Automatisierte Hochdurchsatz-Analysen in Behavioral Zebrafischlarven

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Verhaltensstörungen bei Zebrafischlarven nach der Behandlung mit Giftstoffen oder Arzneimitteln zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem die Embryonen oder Larven zunächst gesammelt und bis zu den ersten sieben Tagen der Entwicklung mit Chemikalien behandelt werden. Der zweite Schritt besteht darin, Agro-Schwimmbahnen mit speziell entwickelten Formen herzustellen.

Anschließend werden die behandelten Larven zur Verhaltensanalyse mittels Zeitrafferfotografie in die Agros-Lanes gebracht. Der letzte Schritt besteht darin, die Bilder in Bild J zu importieren und ein spezifisches, intern geschriebenes Makro zu verwenden, um XY-Koordinatendaten der Larven in den Bahnen zu sammeln. Letztendlich wird der Hochdurchsatz-Verhaltensassay verwendet, um Unterschiede im Vermeidungs- und Figma-Achsen-Verhalten sowie in der Schwimmgeschwindigkeit und -ruhe zwischen den Behandlungsgruppen zu finden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie sie kommerziell erhältlich sind, besteht darin, dass wir unsere Methode verwenden können, um komplexere Verhaltensweisen zu beobachten. Es ist auch kostengünstig zu bauen und einfach einzurichten. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Verhaltensneurowissenschaften zu beantworten, z. B. wie Giftstoffe die Entwicklung und das Verhalten des Gehirns während der frühen embryonalen Exposition beeinflussen.

Es kann auch Einblicke in subtile Hirndefekte beim Menschen geben, die von anderen aktuellen Toxizitätsscreenings nicht gefunden werden können. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da das Fangen der Larven schwierig sein kann. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte eine Lernkurve aufweisen, da es sich bei dem Protokoll um kundenspezifische Systeme handelt.

Um diesen Vorgang zu starten, legen Sie Pyrex-Glasschalen mit künstlichem Gras aus grünem Garn in die Tanks. Lassen Sie die Schalen im Morgengrauen zwei Stunden lang in den Becken, um Zebrafischembryonen zu sammeln. Gießen Sie die Glasschalen mit den Embryonen über den Rand eines Handsiebs mit deionisiertem Wasser.

Als nächstes züchten Sie die Embryonen in Eiwasser, das 60 Milligramm pro Liter Instant-Ozean in deionisiertem Wasser und 0,25 Milligramm pro Liter Methylenblau enthält, das als Schimmelhemmer verwendet wird. Die Embryonen können mit 50 bis 60 Larven pro 50 Milliliter oder in größeren Zuchtbecken untergebracht werden, bis die Embryonen bereit sind, mit Giftstoffen behandelt zu werden. Abhängig von der Hypothese des einzelnen Experiments können Embryonen sofort oder in bestimmten Entwicklungsstadien mit Giftstoffen oder Arzneimitteln behandelt werden, die in der Regel in DMSO aufgelöst und dann direkt im Eiwassermedium weiter verdünnt werden.

Die blaue Farbe wird zu Videodemonstrationszwecken bei der Embryonal- und Larvenbehandlung verwendet. Die Larven und Embryonen können in tiefen Petrischalen mit einer Dichte von etwa 50 bis 60 Larven pro 50 Milliliter untergebracht werden, bis die Verhaltensanalyse sieben Tage nach der Befruchtung die Eiwasserlösung mindestens alle zwei Tage wechselt, um Pilz- oder Bakterienwachstum aus den toten Embryonen zu vermeiden. Es wurden Kunststoffformen hergestellt, um Bahnen mit Aros zu erzeugen, die von Thermos Scientific in Kunststoffplatten mit einer Vertiefung gegossen werden.

Die Formen enthalten fünf Bahnen, bei denen die Seiten um 60 Grad abgewinkelt sind. Sehen Sie sich das Textprotokoll zu diesem Video an, um die Abmessungen der Formen und Platten zu erfahren? Bereiten Sie zunächst die Aros vor, indem Sie 0,8 % Aros in deionisiertem Wasser mit 60 Milligramm pro Liter Instant-Ozean schmelzen.

Generieren Sie als Nächstes die Bahnen, indem Sie 50 Milliliter des geschmolzenen Aros in eine einzelne Well-Platte gießen. Setzen Sie dann die Form ganz langsam auf die flüssigen Arros, um jegliche Blasenbildung zu verhindern. Entfernen Sie den Schimmel, wenn der Aros abgekühlt ist.

Die aros Lanes können bei Raumtemperatur mit den Deckeln auf dem Geschirr bis zu 36 Stunden gelagert werden. Für die Verhaltensanalyse mit hohem Durchsatz werden bildgebende Schränke mit einer 15-Megapixel-Digitalkamera vorbereitet, die an der Oberseite des Schranks angebracht ist und nach unten zeigt. Ein Laptop mit 15,6-Zoll-Bildschirm wird mit dem Bildschirm nach oben platziert.

Um eine Überhitzung der Larven zu vermeiden, verwenden Sie am besten einen Laptop mit einer Bildschirmtemperatur, die 28 Grad Celsius nicht überschreitet. Platzieren Sie einen Kunststoffdiffusor auf dem Laptop-Bildschirm, auf dem die Agros-Platten platziert werden. Der Diffusor verhindert weitere Muster in den gesammelten Bildern.

Um mit der Bildaufnahme zu beginnen, bewegen Sie die Larven vorsichtig von der Petrischale in die Agros-Spur, um den Stress der Larven zu reduzieren. Bis zu 20 Larven können in jeder Bahn platziert werden, aber in der Regel werden fünf Larven pro Bahn verwendet, um die genaueste Verfolgung der Schwimmgeschwindigkeit zu erleichtern und die Anzahl der Larven zu reduzieren, die pro Experiment benötigt werden, füllen Sie die Bahnen mit Eiwasser, je nach Experiment mit oder ohne Arzneimittel oder Giftstoffe. Füllen Sie die Bahnen nicht vollständig aus, bis sie in die Bildschränke gelegt werden, um ein Überlaufen zu vermeiden.

Warten Sie 10 Minuten, bis sich die Larven nach der Eingewöhnungsphase akklimatisiert haben. Positionieren Sie vier Platten von Hand direkt auf dem Laptop-Bildschirm. Zu diesem Zeitpunkt können die Fahrspuren mit Ei, Wasser oder chemischer Behandlung aufgefüllt werden, so dass sie auf gleicher Höhe mit dem oberen Ende der Fahrspur sind, um Schatten an den Rändern der Fahrspuren zu vermeiden.

In den Bildern programmiert der Computer für Zeitrafferfotografie, indem er alle sechs Sekunden Bilder aufnimmt, also insgesamt 300 Bilder pro Experiment. Stellen Sie die Kamera auf eine niedrigere Auflösung ein, um die Bildgebung mit Videogeschwindigkeit zu ermöglichen. Während die niedrigere Auflösung die Aufnahmen auf eine einzige Multi-Well-Platte beschränkt.

Die Videoaufzeichnungen eignen sich für die Abbildung von Schnellschwimmwettbewerben. Verwenden Sie in dieser Demonstration eine PowerPoint-Präsentation als aversiven Stimulus für die Larven. Die PowerPoint-Präsentation beginnt mit einem leeren weißen Hintergrund für 15 Minuten, gefolgt von 15 Minuten eines sich bewegenden roten Balkens in der oberen Hälfte der Platte.

Um eine Verdunstung der Flüssigkeit innerhalb der aros-Lanes zu vermeiden, halten Sie die maximale Bildgebungszeit auf unter einer Stunde. Öffnen Sie die Bilder mit Bild J in dieser Demonstration. Dabei kommt ein hauseigenes Makro für die fünfbahnige Larvenanalyse zum Einsatz und kann jedem Anwender zur Verfügung gestellt werden.

Verwenden Sie die Eingabeaufforderungen im Makro, um die Parameter festzulegen, z. B. die Anzahl der Bilder und die Farbe, die subtrahiert werden sollen. Das Makro teilt dann automatisch den Farbkanal auf, sodass die rote Farbe entfernt werden kann. Subtrahiert den Hintergrund, wendet einen Schwellenwert an und identifiziert die Larven durch Partikelanalyse.

Nachdem alle Bilder das Bild-J-Makro durchlaufen haben, wird eine Ergebnisdatei angezeigt, die die XY-Koordinaten der einzelnen Larven für jedes Bild sowie die Bildnummer und die Spurnummer enthält. Speichern Sie die Ergebnisdatei in einem Excel-Format, und sortieren Sie sie basierend auf dem leeren Hintergrund im Vergleich zum Hintergrund des beweglichen Balkens und dann nach der Well-Nummer. Verwenden Sie eine Excel-Vorlage mit integrierten Gleichungen, um die Platzierung der Larven in den Vertiefungen, den Abstand zwischen den Larven, die Geschwindigkeit der Bewegung und die Ruhezeit automatisch zu bestimmen.

Die aktuellste Excel-Vorlage, die im Cretin-Labor erstellt wurde, ist auf Anfrage erhältlich, um Diagramme zu erstellen, die verschiedene Behandlungsgruppen in der Excel-Tabelle anzeigen, zusammen mit einem T-Test zum Vergleich zwischen Behandlungsgruppen und Kontrollen. Weitere statistische Analysen können mit dem Statistikprogramm SPSS durchgeführt werden. Die Ergebnisse wurden für Larven gezeigt, die mit Eiwasser und DMSO als Kontrollen behandelt wurden, und für unterschiedliche Konzentrationen eines Organophosphat-Pestizids, das häufig in nicht-biologischen Lebensmitteln vorkommt.

Hier zeigen die weißen Balken Daten von Larven, die einem leeren Hintergrund ausgesetzt waren, und die roten Balken zeigen Daten von Larven, die dem roten beweglichen Balken ausgesetzt waren. Steuerung. Larven, die in Eiwasser gezüchtet werden, zeigen eine erhöhte Vorliebe, unten in der Schale zu sein, nachdem ihnen der bewegliche rote Balken präsentiert wird. Ähnliche Ergebnisse werden erzielt, wenn Larven in Eiwasser gezüchtet werden, das ein Mikrogramm pro Milliliter DMSO enthält, ein Lösungsmittel, das üblicherweise zum Auflösen verschiedener Pharmazeutika und Giftstoffe als 1000-fache Stammlösungen verwendet wird.

Die Diagramme zeigen die Messungen, die aus der Verhaltensanalyse gewonnen werden können, einschließlich des Prozentsatzes der Larven unten in der Bahn, des Prozentsatzes der Larven am Ende der Bahn, des Prozentsatzes der Larven am Rand der Bahn, des Abstands zwischen der Schwimmgeschwindigkeit der Fische und des Prozentsatzes der Ruhezeit der Larven. Bei den gezeigten Ergebnissen handelt es sich um eine Stichprobe aus einem Experiment. Bei Wiederholung zeigen die Ergebnisse jedoch, dass die Schwimmgeschwindigkeit und das Figma-Verhalten durch niedrige Konzentrationen von Organophosphat-Pestiziden verändert werden, die den Gehalt in der menschlichen Nahrung nachahmen. Einmal gemeistert, kann die Bildgebung und die bildgebende Analyse in anderthalb Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Der wichtigste Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, daran zu denken, das Kulturmedium sauber zu halten, indem es täglich durch ein neues Medium ersetzt wird.