Isolierung von humanen Hepatozyten durch eine Zwei-Schritt-Verfahren Collagenase Perfusion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, menschliche Hepatozyten mit Hilfe eines zweistufigen Kollagenase-Perfusionsverfahrens zu isolieren. Dazu werden zunächst die Blutgefäße in einem Stück Leber mit einer Spülkanüle kanüliert. Es folgt die Durchblutung und Verdauung des Leberstücks mittels Kollagenase.

Der dritte Schritt ist die Entfernung der glitzernden Kapsel, wodurch die dissoziierten Leberzellen freigesetzt werden. Der letzte Schritt ist eine Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit, bei der Hepatozyten isoliert werden. Letztendlich können Hepatozyten mit Phasenkontrastmikroskopie oder durch Albuminfärbung unter Verwendung der Immun-Zyto-Chemie identifiziert werden, wobei die Lebensfähigkeit und Ausbeute von Hepatozyten unter Verwendung eines Triam-Blue-Ausschlussassays bestimmt wird.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Kanülierungs- und Verdauungsschritte schwer zu erlernen sind. Dies liegt daran, dass die Kanülierung eine gewisse Finesse erfordert und der Abschluss der Verdauung schwer zu identifizieren sein kann. Für Personen, die mit der Technik noch nicht vertraut sind, wird Natalie Lun, eine Technikerin aus meinem Labor, das Verfahren demonstrieren.

In dieser Demonstration werden wir ein Stück Lampenleber anstelle eines Stücks von einem Menschen verwenden. Lassen Sie die Ausrüstung für die Perfusion des Leberstücks wie folgt einrichten, stellen Sie das Wasserbad auf eine geeignete Temperatur ein, so dass die Lösungen 37 Grad Celsius haben, wenn sie die Leber erreichen. Stück. 41 Grad Celsius sind gut für die Lösungen eins, zwei und drei, und für den ummantelten Glaskondensator sollte Lösung vier jedoch bei 37 Grad Celsius liegen, um den Verlust der Kollagenaseaktivität zu reduzieren. Kurz vor der Profusion schalten Sie den Gasregler ein. Für das Oxygenierungsgerät von einem Pathologen besorgen Sie sich ein Leberstück, das im Idealfall eine weitgehend oder vollständig intakte glitzernde Kapsel und nur eine Schnittfläche stellt.

Dieses Leberstück auf dem Buchner-Trichter, das eine perforierte Filterscheibe enthält, muss nun mit Lösung grundiert werden, indem man eine gebogene Spülkanüle mit niedrigen Durchflussraten mit olivfarbenen Spitzen in die größeren Blutgefäße auf der Schnittfläche des Leberstücks einführt. Wenn das Blut aus der Leber ausgespült wird, wird das Gewebe in Bereichen mit guter Durchblutung heller. Die Anzahl der verwendeten Kanülen variiert bei unterschiedlich großen Lebern.

Im Allgemeinen sollten vier bis acht Kanülen für Lebern von unter 20 Gramm bis über 80 Gramm verwendet werden. Wählen Sie die Stärke der Kanüle, um einen festen und sicheren Sitz zu haben. Lassen Sie die kleineren Blutgefäße offen, damit der Puffer aus dem Gewebe abfließen kann.

Erhöhen Sie nun die Durchflussmenge an der Schlauchpumpe auf 110 bis 460 Milliliter pro Minute. Es ist eine gute Durchblutung, wenn das Leberstück während der gesamten verwendeten Flussrate eine hellere Farbe hat. Hängt von der Größe der Leber ab, wobei bei größeren Lebern höhere Perfusionsraten verwendet werden.

Generell ist eine durchschnittliche Perfusionsgeschwindigkeit von 44 Millilitern pro Minute und Kanüle für eine Reihe unterschiedlicher Lebergewichte ideal. Die gewählte Flussrate sollte zu einer leichten Aufpolsterung des Leberstücks führen. Halten Sie das Leberstück während der Perfusion feucht, indem Sie es mit einem in Kochsalzlösung getränkten Stück Gaze abdecken.

Nachdem Sie das Gewebe mit einem Liter Lösung durchblutet haben, einer, um das restliche Blut im Leberstück auszuspülen. Wechseln Sie die Perfusionsflüssigkeit auf Lösung zwei und perfusen Sie 10 Minuten lang. Schalten Sie anschließend die Perfusionsflüssigkeit auf Lösung drei um und perfusionieren Sie mit einem halben Liter.

Tauschen Sie nun die Perfusionsflüssigkeit auf Lösung vier um, die Kollagenase enthält. Führen Sie diese Perfusion neun bis 12 Minuten lang rezirkulierend durch oder bis die Leber ausreichend verdaut ist. Das Lebergewebe sollte unter der glitzernden Kapsel leicht auseinanderzubrechen scheinen.

Die Leber sollte sich auch weich anfühlen, wenn sie mit der stumpfen Seite eines Skalpells untersucht wird. Es ist wichtig, das Leberstück für die richtige Zeit zu verdauen, da eine Überverdauung zu einer geringen Lebensfähigkeit der Hepatozyten und eine Unterverdauung zu einer geringen Ausbeute an Hepatozyten führen kann. Schalten Sie zunächst die Peristaltikpumpe aus und entfernen Sie die Kanüle aus dem Leberstück.

Legen Sie dann das Gewebe in eine Kristallisationsschale mit 100 bis 200 Millilitern Lösung. Fünf. Entfernen Sie die glitzernde Kapsel vorsichtig und schütteln Sie die Zellen vorsichtig aus. Wenn es Bereiche gibt, die nicht gut durchblutet sind, kann ein Skalpell verwendet werden, um diese Regionen zu durchtrennen und die darin enthaltenen Zellen freizusetzen.

Fügen Sie während des Prozesses bei Bedarf mehr Lösung fünf hinzu und bringen Sie schließlich das Volumen von Lösung fünf auf 500 Milliliter. Filtern Sie nun die Zellsuspension zweimal. Zuerst filtrieren Sie die Zellen durch ein 210-Mikron-Nylonnetz in einen Ein-Liter-Konuskolben.

Filtern Sie dann die Zellen durch ein 70-Mikron-Nylonnetz in einen Ein-Liter-Konuskolben. Gießen Sie zwei gleiche Volumina der Zellsuspension in 200-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Dann zentrifugieren Sie die gefilterte Zellsuspension bei 72 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Aspirieren Sie die Snat und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in etwa 200 Millilitern Lösung. Fünf. Wiederholen Sie die Zentrifugation und die Wiederbelebungssuspension dreimal nach der abschließenden Zentrifugation und resuspendieren Sie die Zellen in einer Kühllösung auf eine Endkonzentration von zwei bis 5 Millionen Hepatozyten pro Milliliter. Ein Triam-Blue-Assay kann verwendet werden, um die Zellzahl mit einem Hämozytometer genau zu messen.

Hier sind trianblau gefärbte Hepatozyten aus 648 Isolationen zu sehen. Die durchschnittliche Lebensfähigkeit isolierter humaner Hepatozyten betrug 77 plus oder minus 10 %Die durchschnittliche Ausbeute an Hepatozyten betrug 13 plus oder minus 11 Millionen Hepatozyten pro Gramm Leber mittels Immunfluoreszenz. Isolierte Hepatozyten, die positiv auf Albumin in Grün gefärbt waren, wiesen eine Reinheit von 94 plus oder minus 1 % auf, um die Reinheit der Hepatozyten zu bestimmen.

Die Immunfluoreszenzfärbung wurde viermal mit fünf Replikaten pro Studie durchgeführt. Die Phasenkontrastmikroskopie zeigt die morphologischen Eigenschaften von Hepatozyten, wie z.B. ihre große Zellgröße und ihre polygonale Form. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man menschliche Hepatozyten mit einem zweistufigen Kollagenase-Perfusionsverfahren isoliert