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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Das ELISA-Verfahren

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JoVE Science Education Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

The ELISA Method

2.7: Bacterial Transformation: Electroporation

2.9: Plasmid Purification

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10:06 min

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April 30, 2023

Overview

Ein Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) wird normalerweise gemacht um die Anwesenheit und die Menge eines Zielproteins in einer experimentellen Probe nachzuweisen. Der Nachweis des Zielproteins passiert durch Antikörper, was den ELISA zu einen Immunverfahren macht. Durch eine Reihe von Inkubations- und Waschschritten erkennen die Antikörper, die oft an ein Enzym gekoppelt sind, ein Protein das an der Oberfläche einer Mikrowellplatte ist. Wenn es mit einem Substrat in Berührung kommt, bewirken die antikörpergebundenen Enzyme einen Farbwechsel, wodurch die Anwesenheit des Proteins angezeigt wird.

In diesem Video wird die Theorie hinter einem ELISA erklärt, einschließlich von primären und sekundären Antikörpern und der erforderlichen Blockierschritte. Danach folgen praktische Anwendungen mit Schritt-für-Schritt Anleitungen. Dann führen wir Variationen des ELISA Verfahrens ein, wie zum Beispiel den “Sandwich-ELISA” oder den kompetitiven ELISA. Außerdem erläutern wir Anwendungen des ELISAs, wie zum Beispiel freiverkäufliche Schwangerschaftstests.

Procedure

Das ELISA Verfahren, oder der Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ist eine häufig verwendete Methode, um zu bestimmen ob ein bestimmtes Protein vorhanden ist oder nicht.

Mit einer Reihe von Wasch- und Bindungsschritten erkennt ein Antikörper, der an ein Enzym gekoppelt ist, ein Zielprotein auf der Oberfläche einer 96-Well Platte. Wenn das Substrat zu der Probe hinzugegeben wird, tritt eine enzymatische Reaktion auf, die eine Farbänderung bewirkt mit der man das Zielprotein identifizieren und quantifizieren kann.

Bevor wir darüber sprechen wie genau man einen ELISA macht, schauen wir uns erst die Geräte und Reagenzien an, die wir brauchen.

Eine ELISA Reaktion findet typischerweise auf der Oberfläche einer flachen 96-Well Platte statt. Die flachen Wells begünstigen sowohl die optimale Verteilung der experimentellen Probe als auch die Erfassung und Detektion der Antikörper.

ELISAs können nachweisen ob bestimmte Zielproteine in wasserlöslichen Proben vorhanden sind. Häufige experimentelle Proben sind zum Beispiel Urin, Zellkulturmedium oder Blutserum.

In einem ELISA wird der Antikörper, der direkt an das Zielprotein bindet, als Primärantikörper bezeichnet. Dieser Antikörper besitzt eine hohe Affinität, das heißt dass er eng an das Epitop, also eine spezifische Region des Zielproteins, binden kann. Der primäre Antikörper ist normalerweise nicht gekennzeichnet (also nicht konjugiert).

Wie schon erwähnt binden Antikörper ihre Zielproteine meistens durch eine hohe Affinität zu einem bestimmten Epitop. Es kann jedoch möglich sein, dass die experimentelle Probe spezifische Teile von Zellen enthält, die nicht-spezifische Bindungsstellen des Antikörpers beinhalten, oder Stellen die an die konstante, also nicht Epitop-spezifische, Region des Antikörpers binden.

Daher ist es wichtig, dass man einen Blockierpuffer verwendet, der die nicht-spezifischen Bindungssplätze in der experimentellen Probe bedeckt. Sonst kann es sein das man eine enzymatische Reaktion in Wells, die nicht das Zielprotein enthalten, auslöst und dadurch falsch-positive Daten erhält.

Der Sekundärantikörper in dem ELISA Verfahren ist der Antikörper, der den Primärantikörper erkennt. Dieser Antikörper ist normalerweise an das Enzym gekoppelt. Manchmal haben die Sekundärantikörper komische Namen. Wenn zum Beispiel der Sekundärantikörper in einem Esel hergestellt wurde und einen Primärantikörper erkennt, der in einer Ziege hergestellt wurde, nennt man diesen Antikörper Esel-anti-Ziege Antikörper. Bei Sekundärantikörpern bezieht sich der erste Name auf den Organismus, in welchem der Sekundärantikörper produziert wurde, und der zweite Name auf den Organismus, in welchem der Primärantikörper hergestellt wurde.

Das Substrat, welches das aktive Zentrum des Enzyms bindet, das wiederum mit dem Sekundärantikörper konjugiert ist, wird auch noch benötigt. Die chemische Reaktion führt zu einer Farbänderung in einem anderweitig farblosen Substrat. Dieses kolometrische Verfahren erlaubt es die Anwesenheit von Zielproteinen nachzuweisen und diese zu quantifizieren.

Die enzymatische Reaktion wird auch dann fortgesetzt, wenn kein Substrat mehr vorhanden ist. Deshalb sollte man nach einer kurzen Inkubationsdauer die Stopp-Lösung hinzufügen, die wiederum eine erneute Farbänderung bewirkt und anzeigt, dass die Reaktion wirklich angehalten wurde.

Eine Mikroplattenlesegerät wird nun benutzt um die Konzentration des Zielproteins durch das Lesen der Absorbanz, das heißt der Menge des gefärbten Endprodukts, in jedem Well zu bestimmten. Die Absorbanz ist proportional zu der Menge an vorhandenem Zielprotein.

Nun das wir alle unsere Geräte haben, sind wir bereit den ELISA anzusetzen.

Um einen Standard-ELISA (oder direktes ELISA) zu machen, muss man zuerst die 96-Well Platte mit dem Zielprotein in Deckpuffer aufgelöst bedecken. Hier sollte man auch an die Positiv-und Negativkontrollen denken!

Nachdem man den Antikörper lange genug aufgetragen hat damit er komplett aufgenommen wird und sich festsetzt, kippt man die überschüssige Lösung mit einer schnellen Handbewegung weg.

Dann blockiert man die nicht-spezifischen Bindungen oder das Hintergrundsignal, durch die Zugabe von Blockierpuffer in jeden Well.

Nun kippt man den Blockierpuffer weg und wäscht die Wells kurz mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und 1% BSA bei Zimmertemperatur.

Während man die Wells mit PBS ausspült, bereitet man die Verdünnungen einer bekannten Konzentration von Zielprotein vor um eine Standardkurve zu generieren. Die Absorbanz der Wells der Standardkurve, die bekannte Konzentrationen des Zielproteins enthalten, werden verwendet um die Konzentration des Zielproteins in der experimentellen Probe zu berechnen. Diese Berechnung basiert auf einem Vergleich der Absorbanz der Wells mit der Probe mit der Absorbanz der Wells mit der Standardkurve.

Nun gibt man den Primärantikörper hinzu!

Dann wird die Platte inkubiert (normalerweise bei Zimmertemperatur) damit genügend Zeit zur Verfügung steht das der Antikörper das Zielprotein binden kann, um ihn dann später nachweisen und quantifizieren zu können.

Nach dieser Inkubation wird der überschüssige Antikörper weggespült und die Wells werden kurz mit PBS gewaschen.

Der Sekundärantikörper wird dann auf die Platte aufgetragen und nun erneut inkubiert, normalerweise auf einer rotierenden Fläche – damit der Sekundärantikörper binden kann. Die Waschschritte werden dann wie zuvor wiederholt.

Danach gibt man das Substrat zu der Platte, um zu sehen welche Wells das Zielprotein enthalten. Die Platte sollte abgedeckt werden um sie vor Licht zu beschützen. Nach einer kurzen Inkubationszeit muss die Reaktion gestoppt werden.

Schließlich muss man die Platte in einen Mikroplattenleser schieben, der die Absorbanz – also die Menge an farbiger Lösung – in jedem Well misst. Man muss auswählen welche Wells der Leser analysieren soll. Wenn das Instrument die Platte fertig gelesen hat, wird die Absorbanz in jedem Well angezeigt.

Es ist wichtig zu wissen, dass jedes ELISA-kit eine Detektionsgrenze hat. Das heißt Proteinkonzentrationen können nur über oder unter einem bestimmten Wert bestimmt werden. Sehr geringe Proteinkonzentrationen sind normalerweise sehr nah an der Hintergrundabsorbanz, während sehr hohe Proteinkonzentrationen bedeuten können das überschüssige Antikörper oder Proteine nicht richtig weggewaschen wurden.

Weshalb will man einen ELISA eigentlich machen? Hier schauen wir uns einige häufige Anwendungen an.

Die häufigste Form des ELISA’s ist der “Sandwich”-ELISA.

In einem Sandwich-ELISA wird eine 96-Well-Platte zuerst mit einem Primärantikörper, der das Zielprotein erkennt, benetzt.

Nachdem man die überschüssige Probe weggewaschen hat, gibt man einen Sekundärantikörper hinzu, der an ein Enzym gekoppelt ist. Danach folgt das farbige Substrat.

Die Absorbanz wird dann ganz normal wie in einem normalen ELISA gemessen. In diesem Experiment zum Beispiel werden die ELISA Daten verwendet, um zu bestimmen welche Zelllinien einen Antikörper mit der höchsten Affinität – also der besten Bindung – für das Antigen bindet.

Die freiverkäuflichen Schwangerschaftstests basieren auf dem Sandwich-ELISA Verfahren.

Wenn der Urin einer potentiell schwangeren Frau zu dem Test hinzugegeben wird, reagieren enzymgekoppelte Primärantikörper, die auf dem Test angebracht sind, auf das Schwangerschaftshormon hCG, wenn es anwesend ist. Wenn die Frau schwanger ist findet die Reaktion zwischen dem Substrat und dem Enzym statt wenn die Primärantikörper durch substratgebundene Sekundärantikörper erkannt werden, und eine farbige Linie erscheint.

Eine andere Art von ELISA ist ein kompetitiver ELISA, der die Anwesenheit von Antikörpern bestimmen kann.

Wenn die Antikörper, die man untersuchen will, in einer Probe vorhanden sind, binden sie sich an das Zielprotein an der 96-Well Oberfläche. Nachdem die Enzym-gebundenen Detektionsantikörper zu der Platte hinzugegeben werden, finden diese wenige oder keine freie Proteine an die sie sich binden können, da sie “verloren” haben gegen die Antikörper die wir in der Probe nachweisen wollten.

In einem kompetitiven ELISA sind die gefärbten Wells die Proben die keinen Antikörper enthalten! Blutplasmaproben von Patienten werden typischerweise mit einem kompetitiven ELISA analysiert um bestimmte Pathogene nachzuweisen, wir zum Beispiel den HI-Virus.

Das war die Einführing in das ELISA Verfahren von JoVE. In diesem Video haben wir behandelt was ein ELISA ist und wie er funktioniert, welche Geräte und Reagenzien man braucht, und welchen Anwendungen dieses Verfahren hat. Danke für eure Aufmerksamkeit und lasst eure Substrate nicht überentwickeln.

Transcript

The ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, is a widely used method for determining the presence or absence of a specific target protein.

Via a series of washing and binding steps, an antibody conjugated, or linked, to an enzyme will recognize a target protein at the bottom of a 96-well plate. When substrate is added to the sample, an enzymatic reaction will occur, causing a color change that allows the identification and quantification of the target protein.

Before we discuss how to perform an ELISA, let’s get familiar with the equipment and reagents that you will need.

The setting for an ELISA reaction is typically a 96-well flat bottom plate. The flat bottoms of the wells will help facilitate an even distribution of your experimental sample, as well as your capture and detection antibodies.

ELISAs detect the presence of specific target proteins in experimental aqueous solutions. Urine, cell culture media, and serum are common experimental samples.

In an ELISA, the antibody that directly binds to the target protein is the primary antibody. It has high affinity, that is, a high ability to bind tightly, for an epitope – a specific region – of the target protein. The primary antibody is usually unlabeled, or un-conjugated.

As mentioned, antibodies mostly bind to their target proteins through high affinity binding to a specific epitope. However, the experimental sample may contain pieces of cells that express nonspecific binding sites, sites that can bind the constant, or non-epitope specific, region of your detector antibodies.

Therefore, addition of a blocking buffer is essential in an ELISA to cover any nonspecific binding sites in your experimental samples. Otherwise you may have enzymatic reactions occurring in wells that do not contain target protein, giving you false positive data!

The secondary antibody in an ELISA is the antibody used to recognize the primary antibody. This antibody is usually conjugated to an enzyme. Sometimes the secondary antibody has a funky name. For example, if the secondary antibody made, or raised, in a donkey to recognize a primary antibody raised in a goat, the secondary antibody would be called a donkey anti-goat antibody. When it comes to naming secondary antibodies, the first name indicates the organism that produced the secondary antibody, and the second name represents the organism that produces the primary antibody.

A substrate, which binds to the active site of the enzyme linked to the secondary antibody, will also be needed. The chemical reaction that occurs during this reaction causes a color change in the otherwise-colorless substrate. This so-called colorimetric assay allows the identification and quantification of the presence of the target protein.

The enzymatic reaction will continue as long as there is available substrate. Therefore, after a brief incubation period, a stop solution, which causes yet another color change to indicate the reaction has in fact been halted, is added to the wells.

A microplate reader will be used to quantify the concentration of the protein of interest in each well by reading the absorbance, that is, the amount of colored product, in each well. The absorbance is proportional to the amount of target protein present.

Now that you have all your equipment ready, let’s run an ELISA!

To perform a standard, or direct, ELISA, first coat the wells of the 96-well plate with your target protein of interest diluted in coating buffer. Plate your positive and negative controls at this time as well.

After incubating the coated plate long enough to give the protein time to completely adsorb, or attach, to the bottom of the plate, dump off the excess coating solution with a quick flick of your wrist.

Then block any possible non-specific binding or background signal by incubating each well in blocking buffer.

Now dump off the blocking buffer and wash the wells with a brief room temperature incubation in phosphate buffered saline, or PBS, and 1% BSA.

While the wells are being rinsed with PBS, prepare dilutions of a known concentration of the target protein to create a standard curve. The absorbance of the standard curve wells, which contain known concentrations of the target protein, will be used to calculate the concentration of target protein in your experimental sample wells based on a comparison of the absorbance of the sample wells to the absorbance of the standard curve wells.

Now it’s time to add the detection or primary antibody!

The plate is then incubated, usually at room temperature, to allow a sufficient amount of antibody to bind to the target protein for later detection and quantification of the protein.

After this incubation, excess antibody is removed and the wells are briefly washed with PBS.

Secondary antibody is then added to the plate, and the plate is once again incubated – typically on a rotating platform – to allow secondary antibody to bind. Washing steps are repeated as before.

Next, add the substrate to the plate to see which wells contain your target protein. Cover the plate to protect the reaction from light, and then after a brief incubation, halt the reaction with stop solution.

Finally, place your plate in the microplate reader to measure the absorbance or amount of colored solution, in each well. You will need to select which wells you want the reader to analyze. When the instrument is finished reading the plate, a readout of the absorbance for each well will be displayed.

It is important to note that each ELISA kit has a detection limit. That is, only protein concentrations above and below specific limits can be accurately determined. Very small concentrations of protein are usually too close to the background levels of non-specific staining, while very high concentrations may indicate that excess protein or antibody was not properly washed away in that sample well.

So why might you perform an ELISA? Let’s take a look at a few common applications.

Probably the most common type of ELISA performed is the sandwich ELISA.

In a sandwich ELISA, a 96-well plate is coated first with a primary antibody that recognizes the target protein of interest.

In this experiment, cell culture media harvested from human antibody-producing cell lines, were plated by an automated system onto 96-well plates pre-coated with a primary antibody that recognizes human antibodies.

After washing away the excess sample with PBS, an enzyme-linked secondary antibody is added, followed by a colorimetric substrate.

The absorbance is then measured in the same way as for a typical ELISA. For example, in this experiment, this ELISA data will be used to determine which cell lines produce the human antibody with the highest affinity for – that is best ability to bind accurately to – its target antigen.

The over-the-counter pregnancy test is one type of sandwich ELISA.

When the potentially pregnant woman’s urine is added to the test, enzyme-linked primary antibodies attached to the test will bind the pregnancy hormone hCG if it is present. If the woman is pregnant, a substrate-enyzme reaction will occur when the primary antibodies are recognized by substrate-bound secondary antibodies at the test site, and a colored line will appear.

Another type of ELISA is the competitive ELISA, which can be used to detect the presence of antibodies.

If the antibodies of interest are present in the sample, they will bind to the target protein attached to the bottom of the plate. Later, when enzyme-linked detection antibodies are added to the plate, the enzyme-linked antibodies will find few to no proteins to bind; they will have been “out-competed” by the antibodies of interest in the experimental sample.

In a competitive ELISA, then, the colored wells indicate the samples that actually do not contain the antibody of interest! Patient plasma samples are typically run in a competitive ELISA in order to determine if antibodies for certain pathogens, like the HIV virus, are present in the sample.

You’ve just watched JoVE introduction to performing an ELISA. In this video we reviewed: what an ELISA is and how it works; what equipment and reagents you will need to perform and ELISA; and some different applications of the assay. Thanks for watching, and remember not to let your substrate overdevelop!