Name: Optimierte Protokolle für Mycobacterium leprae Dehnungs Management: Gefrorene Lizenz Erhaltung und Wartung in Nacktmaus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Erfahren Sie optimierte Protokolle zur Aufbereitung und Konservierung von Mycobacterium leprae in Nacktmäusen. Diese Methode ermöglicht die langfristige Erhaltung lebensfähiger Bazillen für Infektionsforschung und Lepra-Studien.

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Wir danken Beatriz GC Sartori, Lazara M. Trino, Ana Elisa Fusaro und Claudia Carvalho Uhr für die technische Hilfe. Wir danken Pranab K. Das für die Unterstützung der Errichtung des Tieranlage. Wir danken Lais RR Costa für die Überarbeitung des Manuskripts. Diese Studie wurde durch Zuschüsse aus Fundação Paulista contra Hanseníase Fundação de Amparo und à Pesquisa unterstützt tun Estado de São Paulo (FAPESP 2009/06122-5).

1. Herstellung von Mycobacterium leprae Hänge <ol><li> Vor euthanizing die athymischer Maus (NU-Foxn1 nu), bereiten Sie die Trypsin-Lösung und Kulturmedien (Protokoll der Reagenzien - Protokolle 1, 2 und 3). Euthanize die Nacktmäuse 4-5 Monate nach der Inokulation mit M. leprae nach den AVMA Richtlinien für die Euthanasie von Tieren: 2013 Ausgabe 10 (die Experimente und Verwendung von Bildern von Tieren genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Tierpflege-Ausschuss der Faculdade de Odontologia de Bauru, USP durchgeführt). In einem biologischen Sicherheitsschrank für den Umgang mit Tieren, reinigen Sie die gesamte Maus mit 70% Ethanol Alkohol verwendet. </li><li> Halten Sie die hintere Pfote mit Arterienklemmen distal zum Sprunggelenk. Schneiden Sie die Pfote mit einer Schere unter der Zange und tauchen die Pfote in 2% Jod für 20 min. Dann wiederholen Sie den Vorgang für die andere Hinterpfote. </li><li> Übertragen Sie die Pfoten einsauber biologischen Sicherheitsschrank für die weitere Arbeit. Nehmen Pfoten aus dem 2% Jod, trocknen Sie sie mit steriler Gaze und dann sammeln Sie die beiden Straßenräuber mit der Nummer 22 oder 23 Skalpellklinge, die Beseitigung aller Weichgewebe (Dermis, Epidermis, Sehnen und Nerven) in der Nähe bis auf die Knochen. Entfernen Sie die Mittelfußknochen Knochen und die 1. und 5. Fingerglieder. Legen Sie das Material in einer sterilen Petrischale und entfernen Sie die Epidermis, durch Abkratzen mit dem Skalpell. Schneiden Sie das Gewebe in kleine Stücke mit Schere und übertragen Sie sie auf einem Rundrohr. Gewicht der Gewebe-und 1 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). Halten Sie das Röhrchen auf Eis zu vermeiden Aufwärmen der Probe. </li><li> Einen weiteren hinzufügen 1 ml HBSS und homogenisieren die Probe mit einem Gewebe-Homogenisator. <ol><li> Erste Homogenisierung Zyklus: 3 Impulse von 15 Sekunden bei Stufe 4 (14.450 rpm). </li><li> Den Überstand in einen sterilen 50 ml konischen Röhrchen, indem es durch ein Sieb, um die Zelltrümmer zu beseitigen übrigen. Lassen Sie die Lösung durch gra gebenvität. </li><li> Fügen Sie eine zusätzliche 2 ml HBSS, und wiederholen Sie den Zyklus der Homogenisierung (Abschnitt 1.4.1), und übergeben Sie die Proben durch die Zelle Sieb wieder. </li><li> Spülen Sie das Sieb durch Zugabe von HBSS, um die Lautstärke zu 9 ml zu bringen. Entsorgen Sie die Zelle Sieb. </li></ol></li><li> Tauwetter ein Aliquot von 0,5% Trypsin-Lösung. 1 ml Trypsin auf die 9 ml der Zellsuspension in einer Endkonzentration von 0,05% Trypsin erhalten. Entsorgen verbleibenden aufgetaut Trypsin. Inkubation für 60 min in einem 37 ° C Wasserbad. Nach der Inkubation bringe das Volumen auf 40 ml durch Zugabe von steriler Kochsalzlösung, um das Trypsin zu verdünnen. </li><li> Zentrifugieren bei 1700 × g für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Verwerfen des Überstandes durch vorsichtiges Umdrehen des Röhrchens. Das Pellet durch Tippen auf das Rohr und dann 1 ml steriler Kochsalzlösung. Die Suspension in einem neuen konischen Röhre Messung des Endvolumens der Suspension (die Ausbeute / Gramm Gewebe zu berechnen). </li><li> Homogenisieren bazilläre Suspension mit einer 1 ml Insulin-Spritze mit einer 26 G-Nadel während der Übertragung der Suspension in ein neues Röhrchen. </li><li> Führen mikrobiologische Kontrolle der Suspension, indem 2 Tropfen (50 ul) des in jedem Medium: 7H9 und Löwenstein-Jensen Medium, und Inkubation bei 37 ° C für 30 Tage, zum Nachweis von Mycobakterien kontaminiert. Ebenso inokulieren eine Hirn-Herz-Infusion (BHI)-Medium beimpft und 24 Stunden bei 37 ° C, für den Nachweis von kontaminierenden aeroben Bakterien. </li><li> Aliquot der Suspension in Rohre für die Färbung: 35 ul Cold Ziehl-Neelsen-Färbung (Protokoll 2) und 200 ul für die Lebensfähigkeit (Protokoll 3). </li><li> Nach Ziehl-Neelsen-Färbung (ZN), die Berechnung der Anzahl der säurefesten Bazillen / ml (AFB / ml). Für Nacktmäusen Impfung, bereiten eine 1 x 10 8 AFB / ml Suspension; stellen Sie sicher, genügend Volumen, um 30 ul / Fußballen / Tier (Protokoll 5) impfen zu haben, und halten Sie die Suspension kalt, bis der Impfung. Zum Einfrieren, bereiten eine 1 x 10 7 AFB / ml susRente (Protokoll Nr. 4). </li></ol> 2. Kalte Ziehl-Neelsen-Färbung <ol><li> Vor Beginn der Färbung, bereiten Sie das Serum / Phenol-Lösung und die ZN-Färbung Lösungen (Protokoll der Reagenzien - Protokolle 4 und 5). Zeichnen Sie drei Kreise (Innendurchmesser 10 mm) auf drei Glasobjektträger mit einem Immunhistochemie Stift. Identifizieren Sie die Folien: (1) normal oder unverdünnt, (2) 1:10, und (3) 1:100 mit einer Nummer 2 Bleistift (Anmerkung: einige Graphit blendet sich nach ZN-Färbung). </li><li> Verdünnen Sie die Bazillen-Suspension (Schritt 1.10) um 1:10 und 1:100 Verdünnungen, dh mit 5 ul der unverdünnten Suspension und 45 ul von Kochsalzlösung, dann nehmen Sie 5 ul 1:10 und fügen Sie 45 ul der Kochsalzlösung. </li><li> Mit 5 ul Serum / Phenollösung und 10 ul Suspension pro bacillary Kreis. Homogenisieren und gleichmäßig verteilt rund um den Bereich des Kreises mit dem Griff eines Einweg-Schleife. Warten Sie, bis die Suspension auf eine ebene Tisch trocknen. </li><li> Nach dBuch, fixieren Sie die Abstrich, indem die Folie 3 mal über die blaue Flamme eines Bunsenbrenners (ca. 20 sec insgesamt) 11. </li><li> Zur Färbung, bedecken die gesamte Oberfläche der Folie mit filtriert Ziehl-Neelsen carbofuchsine (etwa 5 ml) für 20 min. </li><li> Spülen Sie die Folie in fließendem Wasser (langsam Fluss). </li><li> Decken Sie die Folie mit einem 10%-Alkohollösung für etwa 20 Sekunden. </li><li> Waschen Sie die Folie in fließendem Wasser. </li><li> Decken Sie die Folie mit einer Methylenblau-Lösung für 5 min. </li><li> Spülen Sie die Folie in fließendem Wasser und lassen Sie es trocken bei Raumtemperatur. </li><li> Graf 20 Felder / Kreis (insgesamt 60 Felder / Dia) mit einem 100X-Ölimmersionsobjektiv. Die Berechnung der Säure Bazillen / ml (AFB / ml) wird wie folgt nach der Beschreibung in der Labortechnik für Lepra 12 getan,: AFB / field = Gesamtzahl der Bazillen in den drei Kreisen (60 Felder), geteilt durch 60 gefunden. AFB / ml = AFB / Feld x Konstante (Fläche des Kreisesx 100 dividiert durch Fläche der Objektivlinsenöffnung), und wenn das Zählen einer verdünnten Suspension, multiplizieren die Anzahl der AFB / ml mit dem Verdünnungsfaktor (10 oder 100). </li></ol> 3. Lebensfähigkeit <ol><li> Bevor Sie beginnen, bereiten die autoklaviert M. leprae Suspension (Protokoll der Reagenzien - Protokoll 7). Verwenden Sie das entsprechende Kit (siehe Tabelle der Reagenzien und Geräte) zur qualitativen Bestimmung von M. leprae Fähigkeit in der Suspension. Verdünnen Sie die Lösungen wie folgt (alle Verfahren sollten unter Schwachlicht durchgeführt werden): verdünnte Lösung A mit einem Faktor von 10 in der Kochsalzlösung (1 ul Bestand plus 9 ul Kochsalzlösung), verdünnte Lösung B 20 mit einem Faktor von in Kochsalzlösung (1 ul Lager zzgl. 19 ul Kochsalzlösung). </li><li> Add 3,6 ul der verdünnten Lösung A und 6 ul der verdünnten Lösung B und 200 ul der Suspension der Bazillen zu prüfen (Schritt 1.10). Ein zuvor autoklaviert M. leprae Suspension wird routinemäßig als eine verwendetegative Steuer für die Lebensfähigkeit Färbung. </li><li> Suspensionen die Proben für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Das Röhrchen bei 10.600 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und das Pellet in 15 ul 10% Glycerin. Bewerben 8 ul auf die Oberfläche einer sauberen Glasobjektträger und bedecken Sie es mit einem kleinen Deckglas. Analysieren Sie die Folie mit einem Fluoreszenz-Mikroskop, die entsprechenden Filter enthält (siehe Molecular Probes Empfehlungen). Bewerten Sie die Ergebnisse durch einen Vergleich Syto 9 (Sy) Färbung an Iodid (PI)-Färbung Propidium. Hinweis: Sy Fleck eindringt 100% der beiden tot und lebendig Bakterien und PI-Färbung dringt nur Bakterien mit beschädigten Membranen. Die autoklavierte Suspension (Negativkontrolle) können Klumpen von Bakterien durch die Anwesenheit von Zelltrümmern zu bilden. Die semiquantitativen Skala für Live / Dead-Auswertung verwendet wird, variiert von 0 bis 2 +, 0 bedeutet, dass weniger als 30% der Zellen positiv für PI-Färbung sind; 1 + Mittel zwischen 30 -50% der Zellen positiv für PI-Färbung; 2 + bedeutet, dass mehr als 50% der Zellen positiv für PI-Färbung sind. Ein Wert von 0 wird als für die meisten ausreichend. </li></ol> 4. Einfrieren / Auftauen M. leprae Hänge <ol><li> Bevor Sie beginnen, bereiten die Gefriermedium (Protokoll der Reagenzien - Protokoll 6). Zum Einfrieren, verwenden Sie die nachfolgend beschriebenen Schritte: <ol><li> Jeweils 150 ul der Suspension, die 1 x 10 7 AFB / ml in ein steriles Kryoröhrchen mit 1 ml Gefriermedium. </li><li> Platzieren Sie die Kryoröhrchen in einen Gefrierbehälter und den Behälter bei -80 ° C für 24 Stunden. </li><li> Übertragen Sie die gefrorene Fläschchen auf ein Speicherfeld und speichern Sie es bei -80 ° C </li></ol></li><li> Zum Auftauen, verwenden Sie die nachfolgend beschriebenen Schritte: <ol><li> Entfernen Sie die Kryoröhrchen mit dem gefrorenen Suspension von -80 ° C und legen Sie sie in einem 37 ° C warmen Wasserbad zu starten Auftauen der Suspension. </li><li> Gießen der Suspension in ein Röhrchen mit 20 ml sterilemKochsalzlösung. Mischen Sie die Suspension vorsichtig, bis Auftauen abgeschlossen ist. </li><li> Zentrifugieren der Suspension für 30 min bei 1.700 × g bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und fügen Sie genug steriler Kochsalzlösung, um die gewünschte Lautstärke zu erreichen. Homogenisieren der Suspension durch Durchleiten durch eine Spritze (Schritt 1.8). </li><li> Für ZN-Färbung, die Lebensfähigkeit und Impfung folgen Protokolle 2, 3 und 5. </li></ol></li></ol> 5. Maus-Impfung <ol><li> Zwei Personen sind für dieses Verfahren benötigt werden, um die Maus und ein weiteres zurückhalten, um den Impfstoff zu verabreichen. Das Tier geimpft werden sollte, nach ethischen Richtlinien und Vorschriften behandelt und alle Verfahren müssen von der institutionellen Pflege der Tiere und die Verwendung Ausschuss genehmigt werden. Rain die Nacktmaus durch das Genick des Halses mit den Pfoten nach oben ein. </li><li> Homogenisieren der Suspension, indem es durch eine 26 G-Nadel. Mit einer 1 ml Spritze absaugen genug bazilläre Suspension Inokulate zwei Straßenräuber (30 ul / Fußballen). </li><li> Halten Sie die hintere Pfote, reinigen Sie die Pfotenballen mit 70% Ethanol Alkohol vor der Injektion und mit dem Kegel der Nadel einzuführen, die Nadel nach oben zeigt intradermal, vom proximalen zum distalen Seite der Fußballen. Injizieren 30 ul der Suspension. Die Fußballen Injektionen können bei narkotisierten Mäusen durchgeführt werden. </li><li> Warten Sie 5 Sekunden vor Zurückziehen der Nadel aus der Haut bis zum Rückfluss des Inokulums zu vermeiden. Mäuse sollten auf weichen Betten nach der Inokulation untergebracht werden, und Gehfähigkeit und Anzeichen von Selbstverstümmelung sollten überwacht werden. </li></ol>

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Eine detaillierte Beschreibung eines gut veranschaulicht, erfolgreiche Protokoll für die Vermehrung von M. leprae wird dringend benötigt. Unsere Studie zeigt, dass das Protokoll von Inokulumzubereitung durch Filtration und Trypsin Verdauung kann der Inokula mit sehr kleinen Zelltrümmer und mit hoher Rentabilität von Bazillen erhalten (Score 0 +) werden. Natriumhydroxid wurde verwendet, um das Gewebe für die Reinigung von Bazillen 6 disaggregieren. Studien in unserem Labor mit Natronlauge zur Reinigung von M. durchgeführt leprae führte zur Bildung von Klumpen von Bazillen, behindern die Homogenisierung der Suspension für die Lebensfähigkeit und Tierimpfung (Daten nicht gezeigt). Potenzielle Probleme mit der Inokulumzubereitung durch Filtration und Trypsin Verdauung angetroffen umfassen große Menge Zelltrümmer und Verunreinigungen des Inokulums mit bakteriellen oder Pilzmittel. Bei großen Mengen von Zell DEBRist, werden nach der Reinigung beobachtet, entweder Trypsin nicht mehr aktiv ist, oder es ist eine übermäßige Menge an biologischem Material. Die enzymatische Aktivität der Trypsin-Stammlösung ausgewertet werden. Wenn übermäßige Menge der ursprünglichen biologischen Material vermutet wird, sollte das Material aliquotiert werden und das Protokoll sollte in getrennten Ansätzen durchgeführt werden. Um eine Kontamination des Inokulums mit bakteriellen oder Pilzmittel zu vermeiden, muss darauf geachtet werden, das Material unter sterilen Bedingungen verarbeitet werden. Wenn Pilz-und / oder bakteriellen Kontamination festgestellt werden, sollten die Suspension verworfen werden. Eine Begrenzung der Protokoll die Subjektivität der Lebensfähigkeit Auswertung unter Verwendung der beschriebenen halbquantitativen Methode. Die Lebensfähigkeit semi-quantitativ bewertet ist praktischer, wenn auch weniger präzise als die quantitative Methode 6 veröffentlicht. Die Lebensfähigkeit Bewertung von 0 + und 1 + zufriedenstellend sind für die Instandhaltung der Ausbreitung und das Einfrieren vonM. leprae. Lahiri et al. haben bereits gezeigt, dass Nacktmäusen mit 80-90% lebensfähig Impfstoff geimpft, führen zu Straßenräuber geeignet für die Ernte (hohe Lebensfähigkeit Bazillen) bei 4-5 Monaten der Impfung. Daher ist eine frühe Infektion (ca. 4 Monate) die beste Erntezeit. Für die Ernte von gefrorenen Inokula wurden die Mäuse in der vorliegenden Protokoll geimpften für längere Zeit (7 Monate) auf Wachstumskurven garantieren gehalten. Ein kritischer Schritt, um eine ausreichende Tragfähigkeit zu gewährleisten, ist die Verwendung von frischen Bazillen Suspensionen, vorzugsweise innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme von biologischem Material von dem Host und Verarbeitung. Außerdem Qualität der Reagenzien, frisch zubereitete verdünnten Trypsin und Lebensfähigkeit Färbelösungen, sind notwendig, um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten. Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls ist, daß die endgültige M. leprae Federung ist nicht frei von Wirts-DNA-, RNA-, Protein-, etc. Daher müssen andere Reinigungsschritte hinzugefügt werden to erhalten eine M. leprae Suspension frei von Wirtszellkomponenten. Verfahren zum Aufrechterhalten einer lebensfähigen Bazillen durch Einfrieren gesamten Gewebeproben von M. leprae Läsionen berichtet worden 9. Allerdings ist die Studie von Portaels et al. zeigten einen signifikanten Verlust der Lebensfähigkeit, die zwischen 65-97% nach dem Einfrieren und Auftauen von M. leprae infiziert Gewebeproben von Gürteltier 9 erhalten. Unser Protokoll gezeigt, dass die in M. beobachtet Lebensfähigkeit Index leprae Suspensionen nach Einfrieren und Auftauen fallen im Vergleich zu den Aliquots, die nicht fixiert (Tabelle 1) war. In der Tat, das Einfrieren des M. leprae Suspension in gefrierenden Medien ergab Lebensfähigkeit von 50-70%, mit Lebensfähigkeit Score 1 +, während die Lebensfähigkeit Punktzahl 0 + wurde in der nicht gefrorenen Suspension erhalten. Dennoch ist die Vermehrung von M. leprae war nach 7 Monaten nach der Inokulation von Nacktmäusen befriedigend ( <sTrong&gt; Tabelle 1). Die Inokulation von Nacktmäusen mit rekonstituierten Proben gehalten für 60 Tage führte zu mittleren 100fache Erhöhung der Anzahl von Bazillen im Vergleich zum ursprünglichen Inokulum eingefroren. Es scheint, dass das Einfrieren des M. leprae Suspension in Gefriermedium anstelle der infizierten Gewebeproben, ist effizienter. Ein entscheidender Schritt unseres Protokolls ist die langsame Einfrieren der AFB in einem Gefrierbehälter notwendig, die Bazillen lebensfähig zu halten, wie von Colston Hilson und 8 demonstriert. Zukünftige Experimente werden durchgeführt, um die Lebensfähigkeit der Bazillen nach längeren Perioden Einfrieren zu beurteilen. Zusammenfassend, weil M. leprae nicht in vitro wachsen, ermöglicht unser Protokoll für eine schnelle und einfache Alternative für die Wartung von lebensfähigen Impfstoff, und die erfolgreiche Gefrierschritt ermöglicht die Wartung von Stämmen ohne kontinuierliche Durchgang bei Tieren, so dass die Gründung einer Bank von definierten Stämmen. Dieser Abschnitt enthält Anweisungen für die Vorbereitung Reagenzien dieses Protokoll durchzuführen. 1. Trypsin <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Trypsin </td><td> 0,5 g </td></tr><tr><td> Destilliertes Wasser </td><td> auf 100 ml </td></tr></tbody></table> Filter zu sterilisieren. Lagerung bei -20 ° C. 2. 7H9 <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 7H9-Bouillon-Basis </td><td> 4,7 g </td></tr><tr><td> 40% Glycerin Lager </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Destilliertes Wasser </td><td> bis zu 900 ml </td></tr></tbody></table> Mischen Sie den Boden mit Wasser, dann fügen Sie die Glycerin unter Rühren. Autoklaven bei 121 ° C für 20 min sterilisiert. Lagern bei 4 ° C 3. Hirn-Herz-Infusion (BHI) <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> BHI </td><td> 37 g </td></tr><tr><td> Destilliertes Wasser </td><td> bis zu 1000 ml </td></tr></tbody></table> Autoklaven bei 121 ° C für 15 min sterilisiert. Lagern bei 4 ° C 4. Phenol Serum 4.1) 5% Phenol <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Phenol </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Destilliertes Wasser </td><td> auf 100 ml </td></tr></tbody></table> 4.2) Serum Phenol <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> fötales Rinderserum </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> 5% Phenol </td><td> 98 ml </td></tr></tbody></table> Lagern bei 4 ° C 5. Lösungen für kalte Ziehl-Neelsen-Stain 5.1) CarboFuchsin <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody&gt; <tr><td> Fuchsin </td><td> 1 g </td></tr><tr><td> Phenol Kristallen auf 60 ° C geschmolzen </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Reinem Äthylalkohol </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Destilliertes Wasser </td><td> auf 100 ml </td></tr></tbody></table> Filter vor jedem Gebrauch. 5.2) Methylenblau Basis <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Methylenblau </td><td> 3 g </td></tr><tr><td> 95% Ethylalkohol </td><td> bis zu 200 ml </td></tr></tbody></table> 5.3) Alkohol-Säure <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 70% Alkohol </td><td> 990 ml </td></tr><tr><td> aus Chlor </td><td> 10 ml </td></tr></tbody></table> 6. Medium zum Einfrieren: <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> OADC </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> 7H9 Medium </td><td> auf 100 ml </td></tr></tbody></table> Autoklav Glycerin vor dem Gebrauch und sterilisieren OADC durch Filtration. 7. Autoklaviert M. leprae Suspension Autoklaven bei 121 ° C für 20 min. Lagerung bei -20 ° C.

Lepra, eine Krankheit, die durch Mycobacterium leprae verursacht wird, ist ein wichtiges Problem der öffentlichen Gesundheit in vielen Ländern auf der ganzen Welt 1,2. Obwohl es als eine Infektionskrankheit, die sowohl Haut-und peripheren Nerven wirkt bekannt, gibt es noch einige Lücken im Wissen über die Mechanismen in der komplexen Immunpathogenese der Erkrankung beteiligt sind. Unter den herausfordernden Eigenschaften von M. leprae, der seine Studie behindern seiner Unfähigkeit, in künstlichen Nährmedien und seine relativ lange Verdopplungszeit (ca. 14 Tage) 3,4 wachsen. Die meisten experimentellen Verfahren, die M. benutzen leprae sind mit Bazillen von Hautläsionen der Lepra-Patienten oder von experimentellen Tiermodellen, wie Gürteltiere und verschiedene Stämme von Mäusen 5,6 gereinigt eingestellt. Seit vielen Jahren haben die Forscher auf die Reinigung von M. hing leprae von Hautläsionen der multibacillary LEPRosy Patienten für den Einsatz in experimentellen Verfahren. Mehrere Laborbedingungen für die in vitro-Kultivierung oder Wartung von lebenden M. leprae sind versucht worden, aber bis heute haben Tiermodellen erwiesen sich als am besten geeignet für Forschungszwecke. In den 1960er und 1970er Jahren begannen die Forscher mit Mäusen und Gürteltiere zur Erfassung und Bewertung von M. leprae Lebensfähigkeit Überwachen bakteriellen Wachstums in Reaktion auf Anti-M. leprae Drogen und das Wachstum und die Pflege von mycobakteriellen Stämmen 2,4. Die Tiermodelle haben einige Einschränkungen, vor allem in Gürteltiere und nicht-menschlichen Primaten, einschließlich des ethischen Bedenken, Kosten für Wartung, besondere Infrastruktur für die Tierwartungsaufwand und schlechte Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und Abschluss Erträge. Derzeit sind Mäuse die bevorzugte Tiermodell für Lepra-Forschung. Die Laborbedingungen unter Verwendung von Mäusen sind leicht zugänglich, leicht durchzuführen, und für einen standardisierten Protokollen <sup&gt; 7.8.9. Nacktmäuse wurden in der Wartung von M. verwendet leprae-Stämme, weil auch bei geringen Lasten lebensfähigen Bazillen führt die T-Zell-Immunantwort auf mangelhaft üppigen Granulome und gute bazilläre Multiplikation. So hat dieses Tiermodell breite Akzeptanz in der Lepra-Forschung gewonnen. In dem vorliegenden Bericht ein einfaches Protokoll zur enzymatischen Reinigung von Bazillen von Nacktmaus Fußballen beschreiben wir, für die Zubereitung eines M. bestimmt leprae Suspension mit minimaler Zelltrümmer und mit hohen Keimfähigkeit Index. Die Tragfähigkeit wird durch Fluoreszenz-Mikroskopie, die sich schnell im Labor durchgeführt werden können, bestimmt. Wir haben auch eine Modifikation der Standard-Methode für bazilläre Zählung durch Kalt Ziehl-Neelsen-Färbung und Lichtmikroskopie zu demonstrieren. Zusätzlich stellen wir ein alternatives Protokoll für die Wartung und Lagerung von M. leprae-Stämme, so dass Einfrieren und Auftauen von bazilläre stocks.

<table><tbody><tr><td>BacLight Bakterielles Lebensfähigkeitskit</td><td>Invitrogen; Molekulare Sonden</td><td>L7007</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>Kryo 1 &deg; C Gefrierbehälter</td><td>Nalgene</td><td>5100001</td><td></td></tr><tr><td>Lowenstein-Jensen Medium</td><td>LB Laborclin</td><td>901122</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>TEK Nova Inc</td><td>S5812</td><td></td></tr><tr><td>Pen</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen 50 ml/konischer Boden</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb - 40 & Mikro; m Nylon</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T-7409</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 Bouillon Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0178 Fluka</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Gibco BRL</td><td>15514011</td><td></td></tr><tr><td>Gehirn Herz Infusion (BHI)</td><td>Oxoid LTDA</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>Fuchsin</td><td>Merck Millipore</td><td>1159370025</td><td></td></tr><tr><td>Phenol&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15509037</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol</td>, <td>Merck Millipore</td><td>EX02764</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrinsäure</td>, <td>Merck</td><td>1131349010</td> BBL, <td></td></tr><tr><td>Middlebrook OADC (Ölsäure-Albumin-Dextrose-Katalase),</td> <td>Becton Dickinson</td><td>211886</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>, Gibco; LifeTechnologies</td><td>26140079</td><td></td></tr></tbody></table>

optimierte protokolle für<em&gt; mycobacterium leprae</em&gt; dehnungs management: gefrorene lizenz erhaltung und wartung in nacktmaus

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Lepra, die durch Mycobacterium leprae verursacht wird, ist eine wichtige Infektionskrankheit, die immer noch endemisch ist in vielen Ländern der Welt, darunter Brasilien. Es gibt derzeit keine bekannten Verfahren zum Züchten von M. leprae in vitro und präsentiert ein großes Hindernis in der Studie des Erregers im Labor. Daher ist die Erhaltung und das Wachstum von M. leprae-Stämme werden vorzugsweise in Nacktmaus (NU-Foxn1 nu) durchgeführt. Die Laborbedingungen unter Verwendung von Mäusen sind leicht zugänglich, einfach durchzuführen und ermöglicht die Standardisierung und Entwicklung von Protokollen zur Erzielung reproduzierbarer Ergebnisse. In dem vorliegenden Bericht beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Reinigung von Bazillen von Nacktmaus Fußballen unter Verwendung von Trypsin, die eine Suspension mit minimalem Zelltrümmer und mit hoher Lebensfähigkeit der Bakterien-Index ergibt, wie durch Fluoreszenzmikroskopie bestimmt. Eine Änderung der Standardmethode für bazilläre Zählen von Ziehl-NeelsenFärbung und Lichtmikroskopie wird auch demonstriert. Zusätzlich beschreiben wir ein Protokoll zum Einfrieren und Auftauen bacillary Bestände als alternatives Protokoll für die Wartung und Lagerung von M. leprae-Stämme.

Der Erfolg des Protokolls kann auf drei Arten bewertet werden. Zuerst wird Bewertung der Qualität des Inokulums durch die Menge der Zelltrümmer und die resultierende Prozentsatz der lebensfähigen Bazillen in der endgültigen Suspension (siehe Protokoll Nr. 3) bestimmt. Wie in den 1 und 2 gezeigt, der letzte bazilläre Suspension enthalten sehr wenig Zelltrümmer und hohe Rentabilität (Score 0 +), beachten Sie, dass die meisten Bazillen mit dem Syto 9 grün fluoreszierenden Fleck (Fleck eindringt 100% der beiden tot und lebendig Bakterien befleckt, Figur 1) und ist nur wenige Bazillen mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff PI (Fleck dringt nur Bakterien mit beschädigten Membranen, Fig. 2) gefärbt. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50620/50620fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50620/50620fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Syto 9 Anfärbung<html> M. leprae Federung. Grüne Fluoreszenz zeigt die Anwesenheit von lebendig und tot M. leprae. 400X. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50620/50620fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50620/50620fig2.jpg" /> 2. PI-Färbung von M. leprae Federung. Rote Fluoreszenz, die die kleine Zahl der Toten M. leprae. 400X. Zweitens wird ein Inokulum mit hoher Rentabilität auf die Vermehrung der Bazillen in die Fußballen der Tiere nach 4-5 Monaten nach der Impfung beeinflussen, mit der Entwicklung von der Hand makroskopische Läsion, wie in dem Video (Protokoll 1). Der dritte Weg, um den Erfolg des Protokolls zu beurteilen ist durch die Auswertung der Überlebensrate und die Vermehrung von AFB in Maus-Straßenräuber mit Bazillen, die für verschiedene Zeiträume eingefroren worden war, angeimpft (siehe Protokoll Nr. 4). &quot;Cellspacing =&quot; 0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Experiment (Tier) </td><td> Anzahl der AFB / ml eingefroren am Tag 0 </td><td> Die Lebensfähigkeit Punktzahl / Tag 0 </td><td> Einfrieren Zeit (Tage) </td><td> Anzahl der AFB nach dem Einfrieren geimpft </td><td> Die Lebensfähigkeit Punktzahl nach dem Einfrieren </td><td> Anzahl der AFB / ml nach 7 Monaten wieder </td></tr><tr><td> 1 (1) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 60 </td><td> 1,7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 2,3 x 10 8 </td></tr><tr><td> 1 (2) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 60 </td><td> 1,7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 3,8 x 10 7 </td></tr><tr><td> 1 (3) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 60 </td><td> 1,7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 8,5 x 10 7 </td></tr><tr><td> 1 (4) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 60 </td><td> 1,7 x 10 5 </td> &lt;td&gt; 1 + </td><td> 4,6 x 10 7 </td></tr><tr><td> 2 (1) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 4,2 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 1,7 x 10 7 </td></tr><tr><td> 2 (2) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 4,2 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 4,8 x 10 6 </td></tr><tr><td> 2 (3) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 4,2 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 8,6 x 10 6 </td></tr><tr><td> 3 (1) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 1,7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 1,2 x 10 7 </td></tr><tr><td> 3 (2) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 1,7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 1,8 x 10 7 </td></tr><tr><td> 3 (3) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td&gt; 0 + </td><td> 15 </td><td> 1,7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 1,8 x 10 7 </td></tr><tr><td> 3 (4) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 1,7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 2,6 x 10 7 </td></tr><tr><td> 3 (5) </td><td> 1,0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 1,7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 3,7 x 10 6 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Ergebnisse von M. leprae Multiplikation mit Post Einfrieren Suspensionen. Tabelle 1 zeigt Ergebnisse der M. leprae Wachstum mit Suspensionen nach dem Einfrieren. Die Lebensfähigkeit Punktzahl der Suspensionen nach dem Auftauen war 1 +. Das Gefrierprotokoll wurde in drei unabhängigen Experimenten durchgeführt, um die unterschiedliche Gefrierzeiten testen. In beiden Experimenten mit Inokula für 15 oder 60 Tage eingefroren, das Ergebnis war ähnlich, S.ropagation nach Einfrieren ergab 10-1000 Zeiten erhöhen die Zahl der AFB erholte sich von jedem Fußballen nach 7 Monaten der Inokulation (Tabelle 1). Daher das Einfrieren von M. leprae Suspensionen in 7H9-Medium mit OADC (Ölsäure-Albumin-Dextrose-Katalase) ergänzt führte Wartung der Lebensfähigkeit. Drei Inokula wurden verwendet, um M. zu bewerten leprae Multiplikation nach zwei verschiedenen Gefrierzeiten (15 und 60 Tage). Nach 7 Monaten wurden Bazillen aus Fußballen von Mäusen geimpft erholt und nach Ziehl-Neelsen-Färbung gezählt. Semiquantitative Lebensfähigkeit Skala: 0 bedeutet bis zu 30% der PI-gefärbten Zellen fehlt; 1 + Mittel zwischen 30-50% der PI-gefärbten Zellen, 2 + bedeutet, über 50% der PI-gefärbten Zellen. AFB: säurefesten Stäbchen.

Mycobacterium leprae, der Erreger der Lepra, wächst nicht in vitro. Wir beschreiben eine einfach zu Protokoll folgen, um eine Suspension herzustellen Bazillen, die Wartung von großen Mengen von M. gewährleisten leprae für eine Vielzahl von Anwendungen. Protokolle für die Vermehrung von Maus Fußballen Impfung, die Bewertung der Rentabilität, Einfrieren und Auftauen bazilläre Lager im Detail beschrieben werden.

Optimierte Protokolle für<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt; Dehnungs Management: Gefrorene Lizenz Erhaltung und Wartung in Nacktmaus

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. ...

Das Ziel dieser Arbeit besteht darin, zu zeigen, wie man eine hochviable Suspension von Mycobacterium-Lipiden herstellt. Für die Injektion in nackte Mäuse. Wir gewinnen das Bakterienleben aus einem infizierten Tier, vorzugsweise im frühen Stadium der Infektion. Um hohe Lebensfähigkeit der Ary-Erträge zu gewährleisten, euthanasieren Sie das Tier innerhalb des biologischen Sicherheitswerks. Halten Sie den hinteren Puls mit einer hämostatischen Pinzette fest. Schneiden Sie ihn mit einer Zange ab und tauchen Sie ihn zur Desinfektion 20 Minuten lang in 2 % Iod ein, wobei die Position so gehalten wird, dass die Fußsohle nach oben zeigt.Sammeln Sie das Weichgewebe. Entfernen Sie mit einer Skalpellklinge die Knochen der ersten und fünften Phalangen, um die Homogenisierung des Gewebes zu erleichtern. Geben Sie das Gewebe in eine sterile Petrischale. Schaben Sie die Epidermis ab.Schneiden Sie das granulomat&ouml;se Gewebe mit einer Schere in kleine St&uuml;cke und warten Sie auf die sp&auml;tere Berechnung des Gewebeertrags. &Uuml;berf&uuml;hren Sie die kleinen St&uuml;cke in ein Reagenzglas, das ein ml Hank'sche Pufferl&ouml;sung enth&auml;lt. Geben Sie ein weiteres ml Hank'sche L&ouml;sung hinzu und homogenisieren Sie das Gewebe dreimal je 15 Sekunden bei Geschwindigkeit Vier.Stellen Sie ein Zellfilter in ein steriles 50-ml-Konischglas. Pipettieren Sie die Suspension auf den Filter und lassen Sie die Lösung durch Schwerkraft passieren. Um die Rückstände zu entfernen, geben Sie zwei weitere MLS von Hank's zu der Suspension hinzu und homogenisieren Sie diese erneut.Unter Verwendung desselben Zyklus wird die Suspension durch dieses Sieb geleitet. Spülen Sie das Sieb durch Hinzufügen von Strähnen aus. Um das Gesamtvolumen der Suspension auf neun ml anzupassen, fügen Sie ein ml einer 0,5-%-Trypsinlösung zur Suspension hinzu, um eine Endkonzentration von 0,05 % zu erreichen.Mischen Sie es, indem Sie das Gefäß vorsichtig umstülpen, und inkubieren Sie es 60 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation wird das Volumen der Suspension durch Zugabe steriler Kochsalzlösung auf vier ml eingestellt, zentrifugiert bei 1700 ×g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius, das Überstand wird verworfen und das Pellet durch leichtes Antippen des Gefäßes resuspendiert. Geben Sie 1 ml serologische Kochsalzlösung hinzu und mischen Sie es. Überführen Sie die Suspension in ein neues Gefäß. Homogenisieren Sie die vaskuläre Suspension unter Verwendung einer 1 ml-Insulinspritze mit einer 26-Gauge-Nadel, während Sie die Suspension in ein neues Gefäß überführen. Führen Sie die mikrobiologische Kontrolle der Suspension durch, indem Sie zwei Tropfen 18 Medium, sieben H neun Hirn-Herz-Infusion hinzufügen.11 Stein Genesen bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend die routinemäßigen mikrobiologischen Kontrollverfahren durchführen. Für die Z-Färbung.Stellen Sie eine Verdünnung von eins zu zehn und eine von eins zu hundert der S-Suspension in physiologischer Kochsalzlösung her. Homogenisieren Sie jede Verdünnung, bevor Sie diese Proben zur Zählung vorbereiten. Bereiten Sie drei Objektträger vor, indem Sie mit einem Permanentstift drei Kreise mit einem Innendurchmesser von 10 Millimeter auf die Oberfläche jedes Objektträgers zeichnen.Umgeben Sie die Kreise nun mit einem Immunhistochemiestift. Beschriften Sie die Präparate mit einem Bleistift der Härtegrad 2, um die Präparate für die drei Saray-Konzentrationen vorzubereiten: unverdünnt, 1:10 und 1:100.Pipettieren Sie fünf Mikroliter der Phenol-Serum-Lösung und 10 Mikroliter der Sary-Suspension in jeden Kreis, homogenisieren Sie und verteilen Sie die Suspension gleichmäßig über die Fläche des Kreises. Legen Sie diese Objektträger nach dem Trocknen mit dem Griff einer Einwegschleife auf einen ebenen Tisch. Fixieren Sie sie, indem Sie die Objektträger dreimal über die blaue Flamme führen, wobei die Bachelor-Suspensionen nach oben zeigen.Führen Sie eine Code-Zuni-Stabilisierung durch. Untersuchen Sie diese Präparate. Die drei Verdünnungen.Wählen Sie die am besten geeignete Verdünnung für die Sary-Zählung aus. Bereiten Sie 200 Mikroliter abgetötete Sary-Suspension durch Autoklavieren der vaskulären Suspension für 30 Minuten bei 121 Grad Celsius vor. Verwenden Sie das L 7 0 0 7 Live-Dead-Hintergrundbeleuchtungs-Kit für die fluoreszierende Färbung von mikrobiellem Lipid.Bereiten Sie eine Verdünnung von Lösung A im Verhältnis 1 zu 10 und eine Verdünnung von Lösung B im Verhältnis 1 zu 20 unmittelbar vor der Anwendung vor. Geben Sie zu jeweils 200 Mikrolitern der unverdünnten vaskulären Suspension (original und abgetötet) 3,6 Mikroliter der verdünnten Lösung A und 6 Mikroliter der verdünnten Lösung B. Nach 15-minütiger Inkubation im Dunkeln zentrifugieren Sie die Suspension 5 Minuten bei 10.600 ×g und 4 °C. Entfernen Sie das Überstand mit der Pipette wieder.Suspendieren Sie das Pellet in 50 Mikrolitern 10 % Glycerin und homogenisieren Sie es durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Geben Sie acht Mikroliter jeder Suspension auf einen Objektträger und bedecken Sie sie mit einem kleinen Deckglas. Lichtgeschützt aufbewahren.Beobachten Sie die Suspensionen unter dem Fluoreszenzmikroskop. Bereiten Sie eine Suspension mit einer Konzentration von 10 bis sieben BA-Lip pro ml zu, zu einem ml Einfriermedium in jedem Kryoröhrchen. Geben Sie anschließend 150 Mikroliter der S-Suspension zu einem ml des Einfriermediums hinzu und homogenisieren Sie durch Vorsichtiges Umstülpen des Röhrchens.Stellen Sie das Kryoröhrchen in den Gefriermittelbehälter. Halten Sie den Behälter mindestens 24 Stunden bei minus 80 Grad Celsius. Überführen Sie die Röhrchen in eine Lagertube und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius zum Auftauen.Tauen Sie die gefrorene Suspension in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf. Überführen Sie die Suspension in ein Konikoröhrchen, das 20 ml sterile Kochsalzlösung enthält. Abzentrifugieren.Die Baline wurde gemäß dem Z-Erhaltungsprotokoll für die Zählung und dem fluoreszierenden Färbeprotokoll zur Bestimmung der Variabilität durchgeführt. Bereiten Sie eine Suspension mit 10 bis acht BA pro Mahlzeit vor und homogenisieren Sie die Suspension, bevor Sie jedes Tier impfen. Ziehen Sie hundert Mikroliter in eine Insulinspritze ein und impfen Sie 30 Mikroliter in die hinteren Fußpolster jedes Tieres zur Bestimmung der Vitalität.Die grüne Fluoreszenz wird in allen BAI beobachtet, die rote Fluoreszenz hingegen nur in jenem bai. Wenn jene BAI steriler Kontrolle entsprechen, wird dieselbe Intensität an grünem und rotem BAI-Licht beobachtet. Die Inokulation von M Lepar, das über unterschiedliche Zeiträume eingefroren wurde, führt nach sieben Monaten zu einer um das 10- bis 1000-fache erhöhten Anzahl an gewonnenen BAI.Zum Abschluss möchten wir hinzufügen, dass dieses Protokoll, da IL leid nicht in vitro wächst, eine schnelle und einfache Möglichkeit bietet, lebensfähige yl Leid für weitere Anwendungen im Labor bereitzuhalten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

C57BL / 6 Mäuse wurden verwendet, um Hc Pathogenese zu studieren und bieten das beste Modell. Wir erforschen die potenziellen Vorteile der humoralen Immunität gegen diesen Pilz erzeugt und mehrere mAbs [zum Histon H2B und ein heat shock protein 60kDa], dass wir für ihre Schutzwirkung nach intraperitonealer Verabreichung getestet.

Passive Verwaltung von monoklonalen Antikörpern gegen H. capsulatum Ua Pilzpathogene

Dieses Video zeigt eine effiziente Homogenisierungstechnik zur Erzeugung einer Antigen-adjuvanten Emulsion zur Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) in einem Mausmodell. Die Emulsion enthält ein Autoantigen – Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) – in der Wasserphase, umgeben von einer kontinuierlichen Ölphase, die aus einem inaktivierten pathogenen Bakterium besteht. Die Emulsion sorgt für eine anhaltende Freisetzung von Antigenen für eine verlängerte...

Herstellung einer Antigen-Adjuvans-Emulsion zur Induktion der autoimmunen Enzephalomyelitis

Dieses Video zeigt eine Methode zur Generierung eines Mausmodells der geprimten mykobakteriellen Uveitis (PMU) zur Untersuchung der postinfektiösen Uveitis. Bei der Induktion von PMU durch intravitreale Injektion von hitzeabgetötetem Mycobacterium tuberculosis bei einer Maus, die zuvor mit demselben Immungen immunisiert wurde, wird das Fortschreiten der chronischen Entzündung im Auge mittels Bildgebung und histopathologischer Untersuchung...

Ein Mausmodell der geprimten mykobakteriellen Uveitis zur Untersuchung der postinfektiösen Uveitis

Dieses Video zeigt einen Assay zur Überwachung der dendritischen Zellmigration nach einer Balleninfektion mit Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin BCG bei Mäusen. Bei einer bakteriellen Infektion werden aktivierte DC-Zellen der Haut mit einem zellpermeablen Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester (CFSE)-Farbstoff markiert. Nach einem geeigneten Intervall für die DC-Migration in den kehlkehlchendrainierenden Lymphknoten werden die Knotenzellen isoliert und einer Immunfärbung auf...

Ein CFSE-basierter Assay zur Überwachung der Migration dendritischer Zellen der Haut zu drainierenden Lymphknoten bei infizierten Mäusen

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um die Beeinträchtigung der neurovaskuläre Einheit während experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in vivo zu untersuchen. Wir gezielt auf Durchlässigkeit der Blut - Hirn-Schranke und Gelatinase Tätigkeit in Leukozyte Migration über die Glia Limitans ermitteln.

Beeinträchtigung der Endothelzellen und glialen Barrieren des Referats neurovaskuläre während experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis In Vivo Visualisierung

Hier werden drei experimentelle Ansätze beschrieben, um die Dynamik der HIV-Infektion bei humanisierten Mäusen zu untersuchen. Die erste erlaubt die Untersuchung chronischer Infektionsereignisse, während letztere die Untersuchung akuter Ereignisse nach primärer Infektion oder viraler Reaktivierung ermöglicht.

Chronische, akute und reaktivierte HIV-Infektion in humanisierten immundefizienten Mausmodellen

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Induktion der Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) bei Mäusen. Diese Methode beschreibt die Schritte, um eine zuverlässige und robuste Augenentzündung im Mausmodellsystem zu erzeugen. Mit diesem Protokoll erzeugten wir uveitische Augen und entzündete Augengenossen von einzelnen Tieren zur weiteren Auswertung mit immunologischen, transkriptomischen und proteomischen Assays.

Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) als Modell für postinfektiöse Uveitis

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell unter Verwendung von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein und die Überwachung des Krankheitsprozesses mit einem klinischen Scoring-System. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis-bezogene Symptome werden mittels Mausfemur-Mikro-Computertomographie und Freilandtest analysiert, um den Krankheitsprozess umfassend zu beurteilen.

Induktion und diverse Bewertungsindikatoren der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Um eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis, ein Tiermodell für Multiple Sklerose, zu induzieren, werden Mäuse mit einer Wasser-in-Öl-Emulsion immunisiert, die ein Autoantigen und ein komplettes Freund-Adjuvans enthält. Während für die Herstellung dieser Emulsionen mehrere Protokolle existieren, wird hier ein schnelles, einfaches und standardisiertes Homogenisierungsprotokoll für die Emulsionsherstellung vorgestellt.

Eine schnelle, einfache und standardisierte Homogenisierungsmethode zur Herstellung von Antigen/Adjuvans-Emulsionen zur Induktion experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis ist eines der am weitesten verbreiteten murinen Modelle der Multiplen Sklerose. Im aktuellen Protokoll werden C57BL/6J-Mäuse beiderlei Geschlechts mit dem Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinpeptid immunisiert, was hauptsächlich zu einer aufsteigenden Parese des Schwanzes und der Gliedmaßen führt. Hier besprechen wir das Protokoll der EAE-Induktion und -Auswertung.

Modellierung der Multiplen Sklerose bei beiden Geschlechtern: MOG35-55-induzierte experimentelle Autoimmunenzephalomyelitis

Mäuse sind im Allgemeinen resistent gegen Infektionen mit Mycobacterium abscessus, was die Entdeckung und Entwicklung dringend benötigter Antibiotika gegen Lungeninfektionen erschwert. Hier beschreiben wir eine Methode der Inokulumvorbereitung und intratrachealen Infektion, die bei immunkompetenten Mäusen nachweislich eine anhaltende Infektion auslöst.

Vorbereitung von in Agarperlen eingebettetem Mycobacterium abscessus zur intratrachealen Inokulation immunkompetenter Mäuse

Erfahren Sie optimierte Protokolle zur Aufbereitung und Konservierung von Mycobacterium leprae in Nacktmäusen. Diese Methode ermöglicht die langfristige Erhaltung lebensfähiger Bazillen für Infektionsforschung und Lepra-Studien.

Optimierte Protokolle für

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