Mäusen durchzuführen, um die korrekte Platzierung der Mikroinjektion zu bestätigen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Veränderungen im Erwerbs-, Extinktions- und/oder Wiederherstellungsverhalten als Reaktion auf Gen-Knockout durch Verhaltenstests zur Präferenz von Bedingungen zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem CRE-Lock-P-Paarungssystem besteht darin, dass sie ein spezifischeres Timing und eine diskretere anatomische Spezifität des Gen-Knockouts ermöglicht, was die Untersuchung des Genverlusts in jeder Phase des Verhaltens ermöglicht. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Behandlung von Suchtverhalten, da sie ein besseres Verständnis der genetischen Basis beinhaltet, die möglicherweise zugrunde liegt, wie die Exposition gegenüber kontextuellen Hinweisen kokainbezogene Erinnerungen auslösen kann, die bei Süchtigen zu Verlangen und Rückfällen führen können. Platzieren Sie zunächst einen Mäusekäfig mit Einstreu auf einer Heißschleuse, um ihn für die postoperative Genesung zu erwärmen.

Stellen Sie einen Elektrorasierer auf, um den Kopf zu rasieren, und Ethanol und Jod, um die Kopfhaut zu sterilisieren. Verwenden Sie 70% Ethanol, um die Ohrstangen und den Mundhalt der Stereo-Attacken mit einer Fünf-Mikroliter-Hamilton-Spritze abzuwischen. Ziehen Sie fünf Mikroliter viralen Vektor auf und setzen Sie ihn in einen Spritzenhalter Auf die Stereoangriffe.

Legen Sie ein Mikrowellen-Heizkissen oder ein elektrisches Pad auf die Stereoangriffe, nachdem Sie der Maus eine IP-Injektion eines Ketamin-Xylazin-Cocktails injiziert haben. Führen Sie gemäß dem Textprotokoll eine Schwanzkneifung durch, um den Grad der Sedierung zu überprüfen. Rasieren Sie anschließend den Kopf zwischen den Ohren und Augen und reinigen Sie den Bereich mit sterilen Baumwollapplikatoren abwechselnd mit Ethanol und Jod.

Übertragen Sie dann die Maus auf das beheizte Pad auf dem Stereo-Attack Zero. Die Zahnstange und der Ohrbügel skalieren und setzen die Zähne der Maus in die Zahnstange, schrauben die Mündung und die Ohrbügel ein. Wenn ein Wackeln oder eine Whisker-Bewegung festgestellt wird.

Verabreichen Sie eine Auffrischungsdosis Ketamin-Xylazin-Cocktail. Schmieren Sie dann die Augen ein, um ein Austrocknen zu verhindern. Öffnen Sie anschließend mit einem Skalpellschnitt die Kopfhaut bis knapp hinter die Ohren.

Platzieren Sie Bulldoggenklammern an den Ecken der Kopfhaut, um die Haut vom Schädel zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass Bgma und Lambda gut sichtbar sind. Stellen Sie sicher, dass die Naht von bgma zu Lambda ausgerichtet ist, und positionieren Sie den Kopf bei Bedarf neu.

Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Stereo-Attack-Einstellungen auf Null gesetzt sind, setzen Sie die Nadelspitze bei bma ein. Messen Sie die dorsalen, ventralen, medialen, lateralen und anterioren posterioren Koordinaten sowohl für BMA als auch für Lambda. Stellen Sie dann den Kopf so ein, dass die ventralen Koordinaten für BMA und Lambda innerhalb von 0,02 Millimetern voneinander liegen.

Zentrieren Sie die Nadelspitze wieder auf bgma und bewegen Sie sich von dort aus in anterior-posteriorer Richtung bis zur gewünschten Koordinate. Bohren Sie anschließend ein Bohrloch an der gewünschten Koordinate. Prüfen Sie, ob die Nadel in der Lage ist, ohne Unterbrechung durch den Schädel einzudringen, und senken Sie die Nadel dann auf die gewünschte Bauchkoordinate ab.

Sobald die Koordinate erreicht ist, tauchen Sie etwa 10 Sekunden lang 0,015 Millimeter darunter ab, um eine kleine Tasche für den viralen Vektor mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,1 Mikrolitern pro Minute zu schaffen, injizieren Sie das gewünschte Volumen des viralen Vektors, nachdem Sie drei Minuten gewartet haben, bis der virale Vektor diffundiert ist, heben Sie die Nadelspitze um 0,015 Millimeter an und warten Sie weitere zwei Minuten. Wenn die Injektionen abgeschlossen sind, tragen Sie Knochenwachs auf, um beide Löcher zu verschließen, und nähen Sie dann die Kopfhaut. Tragen Sie abschließend eine Nervenblockade auf die verletzte Stelle auf.

Entferne die Maus aus den Stereo-Attacken und lege sie in einen warmen Käfig auf einem Heizblock, um sich 45 Minuten bis eine Stunde lang zu erholen. Lassen Sie die Maus mindestens 10 Tage lang wiederherstellen, um eine maximale Reaktivierung zu ermöglichen. Geben Sie dem Tier zweimal täglich Wasser und weiches Futter und Buprenorphin, falls dies bei Schmerzen nach der Genesung erforderlich ist, und setzen Sie die Mäuse für eine 62. Gewöhnungsperiode bei geschlossenen Guillotinetüren in die zentrale Kammer eines Dreikammer-Platzpräferenzgeräts.

Nach der Gewöhnung öffnen Sie die Guillotine-Türen und lassen die Mäuse alle drei Kammern 1200 Sekunden lang frei erkunden. Verwenden Sie die Software Med PC four, um die Zeit, die das Tier in jeder Kammer verbracht hat, anhand von Richtlinien aus dem Textprotokoll aufzuzeichnen. Ordnen Sie die Mäuse basierend auf ihrer Leistung während des Vortests den Konditionierungskammern zu.

Injizieren Sie in den nächsten drei Tagen 10 Milligramm pro Kilogramm Kokain während einer morgendlichen Sitzung und kombinieren Sie sie sofort 1200 Sekunden lang in der ihnen zugewiesenen Kammer. Bringen Sie die Mäuse für vier Stunden in ihre Heimatkäfige zurück, injizieren Sie ihnen dann Kochsalzlösung und sperren Sie die Mäuse sofort für 1200 Sekunden in die gegenüberliegende Kammer. Um den Erwerb zu testen, legen Sie die Mäuse für eine 62. Gewöhnungsperiode mit geschlossenen Guillotine-Türen in die zentrale Kammer.

Öffnen Sie die Guillotine-Türen und ermöglichen Sie eine freie Erkundung für 1200 Sekunden oder Aufnahme. Die in allen Kammern verbrachte Zeit berechnet die Präferenz, indem die in der Kochsalzlösungs-Paarkammer verbrachte Zeit von der in der Kokain-Paarkammer verbrachten Zeit subtrahiert wird. Nach der Durchführung von CPP an mikroinjizierten Mäusen wird davon ausgegangen, dass sie eine Präferenz für eine bestimmte Kammer erworben haben.

Wenn die Kokainpräferenz definiert ist als die Zeit, die in der Kokainpaarkammer verbracht wird, abzüglich der Zeit, die in der Kochsalzlösungspaarkammer verbracht wird, ist sie signifikant höher als der Ausgangspräferenzwert. Wenn als Kohortenkontrolle injizierte Mäuse keine Präferenz für die Kokainpaarkammer zeigen oder zeigen, wird eine Aversionsplatzierung sofort histologisch verifiziert, und die Mäuse mit falscher Platzierung werden aus der Studie ausgeschlossen. Wenn die Präferenz normalerweise von der injizierten Kontrollkohorte erworben wird, wird das Paradigma durch den Beginn der Extinktion erweitert.

Es wird davon ausgegangen, dass Mäuse die medikamenteninduzierte Präferenz für eine bestimmte Kammer ausgelöscht haben. Wenn die Kokainpräferenz an zwei aufeinanderfolgenden Aussterbetagen im Vergleich zum Erwerbspräferenzwert zu diesem Zeitpunkt signifikant niedriger ist, kann man die Kokainpräferenz mit einer Drogenprimzahl wieder aufnehmen. Wenn der Präferenzwert nach Verabreichung des Wirkstoffprimes statistisch nicht von dem bei der Akquisition unterscheidbar ist, dann wird gesagt, dass diese Kohorte die arzneimittelinduzierte Präferenz für die gepaarte Kammer des Arzneimittels mittels quantitativer PCR wiederhergestellt hat.

Diese Abbildung zeigt, dass das interessierende Gen in mikroinjizierten Mäusen nach Mikroinjektion von RAAV Cree GFP in den Nucleus accumbens mit der Calciumkanal-Isoform des L-Typs, CAV 1.2-Herden von RAAV, tatsächlich ausgeschaltet wurde. Cree-injizierte Stanzen zeigen eine signifikante Abnahme der Genexpression im Vergleich zu Mäusen, denen A-A-V-G-F-P injiziert wurde. Die immunhistochemische Analyse des Nucleus accumbens auf GFP zeigt die korrekte bilaterale Platzierung von mikroinjiziertem RAAV Cree Nach diesem Verfahren.

Andere Techniken wie quantitative real-time PCR und Western Bodying können durchgeführt werden, um Fragen bezüglich der Wirkung des Knockdowns eines Gens auf die Expressionsniveaus anderer Gene von Interesse zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie Zielgene im Gehirn von Mäusen mithilfe von stereotaktischen Mikroinjektions-Virusvektoren selektiv abgetragen werden können, um die Rolle dieser Gene bei der Akquisitionsextinktion und Wiederherstellung des Paradigmas der Präferenz für den Zustand selektiv zu testen.