Motor Nervendurchtrennung und Zeitraffer-Imaging von Gliazellen Verhalten im Live Zebrafisch

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Verhalten von Gliazellen nach einer peripheren Nervenverletzung in lebenden Zebrafischlarven im Zeitraffer abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst anästhesierte Zebrafischlarven in niedrigen Schmelzpunkt-Aros auf Petrischalen mit Glasboden montiert und mit einer Präpariernadel positioniert werden. Als nächstes werden die montierten Larven auf das konfokale Mikroskop gelegt.

Es wird ein Nerv für die Ablation ausgewählt und ein Bild der Axone und Gliazellen des unverletzten Nervs aufgenommen. Dann werden ROIs entlang des Nervs ausgewählt und der Laser wird abgefeuert, um die ausgewählten Bereiche abzutragen und eine Nervendurchtrennung zu erzeugen. Schließlich werden die Axone und Gliazellen nach der Nervendurchtrennung im Zeitraffer abgebildet.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die das dynamische Verhalten von Gliazellen während der Nervendegeneration und -regeneration durch konfokale Zeitraffermikroskopie zeigen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Regeneration und Gliazellbiologie zu beantworten, wie z.B. wie Gliazellen auf Nervenverletzungen reagieren. Und wie koordinieren verschiedene gliale Subtypen ihr Verhalten während der Degeneration und Regeneration?

Nach der Kreuzung adulter Zebrafische, die Transgene enthalten, die Motoneuronen und Gliazelltypen von Interesse fluoreszierend markieren, und der Inkubation der Embryonen bis 24 Stunden nach der Befruchtung oder HPF, entfernen Sie das Eiwasser und ersetzen Sie es durch einen pH-Zahn oder PTU in Eiwasser, bevor Sie die Embryonen wieder in den Inkubator zurückbringen. Von diesem Zeitpunkt an bis etwa 96 HPF verwenden Sie ein Fluoreszenz-Präpariergerät, um Embryonen auf das Vorhandensein des gewünschten fluoreszierenden Gens zu untersuchen. Übertragen Sie positive Embryonen in frisches PTU-Eiwasser und geben Sie sie wieder in den Inkubator.

Wenn die Larven sechs Tage nach der Befruchtung oder DPF erreicht haben, wählen Sie einige Embryonen für die Montage aus und geben Sie sie in eine kleinere Schale. Nehmen Sie das Wasser aus der Schale und ersetzen Sie es sofort durch 0,02%trica In PTU-Eiwasser inkubieren Sie die Larven etwa fünf Minuten lang unter Narkose. Geben Sie ein Eloqua aus 0,8 % niedrigem Schmelze-Agros, das zuvor gemäß dem Textprotokoll zubereitet wurde, in ein Becherglas mit Leitungswasser und einer Mikrowelle.

Lassen Sie den Becher 30 Sekunden lang abkühlen oder bis sich die Agros-Tube lauwarm anfühlt. Bringen Sie als Nächstes eine betäubte Larve in eine 35 Millimeter große Glasbodenschale. Entfernen Sie jegliches Wasser aus der Schüssel.

Bedecken Sie die Larven dann sofort mit so viel warmem Aroma, dass sie den Glasbodenteil der Schüssel füllen. Wenn der Agros aushärtet, legen Sie die Larven mit einer Präpariernadel auf die Seite. Kippen Sie es dann leicht auf den Rücken und achten Sie darauf, dass die montierten Larven das Glas am Boden der Schale berühren, was für Verletzungen und Bildgebung notwendig ist.

Halten Sie die Larven mit der Nadel in Position, bis sich der Agro verfestigt und die Larven immobilisiert sind. Pipettieren Sie dann langsam genug Trica-Wasser in die Schale, um die Agros und Larven vollständig zu bedecken. Schalten Sie alle konfokalen Mikroskopinstrumente, geeignete Diodenlaser zur Anregung von Zebrafisch-Transgenen und den stickstoffgepumpten Farbstofflaser ein.

Stellen Sie sicher, dass der leere Strahlteiler an Ort und Stelle ist und der 435-Nanometer-Koer und die Farbstoffzelle an Ort und Stelle sind. Öffnen Sie den Laserabschwächer vollständig und öffnen Sie dann die Bildgebungssoftware mit der 63 x 1,2 na Wasserimmersionslinse und einem Glasobjektträger mit einer verspiegelten Seite. Verwenden Sie Hellfeldbeleuchtung, um einen Kratzer oder eine Ätzung im Spiegel zu finden und zu fokussieren.

Mit der Imaging-Software können Sie die Ätzungen auf dem Computerbildschirm von dem Fenster aus anzeigen und fokussieren, in dem die Laserkalibrierung und die Leistungseinstellungen gesteuert werden. Stellen Sie die Anzahl der Impulse auf eins und die Dämpfung auf 3% Übertragung aus der Hauptsymbolleiste ein. Wählen Sie das Ellipsenwerkzeug aus und klicken Sie auf das Bild auf dem Computerbildschirm.

Um einen einzelnen kreisförmigen ROI zu erstellen, wiederholen Sie den Vorgang drei weitere Male, bis vier kreisförmige RI vorhanden sind, die zufällig über das Bild verteilt sind. Feuern Sie als Nächstes den Laser ab. Wenn der Laser richtig funktioniert und kalibriert ist, entstehen vier kleine Punktätzungen, eine in jedem kreisförmigen ROI. Nehmen Sie dann den Objektträger vom Mikroskoptisch und reinigen Sie das Objektiv.

Ersetzen Sie den leeren Strahlteiler durch den 100%ILL-Strahlteiler, um einen motorischen Nerv mittels Laserablation zu durchtrennen. Tragen Sie einen kleinen Tropfen Wasserimmersionsmedium auf das Objektiv auf und stellen Sie die Schale mit der montierten Larve mit Klammern auf den entsprechenden Tisch, um sie mit dem Okular und der Weitfeldbeleuchtung zu stabilisieren. Konzentrieren Sie sich auf die Larven und lokalisieren Sie die Motoneuronen.

Scannen Sie die Nerven in den Hemisegmenten 10 bis 20 und wählen Sie einen motorischen Nerv für die Durchtrennung aus. Rufen Sie als Nächstes eine Live-Ansicht des Nervs auf dem Computerbildschirm auf. Wählen Sie die Z-Ebenen und nehmen Sie ein Bild der Axone und Gliazellen des unverletzten Nervs auf.

Bereiten Sie dann Zeitraffer-Bildgebungseinstellungen vor, um Z-Projektionen aller Zelltypen in Intervallen von fünf bis 30 Minuten zu erfassen. Je nach Experiment den 100%ILL-Strahlteiler entfernen und durch den Rohling ersetzen. Kehren Sie zur Live-Ansicht des Nervs zurück und verwenden Sie den entsprechenden Fluoreszenzkanal, um die Axone zu betrachten, die durchtrennt werden.

Erstellen Sie mit dem Ellipsenwerkzeug einen dünnen elliptischen ROI in dem Bereich, der abgetragen werden soll. Erstellen Sie dann kleinere ROIs innerhalb des ausgewählten Bereichs in dem Fenster, in dem die Lasereinstellungen gesteuert werden. Stellen Sie die Anzahl der Impulse auf zwei und die Dämpfungsplatte auf 18% Transmission.

Feuern Sie dann den Laser innerhalb der ausgewählten ROIs ab. Warten Sie 10 oder mehr Sekunden und überprüfen Sie den abgetragenen Bereich erneut auf Fluoreszenz. Beachten Sie, dass ein ROI zunächst abgetragen erscheinen kann, wenn er tatsächlich fotogebleicht ist, und dass die ROIs im Verlauf der Ablation möglicherweise leicht geändert werden müssen, um eine vollständige Durchtrennung zu erreichen.

Wenn die Fluoreszenz zurückkehrt, erhöhen Sie die Laserleistung und zünden Sie den Laser. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Fluoreszenz innerhalb des R OIS verschwindet und innerhalb von 10 Sekunden nicht zurückkehrt. Sobald die Ablation abgeschlossen ist, beginnen Sie mit der Zeitrafferbildgebung, wenn der Zeitraffer abgeschlossen ist.

Verwenden Sie Imaging-Software, um Daten zu kompilieren und farbige Komposit-Z-Projektionen für jeden Zeitpunkt zu erstellen. Erstellen Sie einen schnellen Zeitfilm, um das Verhalten von Axon-Gliazellen gleichzeitig zu analysieren. Der hier beschriebene Assay kann verwendet werden, um die Reaktion von Gliazellen und anderen nervenassoziierten Zellpopulationen auf axonale Schädigung in vivo zu beurteilen.

Hier ist ein Beispiel für eine Nervenverletzung, die mit dieser Methode erzeugt wurde, und die Reaktion der umgebenden Gliazellen. Das Experiment wurde an sechs DPF-transgenen Zebrafischen durchgeführt, die eine Membran exprimierten, die auf EGFP in perineuralen ggl und zytosolisches DS-Rot in Motoneuronen ausdrückte. Die Verletzung erfolgte entlang der rostralen Projektion eines motorischen Nervus des Rumpfes, der dann im Zeitraffer sowohl im EGFP- als auch im DS-Rotkanal aufgenommen wurde.

Dies ermöglichte die gleichzeitige Visualisierung des Verhaltens von Axon- und Gliazellen unmittelbar nach der Verletzung. Bei diesen Bildern handelt es sich um statische Zeitpunkte aus dem Zeitrafferfilm. Die gestrichelte Ellipse zeigt den ROI, der mit dem Laser nach einer Minute abgetragen wurde.

Nach der Transsektion oder MPT fehlte dem abgetragenen Bereich die Fluoreszenz und die Verletzungszone maß etwa 3,5 Mikrometer vom proximalen zum distalen Stumpf. Der Erfolg einer Durchtrennung kann durch die Darstellung des distalen Nervenstumpfes und die Suche nach Anzeichen einer Wallerschen Degeneration, einschließlich distaler Axonfragmentierung und schneller Clearance, bestätigt werden. Das Fehlen einer axonalen Fluoreszenz entlang des distalen Stumpfes bei 120 MPT deutet darauf hin, dass diese Axone tatsächlich eine Wallersche Degeneration durchlaufen haben und die Transaktion erfolgreich war.

Die Einstellung der Laserleistung auf eine ideale Einstellung ist bei der Durchführung von Laserablationsexperimenten von entscheidender Bedeutung. Ideale Laserleistungseinstellungen tragen den Nerv nur innerhalb des gewählten ROI sauber ab, und Laserleistungseinstellungen, die entweder zu niedrig oder zu hoch sind, führen zu suboptimalen Ergebnissen. Hier sehen Sie eine Verletzung, die mit einer zu geringen Laserleistung durchgeführt wurde. Die Fluoreszenz blieb nach dem Abfeuern des Lasers innerhalb des ROI, was zu einer unvollständigen Durchtrennung führte.

Auf der anderen Seite, wie in dieser Abbildung gezeigt, erzeugte eine zu hohe Laserleistung einen extrem großen Abtrag. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zebrafische für Laserdurchtrennungsexperimente montiert. Erstellen Sie eine Durchtrennung mit einem Stickstoffpump-Farbstofflaser und beurteilen Sie die Reaktion der umgebenden Zellen mithilfe der konfokalen Zeitrafferbildgebung.