Isolierung und chemische Charakterisierung von Lipid A von gramnegativen Bakterien

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Lipopolysaccharid von der äußeren Oberfläche gramnegativer Bakterien zu isolieren und den Lipid-A-Anteil mithilfe von Tandem-MS-Protokollen strukturell zu charakterisieren. Dies wird durch chemische Extraktion von Lipopolysaccharid aus der bakteriellen Zelloberfläche und anschließende milde saure Hydrolyse erreicht, um Lipid A vom Polysaccharidanteil des Lipopolysaccharids zu lösen. Im zweiten Schritt wird eine Lösung von Lipid A mittels Elektrospray-Ionisations-MS/MS analysiert.

In unserem Verfahren wird Lipid A entweder durch kollisionsinduzierte Dissoziation oder UV-Photodissoziation basierende MS/MS zur strukturellen Charakterisierung analysiert. Die Ergebnisse zeigen Unterschiede in den Fragmentierungsmustern der Massenspektren, die entweder aus kollisionsinduzierter Dissoziation oder aus UV-Photodissoziation basierenden MS/MS-Protokollen stammen, wobei UVPD ein aussagekräftigeres Fragmentierungsmuster liefert. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden liegt darin, dass die Tandem-Massenspektrometrie die Aufklärung der Zielanalyten anhand der Interpretation diagnostischer Fragmentierungsmuster ermöglicht.

Ultraviolette Fotos, insbesondere die Dissociation, sind eine Hochenergie-Massenspektrometrie-Methode (MS/MS), die vielfältigere Fragmentionen erzeugt als etablierte Verfahren wie die kollisionsinduzierte Dissociation. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die hier verwendete UVPD-Massenspektrometrie-Methode bisher nicht kommerzialisiert ist. Zudem verwendet das Verfahren einen Laser, der durch eine individuelle Modifikation vor Beginn des Verfahrens in ein Massenspektrometer integriert wurde.

Die Zellen aus einer 250 ml bakteriellen Kultur gewinnen, indem die Zellen bei vier Grad Celsius 10 Minuten lang mit 10.000 × g zentrifugiert werden. Dann das überstehende Medium abgießen, den Zellpellet mit 50 ml 1× PBS waschen. Nach erneuter Zentrifugation zur Wiedergewinnung des Pellets das Überstand abgießen.

Suspendieren Sie die Zellen anschließend erneut in 40 µL 1× PBS und verteilen Sie sie auf zwei 250-µL-Teflon-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 25 µL Chloroform und 50 µL Methanol zu jedem Röhrchen, um eine einphasige, durchmischte Lösung zu erhalten. Mischen Sie durch Umstülpen und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für mindestens 20 Minuten.

Um eine vollständige Zelllyse sicherzustellen, zentrifugieren Sie die Mischung bei 2000 ×g für 20 Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie das LPS-Pellet mit etwa 100 ml einer einphasigen Bly-dire-Mischung. Zentrifugieren Sie erneut bei 2000 ×g für 20 Minuten und entfernen Sie den Überstand.

Geben Sie 27 ml milden Puffer für die saure Hydrolyse zum LPS-Pellet hinzu und mischen Sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren, bis nur noch kleine Partikel vorhanden sind; suspendieren Sie das LPS-Pellet homogen mittels Probe-Sonikator bei einem konstanten Tastverhältnis 20 Sekunden lang mit 50 % Ausgabeleistung. Wiederholen Sie die Sonikation der Probe zwei Mal mit jeweils 20 Sekunden pro Impuls und etwa fünf Sekunden Pause zwischen den Impulsen.

Anschließend die Proben 30 Minuten lang in einem Wasserbad erhitzen. Die Röhrchen aus dem Wasserbad nehmen und die Probe auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Vor dem Fortfahren zur Extraktion von Lipid A nach der Hydrolyse die SDS-Lösung in eine zweiphasige BLY-dire-Mischung umwandeln, indem 30 ml Chloroform und 30 ml Methanol hinzugefügt werden, um eine Chloroform-Methanol-Puffermischung für die milde saure Hydrolyse herzustellen, die durch Umstülpen gemischt und zentrifugiert wird.

Die S-Probe 10 Minuten bei 2000 × g zentrifugieren. Mit einer Glaspipette die untere Phase in ein sauberes Teflon-Zentrifugenröhrchen abpipettieren. Anschließend eine zweite Extraktion durchführen, indem 30 ml der unteren Phase aus einer vorab equilibrierten zweiphasigen Bly-dire-Mischung zur oberen Phase im Probenröhrchen gegeben, durch Umstülpen gemischt und 10 Minuten bei 2000 × g zentrifugiert werden. Die untere Phase mit einer Glaspipette abpipettieren und mit der zuvor extrahierten unteren Phase vereinigen.

Waschen Sie die gesammelten unteren Phasen, indem Sie 114 ml vorgleichgewichtete obere Bly-Dire-Phase hinzufügen, um ein zweiphasiges Bly-Dire-Gemisch zu erzeugen, das durch Inversion gemischt und zentrifugiert wird. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang mit 2000 × g unter Verwendung einer Glas-Pipette. Überführen Sie die untere Phase in einen sauberen Glas-Abdestillierkolben und trocknen Sie die Probe mittels Rotationsverdampfung.

Fügen Sie anschließend fünf Milliliter einer Chloroform-Methanol-Mischung zum Rundkolben hinzu und behandeln Sie die Lösung mindestens 30 Sekunden lang im Ultraschallbad, um die Suspension von Lipid A von den Wänden des Kolbens zu unterstützen. Überführen Sie das Lipid mithilfe einer Glas-Transferpipette in ein sauberes Glasrohr mit einem verschließbaren Phenolkolbenstopfen, der mit A-P-T-F-E ausgekleidet ist.

Trocknen Sie die Probe unter einem Stickstoffstrom mit einem Stickstofftrockner. Resuspendieren Sie das getrocknete Lipid in einem Milliliter einer Chloroform-Methanol-Mischung. Nach Zugabe des Lösungsmittels wirbeln Sie die Mischung, um eine vollständige Resuspendierung sicherzustellen.

In ein kleines Glasprobenfläschchen überführen und mit einem Stickstofftrockner trocknen. Die getrocknete Probe bei minus 20 Grad Celsius lagern, bis eine anschließende Dünnschichtchromatographie (TLC) oder MS-Analyse erfolgt. Die Probe kann bei minus 20 Grad Celsius bis zur späteren Analyse aufbewahrt werden.

Nach der Probenvorbereitung 200 Mikroliter HPLC-Reinheitsgrad-Methanol mit 200 Mikrolitern HPLC-Reinheitsgrad-Chloroform in einer leeren kleinen Glasprobegefäß mischen, 200 Mikroliter der Chloroform-Methanol-Lösungsmittelmischung zu dem Gefäß mit Lipid A überführen und den Inhalt für fünf Minuten oder bis zur vollständigen Auflösung des Materials beschallen. Danach das Massenspektrometer für die negative Elektrospray-Ionisation einstellen und eine 250-Mikroliter-Spritze mit der Lipid-A-Lösung befüllen.

Setzen Sie die Spritze in eine Spritzenpumpe ein und geben Sie das verdünnte Lipid direkt ein. Führen Sie eine Probe mit einer Fließgeschwindigkeit von 2,0 bis 3,5 Mikrolitern pro Minute zu. Optimieren und verstärken Sie das Lipid-Ionsignal durch Abstimmung der Ionenoptik.

Sammlen Sie das Massenspektrum des Lipids. Isolieren und aktivieren Sie die Ziel-Lipid-A-Spezies, indem Sie CID als MSM-Methode auswählen. Erhöhen Sie anschließend die CID-Spannung oder die normalisierte Kollisionsenergie, bis das Vorläuferlipid fragmentiert wird.

Eine Art weist eine relative Abundanz von etwa 10 % im Vergleich zum intensivsten Produktionen auf; mitteln Sie die Spektren, bis ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis erreicht ist. Für die Produktionen bereiten Sie die Probe und das Massenspektrometer wie im vorherigen Abschnitt beschrieben vor. Schalten Sie den mit dem Massenspektrometer verbundenen Laser ein.

Siehe Textprotokoll für MS-Details: Richten Sie die Instrumentensoftware so ein, dass der Laser den Excimerlaser auslöst, wenn die Ionen nach dieser Einstellung in die HCD-Zelle eintreten. Schalten Sie dann den Impulsgenerator ein, sodass der Laser alle zwei Millisekunden gepulst wird. Isolieren Sie das Lipid-A-Vorläuferion, indem Sie HCD als MS/MS-Methode auswählen, und stellen Sie die Kollisionsenergie auf 1 % normierte Kollisionsenergie ein. Aktivieren Sie das isolierte Lipidion, indem Sie die Laserenergie erhöhen und die Anzahl der Laserimpulse anpassen, typischerweise zehn Sechsmillijoule-Impulse. Nehmen Sie abschließend die Spektren auf und mitteln Sie diese, bis ein ausreichendes Signal-zu-Rausch-Verhältnis erreicht ist.

Für die UVPD-Produktionen. Das negative MALDI-TOF-Massenspektrum von Lipid A aus dem E. coli-K-12-Stamm W3110 zeigt die einfach negativ geladene deprotonierte Spezies mit einem Masse-zu-Ladungs-Verhältnis von 1796,2 als hauptsächlich beobachtete Spezies. Die Einzelheiten der MALDI-TOF-Analyse werden im Textprotokoll erläutert.

Alternativ liefert dieselbe Lipidprobe im negativen ESI-Modus vorwiegend doppelt deprotonierte Lipidionen mit einem Hauptladungsverhältnis von 898,1; deprotonierte Lipidionen mit einem Hauptladungsverhältnis von 1796,20 sind ebenfalls nachweisbar, jedoch mit geringerer relativer Häufigkeit im Vergleich zu den doppelt deprotonierten Spezies. Die Fragmentierung erfolgte mittels CID oder 193 Nanometer UVPD am einfach deprotonierten Lipidion. Diese Techniken können verwendet werden, um die chemischen Strukturen, insbesondere von Lipiden, genauer zuzuweisen.

Eine Art, die komplexe Kombinationen von Modifikationen oder zuvor nicht charakterisierte chemische Modifikationen enthält. Fragmentierungsprofile werden mit gestrichelten Linien dargestellt, die Spaltstellen anzeigen, und mit den unten angegebenen Master-Ladungsverhältniswerten für jede Struktur abgeglichen. Die in roter Schrift hervorgehobenen Master-Ladungsverhältniswerte und Spaltstellen repräsentieren eindeutige Produktionen, die mit dem UVPD 32 P-markierten Lipid assoziiert sind.

A, isoliert aus zwei verschiedenen E. coli K-12-Stämmen, wurde mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) analysiert. Das Protokoll für dieses Verfahren ist im Textprotokoll ausführlich beschrieben. Der K-12-Stamm W3110 enthält hauptsächlich bis- und tris-phosphoryliertes Lipid A; ein komplexeres TLC-Muster wird dagegen mit 32P-markiertem Lipid beobachtet.

Ein aus dem E. coli-Stamm WD 1 0 1 isoliertes Lipid A, das stark mit Rabino und Phosphoethanolamin modifiziert ist.

Da sowohl das eine als auch das vier-primäre Phosphat für Modifikationen zur Verfügung stehen, kann Lipid A aus WD 1 0 1 als einfach modifiziert beschrieben werden, wenn nur ein el-Aminoarabinose oder Phosphoethanolamin an einem der Phosphate vorliegt, oder als doppelt modifiziert, wenn beide Phosphate in kombinatorischer Weise modifiziert sind. Zusätzlich zu den Modifikationen an den ein- und vier-primären Phosphaten wird auch eine Palmitat-Einlagerung beobachtet, die den RF-Wert der Lipid-A-Spezies in diesem Lösungsmittelsystem erhöht. Dieses Protokoll hat auf einzigartige Weise den Weg für Forscher im Bereich der Mikrobiologie geebnet, Struktur-Funktions-Beziehungen dahingehend weiter zu untersuchen, wie Lipid-A-Modifikationen die Biologie gramnegativer Bakterien beeinflussen.

Wir interessieren uns außerdem sehr und haben die Leistungsfähigkeit der auf UVPD basierenden MS zur Charakterisierung der Strukturen biologisch wichtiger Moleküle, wie Glykane, Proteine, Nukleinsäuren und andere komplexe Lipide, nachgewiesen. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit organischen Lösungsmitteln, biologisch gefährlichem Material und Lasern äußerst gefährlich sein kann. Es ist wichtig zu betonen, dass Lösungsmittel in belüfteten chemischen Abzügen gehandhabt werden sollten.

Es sollten stets geeignete Schutzausrüstungen wie Handschuhe und Schutzbrille getragen werden, und der für die UVPD verwendete Laser muss ordnungsgemäß abgeschirmt sein.