Motor Nervendurchtrennung und Zeitraffer-Imaging von Gliazellen Verhalten im Live Zebrafisch

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Verhalten von Gliazellen nach einer peripheren Nervenverletzung in lebenden Zebrafischlarven mittels Zeitrafferaufnahmen zu dokumentieren. Dazu werden zunächst anesthetisierte Zebrafischlarven in niedrig schmelzendem Agarose auf Petrischalen mit Glasboden fixiert und mit einer Präparationsnadel positioniert. Anschließend wird die fixierte Larve auf dem konfokalen Mikroskop platziert.

Ein Nerv wird zur Ablation ausgewählt und ein Bild der Axone und Gliazellen des verletzten Nervs aufgenommen. Anschließend werden ROIs entlang des Nervs ausgewählt und der Laser abgefeuert, um die ausgewählten Bereiche zu ablieren und so eine Nervendurchtrennung zu erzeugen. Schließlich werden die Axone und Gliazellen im Zeitrafferverfahren nach der Nervendurchtrennung abgebildet.

Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die das dynamische Verhalten von Gliazellen während der Nervendegeneration und -regeneration mittels zeitraffender konfokaler Mikroskopie zeigen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Regeneration und Gliazellbiologie zu beantworten, beispielsweise: Wie reagieren Gliazellen auf eine Nervenverletzung? Und wie koordinieren unterschiedliche Gliazellsubtypen ihr Verhalten während Degeneration und Regeneration?

Nachdem adulte Zebrafische, die Transgene enthalten, die motorische Neuronen und interessierende gliale Zelltypen fluoreszenzmarkiert darstellen, gekreuzt wurden und die Embryonen bis zu 24 Stunden nach der Befruchtung oder HPF inkubiert wurden, entfernen Sie das Ei-Wasser und ersetzen es durch Ei-Wasser mit einem pH-Zahn-Threa oder PTU, bevor Sie die Embryonen wieder in den Inkubator zurückbringen. Ab diesem Zeitpunkt bis etwa 96 HPF verwenden Sie ein fluoreszenzmikroskopisches Auflichtmikroskop, um die Embryonen auf das Vorhandensein des gewünschten fluoreszierenden Gens zu untersuchen. Überführen Sie positive Embryonen in frisches PTU-Ei-Wasser und bringen Sie sie zurück in den Inkubator.

Wenn die Larven sechs Tage nach der Befruchtung (DPF) erreicht haben, wählen Sie einige Embryonen zum Einbetten aus und überführen Sie sie in eine kleinere Schale. Entfernen Sie das Wasser aus der Schale und ersetzen Sie es unmittelbar durch 0,02 % Trica in PTU-Ei-Wasser. Inkubieren Sie die Larven etwa fünf Minuten in dem Anästhetikum. Geben Sie ein Eloqua mit 0,8 % Low-Melt-Agarose, das gemäß dem schriftlichen Protokoll vorbereitet wurde, in einen Becher mit Leitungswasser und erwärmen Sie es in der Mikrowelle.

Kühlen Sie das Becherglas 30 Sekunden lang oder bis das Agar geschmolzen ist, bis das Agar-Röhrchen sich lauwarm anfühlt. Übertragen Sie danach eine anästhesierte Larve in eine 35-Millimeter-Glasboden-Dish und entfernen Sie jegliches Wasser in der Schale.

Dann die Larven sofort mit ausreichend warmem Agarose bedecken, um den glasbodigen Teil der Schale zu füllen. Während die Agarose erstarrt, eine Präpariernadel verwenden, um die Larven seitlich zu positionieren. Anschließend leicht auf den Rücken neigen und sicherstellen, dass die montierte Larve die Glasunterseite der Schale berührt, was für die Verletzung und die Bildgebung erforderlich ist.

Verwenden Sie die Nadel, um die Larven in Position zu halten, bis das Agar erstarrt ist und die Larven immobilisiert sind. Pipettieren Sie dann langsam so viel Trica-Wasser in die Schale, dass die Agaros und Larven vollständig bedeckt sind. Schalten Sie alle Geräte des konfokalen Mikroskops ein, die geeigneten Diodenlaser zur Anregung der Zebrafisch-Transgene sowie den mit Stickstoff betriebenen Farbstofflaser.

Stellen Sie sicher, dass der leere Strahlteiler eingesetzt ist und die 435-Nanometer-Kohärenz- und Farbstoffzelle an ihrem Platz ist. Öffnen Sie den Laser-Attenuator vollständig und starten Sie dann die Bildgebungssoftware mit dem 63x/1,2-NA-Wasserimmersionsobjektiv und einem Glasobjektträger mit einer verspiegelten Seite. Verwenden Sie Durchlichtbeleuchtung, um einen Kratzer oder eine Gravur auf dem Spiegel zu finden und darauf zu fokussieren.

Öffnen Sie mithilfe der Bildverarbeitungssoftware die Gravuren auf dem Computerbildschirm im Fenster, das die Laserkalibrierung und Leistungseinstellungen steuert. Stellen Sie die Anzahl der Impulse auf eins und die Dämpfung auf 3 % Transmission über die Hauptwerkzeugleiste ein. Wählen Sie das Ellipsen-Werkzeug und klicken Sie auf das Bild auf dem Computerbildschirm.

Um eine einzelne kreisförmige ROI zu erstellen, wiederholen Sie den Vorgang noch dreimal, bis sich vier kreisförmige ROI zufällig über das Bild verteilt befinden. Danach wird der Laser ausgelöst. Wenn der Laser ordnungsgemäß funktioniert und kalibriert ist, entstehen vier kleine Markierungspunkte, jeweils innerhalb einer kreisförmigen ROI. Anschließend wird die Objektträgerplatte von der Mikroskopbühne entfernt und die Objektivlinse gereinigt.

Ersetzen Sie den leeren Strahlteiler durch den 100 % ILL-Strahlteiler, um mittels Laserablation einen motorischen Nerv zu durchtrennen. Geben Sie einen kleinen Tropfen Immersionsmittel für die Wassereinbettung auf das Objektiv und platzieren Sie die Schale mit dem montierten Larvenpräparat mithilfe von Clips zur Stabilisierung auf dem entsprechenden Objekttisch, wobei Sie das Okular und die Weitfeldbeleuchtung verwenden. Fokussieren Sie die Larven und lokalisieren Sie die motorischen Neuronen.

Scannen Sie die Nerven in den Hemi-Segmenten 10 bis 20 und wählen Sie einen motorischen Nerv für die Durchtrennung aus. Rufen Sie anschließend eine Live-Ansicht des Nervs auf dem Computerbildschirm auf. Wählen Sie Z-Ebenen aus und nehmen Sie ein Bild der Axone und Gliazellen des verletzten Nervs auf.

Bereiten Sie dann die Einstellungen für die Zeitrafferaufnahmen vor, um alle Zelltypen in Zeitabständen von fünf bis dreißig Minuten als Z-Projektionen aufzuzeichnen. Entfernen Sie je nach Experiment den 100 % ILL-Strahlteiler und ersetzen Sie ihn durch den Blindverschluss. Kehren Sie zur Live-Ansicht des Nervs zurück und verwenden Sie den geeigneten fluoreszierenden Kanal, um die Axone zu betrachten, die durchtrennt werden sollen.

Erstellen Sie mithilfe des Ellipsenwerkzeugs eine dünne, elliptische ROI in dem Bereich, der ablatiert werden soll. Erstellen Sie anschließend kleinere ROIs innerhalb des ausgewählten Bereichs im Fenster, das die Laser-Einstellungen steuert. Stellen Sie die Anzahl der Impulse auf zwei und die Dämpfungsplatte auf 18 % Transmission ein.

Feuern Sie dann den Laser innerhalb der ausgewählten ROIs ab. Warten Sie 10 oder mehr Sekunden und überprüfen Sie den ablatierten Bereich erneut auf Fluoreszenz. Beachten Sie, dass ein ROI anfänglich ablatiert erscheinen kann, obwohl er tatsächlich photobleicht ist, und dass die ROIs während des Ablationsverlaufs geringfügig angepasst werden müssen, um eine vollständige Durchtrennung zu erreichen.

Wenn die Fluoreszenz zurückkehrt, erhöhen Sie die Laserleistung und feuern Sie den Laser erneut ab. Wiederholen Sie dies erneut, bis die Fluoreszenz innerhalb des R-OIS verschwindet und innerhalb von 10 Sekunden nicht zurückkehrt. Sobald die Ablation abgeschlossen ist, beginnen Sie die Zeitrafferaufnahme, sobald die Zeitrafferaufnahme abgeschlossen ist.

Verwenden Sie Bildgebungssoftware, um Daten zu sammeln und farbige zusammengesetzte Z-Projektionen für jeden Zeitpunkt zu erstellen. Erstellen Sie einen kurzen Zeitschrittfilm, um das Verhalten von Axonen und Gliazellen gleichzeitig zu analysieren. Der hier beschriebene Test kann verwendet werden, um die Reaktion von Gliazellen und anderen nervenassoziierten Zellpopulationen auf axonale Verletzungen in vivo zu bewerten.

Hier ist ein Beispiel einer Nervenverletzung dargestellt, die mit dieser Methode erzeugt wurde, sowie die Reaktion der umgebenden glialen Zellen. Das Experiment wurde an sechs transgenen Zebrafischen mit DPF durchgeführt, die ein membrangezieltes EGFP in perineuralen ggl und zytoplasmatisches DS-Red in Motoneuronen exprimierten. Die Verletzung wurde entlang der rostralen Projektion eines Rumpfmotornervs erzeugt und anschließend im Zeitraffer sowohl in den EGFP- als auch in den DS-Red-Kanälen abgebildet.

Dies ermöglichte die gleichzeitige Visualisierung von Axon- und Gliazellverhalten unmittelbar nach der Verletzung. Diese Bilder stellen statische Zeitpunkte dar, die aus dem Zeitraffervideo entnommen wurden. Die gestrichelte Ellipse zeigt die ROI, die mit dem Laser nach einer Minute ablatiert wurde.

Nach der Durchtrennung oder MPT wies der ablatierte Bereich keine Fluoreszenz auf, und die Verletzungszone maß etwa 3,5 Mikrometer vom proximalen bis zum distalen Stumpf. Der Erfolg einer Durchtrennung kann durch Abbildung des distalen Nervenstumpfs und Suche nach Anzeichen einer wallerischen Degeneration bestätigt werden, einschließlich Fragmentierung der distalen Axone und schneller Clearance. Das Fehlen axonaler Fluoreszenz entlang des distalen Stumpfs bei 120 MPT zeigt an, dass diese Axone tatsächlich eine wallerische Degeneration durchlaufen haben und die Durchtrennung erfolgreich war.

Die Einstellung der Laserleistung auf einen idealen Wert ist entscheidend für die Durchführung von Laser-Ablations-Experimenten. Ideale Laserleistungseinstellungen führen dazu, dass der Nerv innerhalb der ausgewählten ROI sauber ablatiert wird. Zu niedrige oder zu hohe Laserleistungseinstellungen führen hingegen zu suboptimalen Ergebnissen. Hier ist eine Verletzung dargestellt, die mit einer zu niedrigen Laserleistung erzeugt wurde. Die Fluoreszenz blieb nach dem Abfeuern des Lasers innerhalb der ROI erhalten, was auf eine unvollständige Durchtrennung hinweist.

Andererseits führte, wie in dieser Abbildung gezeigt, eine zu hohe Laserleistung zu einer äußerst großen Ablation. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie gut verstehen, wie man Zebrabärblinge für Laserpräparationsexperimente präpariert. Erzeugen Sie eine Präparation mittels eines mit Stickstoff gepumpten Farbstofflasers und bewerten Sie die Reaktion der umgebenden Zellen mittels zeitraffender konfokaler Bildgebung.