Optimierte Protokolle für

Das Ziel dieser Arbeit besteht darin, zu zeigen, wie man eine hochviable Suspension von Mycobacterium-Lipiden herstellt. Für die Injektion in nackte Mäuse. Wir gewinnen das Bakterienleben aus einem infizierten Tier, vorzugsweise im frühen Stadium der Infektion.

Um hohe Lebensfähigkeit der Ary-Erträge zu gewährleisten, euthanasieren Sie das Tier innerhalb des biologischen Sicherheitswerks. Halten Sie den hinteren Puls mit einer hämostatischen Pinzette fest. Schneiden Sie ihn mit einer Zange ab und tauchen Sie ihn zur Desinfektion 20 Minuten lang in 2 % Iod ein, wobei die Position so gehalten wird, dass die Fußsohle nach oben zeigt.

Sammeln Sie das Weichgewebe. Entfernen Sie mit einer Skalpellklinge die Knochen der ersten und fünften Phalangen, um die Homogenisierung des Gewebes zu erleichtern. Geben Sie das Gewebe in eine sterile Petrischale. Schaben Sie die Epidermis ab.

Schneiden Sie das granulomatöse Gewebe mit einer Schere in kleine Stücke und warten Sie auf die spätere Berechnung des Gewebeertrags. Überführen Sie die kleinen Stücke in ein Reagenzglas, das ein ml Hank'sche Pufferlösung enthält. Geben Sie ein weiteres ml Hank'sche Lösung hinzu und homogenisieren Sie das Gewebe dreimal je 15 Sekunden bei Geschwindigkeit Vier.

Stellen Sie ein Zellfilter in ein steriles 50-ml-Konischglas. Pipettieren Sie die Suspension auf den Filter und lassen Sie die Lösung durch Schwerkraft passieren. Um die Rückstände zu entfernen, geben Sie zwei weitere MLS von Hank's zu der Suspension hinzu und homogenisieren Sie diese erneut.

Unter Verwendung desselben Zyklus wird die Suspension durch dieses Sieb geleitet. Spülen Sie das Sieb durch Hinzufügen von Strähnen aus. Um das Gesamtvolumen der Suspension auf neun ml anzupassen, fügen Sie ein ml einer 0,5-%-Trypsinlösung zur Suspension hinzu, um eine Endkonzentration von 0,05 % zu erreichen.

Mischen Sie es, indem Sie das Gefäß vorsichtig umstülpen, und inkubieren Sie es 60 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation wird das Volumen der Suspension durch Zugabe steriler Kochsalzlösung auf vier ml eingestellt, zentrifugiert bei 1700 ×g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius, das Überstand wird verworfen und das Pellet durch leichtes Antippen des Gefäßes resuspendiert. Geben Sie 1 ml serologische Kochsalzlösung hinzu und mischen Sie es.

Überführen Sie die Suspension in ein neues Gefäß. Homogenisieren Sie die vaskuläre Suspension unter Verwendung einer 1 ml-Insulinspritze mit einer 26-Gauge-Nadel, während Sie die Suspension in ein neues Gefäß überführen. Führen Sie die mikrobiologische Kontrolle der Suspension durch, indem Sie zwei Tropfen 18 Medium, sieben H neun Hirn-Herz-Infusion hinzufügen.

11 Stein Genesen bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend die routinemäßigen mikrobiologischen Kontrollverfahren durchführen. Für die Z-Färbung.

Stellen Sie eine Verdünnung von eins zu zehn und eine von eins zu hundert der S-Suspension in physiologischer Kochsalzlösung her. Homogenisieren Sie jede Verdünnung, bevor Sie diese Proben zur Zählung vorbereiten. Bereiten Sie drei Objektträger vor, indem Sie mit einem Permanentstift drei Kreise mit einem Innendurchmesser von 10 Millimeter auf die Oberfläche jedes Objektträgers zeichnen.

Umgeben Sie die Kreise nun mit einem Immunhistochemiestift. Beschriften Sie die Präparate mit einem Bleistift der Härtegrad 2, um die Präparate für die drei Saray-Konzentrationen vorzubereiten: unverdünnt, 1:10 und 1:100.

Pipettieren Sie fünf Mikroliter der Phenol-Serum-Lösung und 10 Mikroliter der Sary-Suspension in jeden Kreis, homogenisieren Sie und verteilen Sie die Suspension gleichmäßig über die Fläche des Kreises. Legen Sie diese Objektträger nach dem Trocknen mit dem Griff einer Einwegschleife auf einen ebenen Tisch. Fixieren Sie sie, indem Sie die Objektträger dreimal über die blaue Flamme führen, wobei die Bachelor-Suspensionen nach oben zeigen.

Führen Sie eine Code-Zuni-Stabilisierung durch. Untersuchen Sie diese Präparate. Die drei Verdünnungen.

Wählen Sie die am besten geeignete Verdünnung für die Sary-Zählung aus. Bereiten Sie 200 Mikroliter abgetötete Sary-Suspension durch Autoklavieren der vaskulären Suspension für 30 Minuten bei 121 Grad Celsius vor. Verwenden Sie das L 7 0 0 7 Live-Dead-Hintergrundbeleuchtungs-Kit für die fluoreszierende Färbung von mikrobiellem Lipid.

Bereiten Sie eine Verdünnung von Lösung A im Verhältnis 1 zu 10 und eine Verdünnung von Lösung B im Verhältnis 1 zu 20 unmittelbar vor der Anwendung vor. Geben Sie zu jeweils 200 Mikrolitern der unverdünnten vaskulären Suspension (original und abgetötet) 3,6 Mikroliter der verdünnten Lösung A und 6 Mikroliter der verdünnten Lösung B. Nach 15-minütiger Inkubation im Dunkeln zentrifugieren Sie die Suspension 5 Minuten bei 10.600 ×g und 4 °C. Entfernen Sie das Überstand mit der Pipette wieder.

Suspendieren Sie das Pellet in 50 Mikrolitern 10 % Glycerin und homogenisieren Sie es durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Geben Sie acht Mikroliter jeder Suspension auf einen Objektträger und bedecken Sie sie mit einem kleinen Deckglas. Lichtgeschützt aufbewahren.

Beobachten Sie die Suspensionen unter dem Fluoreszenzmikroskop. Bereiten Sie eine Suspension mit einer Konzentration von 10 bis sieben BA-Lip pro ml zu, zu einem ml Einfriermedium in jedem Kryoröhrchen. Geben Sie anschließend 150 Mikroliter der S-Suspension zu einem ml des Einfriermediums hinzu und homogenisieren Sie durch Vorsichtiges Umstülpen des Röhrchens.

Stellen Sie das Kryoröhrchen in den Gefriermittelbehälter. Halten Sie den Behälter mindestens 24 Stunden bei minus 80 Grad Celsius. Überführen Sie die Röhrchen in eine Lagertube und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius zum Auftauen.

Tauen Sie die gefrorene Suspension in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf. Überführen Sie die Suspension in ein Konikoröhrchen, das 20 ml sterile Kochsalzlösung enthält. Abzentrifugieren.

Die Baline wurde gemäß dem Z-Erhaltungsprotokoll für die Zählung und dem fluoreszierenden Färbeprotokoll zur Bestimmung der Variabilität durchgeführt. Bereiten Sie eine Suspension mit 10 bis acht BA pro Mahlzeit vor und homogenisieren Sie die Suspension, bevor Sie jedes Tier impfen. Ziehen Sie hundert Mikroliter in eine Insulinspritze ein und impfen Sie 30 Mikroliter in die hinteren Fußpolster jedes Tieres zur Bestimmung der Vitalität.

Die grüne Fluoreszenz wird in allen BAI beobachtet, die rote Fluoreszenz hingegen nur in jenem bai. Wenn jene BAI steriler Kontrolle entsprechen, wird dieselbe Intensität an grünem und rotem BAI-Licht beobachtet. Die Inokulation von M Lepar, das über unterschiedliche Zeiträume eingefroren wurde, führt nach sieben Monaten zu einer um das 10- bis 1000-fache erhöhten Anzahl an gewonnenen BAI.

Zum Abschluss möchten wir hinzufügen, dass dieses Protokoll, da IL leid nicht in vitro wächst, eine schnelle und einfache Möglichkeit bietet, lebensfähige yl Leid für weitere Anwendungen im Labor bereitzuhalten.