Name: Isolierung und chemische Charakterisierung von Lipid A von gramnegativen Bakterien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung und chemische Charakterisierung von Lipid A aus gramnegativen Bakterien mittels Tandem-Massenspektrometrie. Diese Methode nutzt UV-Photodissoziation für präzise Strukturanalysen.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse AI064184 und AI76322 von den National Institutes of Health (NIH) und von Grant 61789-MA-MUR vom Army Research Office, um MST Forschung wurde auch von Welch Foundation Grants F1155 und NIH gewähren R01GM103655 zu GKI unterstützt

<ol><li>Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+endotoxin+and+its+impact+on+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+endotoxin+research%22%5BJournal%5D)">Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis.</a> Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).</li>
<li>Raetz, C. R., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+endotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide endotoxins.</a> Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).</li>
<li>Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+A+Modification+Systems+in+Gram-Negative+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).</li>
<li>Kim, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+TLR4-MD-2+complex+with+bound+endotoxin+antagonist+Eritoran%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran.</a> Cell. 130, 906-917 (2007).</li>
<li>Rietschel, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+endotoxin%3A+molecular+relationships+of+structure+to+activity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal+%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).</li>
<li>Medzhitov, R., Janeway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Innate immunity.</a> The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).</li>
<li>Dinarello, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+and+interleukin-1+antagonism%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism.</a> Blood. 77, 1627-1652 (1991).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+A+acylation+and+bacterial+resistance+against+vertebrate+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides.</a> Cell. 95, 189-198 (1998).</li>
<li>Yi, E. C., Hackett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+method+for+lipopolysaccharide+and+lipid+A+from+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria.</a> The Analyst. 125, 651-656 (2000).</li>
<li>Westphal, O. aJ., K, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Lipopolysaccharide.+Extraction+with+phenol-water+and+further+application+of+the+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Carbohydr.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure.</a> Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).</li>
<li>Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+extraction+of+R+lipopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+biochemistry+%2F+FEBS%22%5BJournal%5D)">A new method for the extraction of R lipopolysaccharides.</a> European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).</li>
<li>Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+eight+lipid+A+precursors+from+a+3-deoxy-D-manno-octylosonic+acid-deficient+mutant+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).</li>
<li>Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+unmodified+endotoxin+preparations+by+252Cf+plasma+desorption+mass+spectrometry.+Determination+of+molecular+masses+of+the+constituent+native+lipopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides.</a> The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+journal+of+biochemistry+and+physiology%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).</li>
<li>Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+NMR+spectroscopy+of+lipid+A+molecules+containing+4-amino-4-deoxy-L-arabinose+and+phosphoethanolamine+substituents.+Different+attachment+sites+on+lipid+A+molecules+from+NH4VO3-treated+Escherichia+coli+versus+kdsA+mutants+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium.</a> The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+biosynthesis+of+free+lipid+A+molecules+that+replace+lipopolysaccharide+in+Francisella+tularensis+subsp.+novicida%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida.</a> Biochemistry. 45, 14427-14440 (2006).</li>
<li>Strain, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+polar+substituents+and+fatty+acyl+chains+on+lipid+A+precursors+from+a+3-deoxy-D-manno-octulosonic+acid-deficient+mutant+of+Salmonella+typhimurium.+Studies+by+1H%2C+13C%2C+and+31P+nuclear+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).</li>
<li>Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IR+and+UV+Photodissociation+as+Analytical+Tools+for+Characterizing+Lipid+A+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry+%28Washington%2C+DC%2C+United+States%22%5BJournal%5D)">IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures.</a> Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).</li>
<li>Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+investigation+of+bacterial+lipopolysaccharides+by+mass+spectrometry+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry.</a> Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).</li>
<li>Hankins, J. V., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+acylation+of+Vibrio+cholerae+lipopolysaccharide+requires+phosphorylation+of+Kdo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo.</a> The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).</li>
<li>Hankins, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+a+novel+Vibrio+cholerae+lipid+A+secondary+hydroxy-acyltransferase+and+its+role+in+innate+immune+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition.</a> Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).</li>
<li>Chan, S., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+structural+characterization+of+lipid+A%3A+electrospray+ionization+coupled+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).</li>
<li>Boue, S. M., Cole, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirmation+of+the+structure+of+lipid+A+from+Enterobacter+agglomerans+by+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).</li>
<li>Kussak, A., Weintraub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quadrupole+ion-trap+mass+spectrometry+to+locate+fatty+acids+on+lipid+A+from+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria.</a> Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).</li>
<li>El-Aneed, A., Banoub, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+molecular+structure+of+lipid+A+isolated+from+both+a+rough+mutant+and+a+wild+strain+of+Aeromonas+salmonicida+lipopolysaccharides+using+electrospray+ionization+quadrupole+time-of-flight+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).</li>
<li>Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+advances+in+lipidomica%3A+collision-induced+decomposition+of+Kdo2-lipid+A%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Other+Lipid+Mediators%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A.</a> Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).</li>
<li>Lee, C. -S., Kim, Y. -G., Joo, H. -S., Kim, B. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+lipid+A+from+Escherichia+coli+O157%3AH7%3AK-+using+thin-layer+chromatography+and+ion-trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).</li>
<li>Wang, Z., Li, J., Altman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+the+lipid+A+region+of+Aeromonas+salmonicida+subsp.+salmonicida+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide.</a> Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).</li>
<li>Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+lipid+A+from+nontypeable+and+type+f+Haemophilus+influenzae%3A+variability+of+fatty+acid+substitution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution.</a> Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).</li>
<li>Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -L., Afonso, C., Tabet, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gram-negative+bacterial+lipid+A+analysis+by+negative+electrospray+ion+trap+mass+spectrometry%3A+Stepwise+dissociations+of+deprotonated+species+under+low+energy+CID+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions.</a> Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).</li>
<li>Silipo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterizations+of+lipids+A+by+MS%2FMS+of+doubly+charged+ions+on+a+hybrid+linear+ion+trap%2Forbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer.</a> J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).</li>
<li>Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+pyrophosphorylated+forms+of+lipid+A+in+gram-negative+bacteria+using+a+multivaried+mass+spectrometric+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.+A%22%5BJournal%5D)">Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).</li>
<li>Jones, J. W., Cohen, ie, Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+structure+characterization+of+lipid+A+extracted+from+Yersinia+pestis+for+determination+of+its+phosphorylation+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).</li>
<li>Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+addition+to+Vibrio+cholerae+LPS+establishes+a+link+between+surface+remodeling+in+gram-positive+and+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).</li>
<li>Han, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+sulfation+in+a+Gram-negative+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium.</a> Nature. 3, 1153-1110 (2012).</li>
<li>Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+phosphorylation+of+lipid+A+is+linked+to+the+synthesis+of+undecaprenyl+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate.</a> Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).</li>
<li>Galloway, S. M., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+Escherichia+coli+defective+in+the+first+step+of+endotoxin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis.</a> The Journal of biological chemistry. , 265-6394 (1990).</li>
<li>Trent, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+a+polyisoprene-linked+amino+sugar+in+polymyxin-resistant+Salmonella+typhimurium+and+Escherichia+coli%3A+structural+characterization+and+transfer+to+lipid+A+in+the+periplasm%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).</li>
<li>Chung, H. S., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxygenases+in+Burkholderia+ambifaria+and+Yersinia+pestis+that+hydroxylate+the+outer+Kdo+unit+of+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).</li>
<li>Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+A+modifications+characteristic+of+Salmonella+typhimurium+are+induced+by+NH4VO3+in+Escherichia+coli+K12.+Detection+of+4-amino-4-deoxy-L-arabinose%2C+phosphoethanolamine+and+palmitate%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate.</a> The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).</li>
<li>Raetz, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kdo2-Lipid+A+of+Escherichia+coli%2C+a+defined+endotoxin+that+activates+macrophages+via+TLR-4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+lipid+research%22%5BJournal%5D)">Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4.</a> Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).</li>
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Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Protokoll haben wir die Isolierung von Lipid-A-Arten aus ganzen Zellen von Bakterien beschrieben und beschrieben TLC oder MS auf Basis analytischer Methoden, um dieses isolierte Material chemisch zu charakterisieren. Tandem-Massenspektrometrie ist eine wirkungsvolle Strategie für die de novo Strukturaufklärung von biologischen Verbindungen und ist von unschätzbarem Wert für die chemische Charakterisierung der Palette der Lipid in der Natur beobachtet A-Moleküle. CID und UV-PD sind zwei sich ergänzende...

Lipopolysaccharid (LPS) der äußeren Hauptfläche Molekül fast allen gramnegativen Organismen und besteht aus drei molekularen Domänen: eine distale O-Antigen-Polysaccharid, ein Kern-Oligosaccharid, und die Membran-assoziierten Lipid A-Domäne auf dem äußeren Blatt der abgeschiedene Außenmembrandoppelschicht 1,2. Die Lipid-A-Domäne besteht aus 3-Desoxy-D-manno-oct-2-ulosonic (Kdo) Resten und einer Lipid-A-Molekülspezies, wobei Lipid A kann als das Chloroform lösliche Teil von LPS bei milder Säurehydrolyse 1 definiert ist, 2. Die Standard-Lipid-A-Molekül kann chemisch als diglucosamine Rückgrat, Hexa-acyliert und bisphosphoryliertes definiert werden, im Einklang mit den in den Modellorganismus Escherichia coli (E. coli) 1,2 beobachtet Haupt Lipid A-Spezies. Neun konstitutiv exprimierte Gene, während gram-negative Bakterien konserviert ist, sind für die Herstellung von Lipid-A-Domäne (Fig. 1) 1,2 verantwortlich. Die meisten Bakterien haben einen zusätzlichen Satz von Genen, die im Grad der phylogenetischen Konservierung variieren, die in weitere chemische Modifikation der Lipid-A-3 teilnehmen. Dephosphorylierung, Entfernen von Acylketten, und die Zugabe von chemischen Gruppierungen, wie Amino-Zucker (z. B. Aminoarabinose) und / oder Phosphoethanolamin sind die am häufigsten beobachteten Aktivitäten (1). Viele der Enzyme, die für Lipid A Modifikation verantwortlich sind, werden direkt durch Umweltsignale, wie zweiwertige Kationen aktiviert ist, oder deren Expression durch zwei Teilantwort-Regler-Systeme 3 geregelt. Anerkennung von Lipid A-Arten durch den Host angeborene Immunsystem wird durch die Toll-like-Rezeptor-4/myeloid Differenzierungsfaktor 2 (TLR4/MD2) Co-Rezeptor 4 vermittelt. Hydrophobe Kräfte zwischen MD2 und der Lipid-A-Acyl-Ketten, sowie zwischen TLR4 und der 1 und 4 &#39;Phosphatgruppen von Lipid A fördern die starke Assoziation der Lippeid A mit TLR4/MD2 4,5. Änderungen, die Acylierung Staat oder die negative Ladung der Lipid A Auswirkungen TLR4/MD2 basierend Lipid A verändern Anerkennung und nachgelagerten Stimulation der angeborenen Immunantwort Aktivatoren NF-kB und Entzündungsmediatoren wie TNF und IL1-β 6,7. Änderungen, die die negative Ladung der Lipid A-Maske verhindern auch bakterizide kationische antimikrobielle Peptide aus der Bindung an gram-negative Zelloberflächen 3,8. Viele Lipid A Änderungen Hypothese aufgestellt, um bakterielle Fitness unter bestimmten Umweltbedingungen, wie im menschlichen Wirt oder in einer ökologischen Nische zu erhöhen. Aus diesem Grund viele Modifikation Enzyme sind attraktive Ziele in der Rationalisierung der antimikrobielle Verbindungen. Die chemische Vielfalt der Lipid-A-Strukturen in Bezug auf Organismus und / oder Umwelt und der biologischen Auswirkungen dieser unterschiedlichen Strukturen machen die strukturelle Charakterisierung von Lipid A ein wichtiges Unterfangen in ter studieren gram-negativer Bakterien. Isolierung von Lipid-A-Moleküle aus ganzen Bakterien umfasst die Extraktion von LPS aus der Bakterienzelloberfläche, einer hydrolytischen Schritt Lipid A zu befreien, gefolgt von einem abschließenden Reinigungsverfahren 9-11. Die am häufigsten genannten LPS Extraktionsverfahren ist das heiße Wasser-Phenol-Extraktionsverfahren, die zuerst von Westphal und Jann 10 eingeführt. Nach Extraktion ganzen LPS ist mild-sauren Hydrolyse, die chemisch trennt Kdo von der 6&#39;-Hydroxylgruppe des distalen Glucosamin-Zucker-Lipid A (Fig. 1) unterzogen. Zahlreiche Gefahren für die Warmwasserphenolverfahren einschließlich der Verwendung eines Hochrisiko-Reagens vorhanden ist, werden die Notwendigkeit der Zusammenarbeit extrahierten Nukleinsäuren und Proteinen und einigen Tagen abgebaut erforderlich, um das Protokoll 10 zu vervollständigen. Unser Labor hat sich weiter die Extraktion und Isolierung von Lipid A entwickelt, wie zuerst von Caroff und Raetz 12,13 entwickelt. Im Vergleich zu Heißwasserverfahren Phenol ist das hier vorgestellte Verfahren schneller und effizienter und bietet eine breite Palette von Kulturvolumen von 5 ml bis mehrere Liter. Darüber hinaus, im Gegensatz zu Warmwasser Phenol-Extraktionen, unsere Methode funktioniert nicht für grobe oder glatte Typen von LPS wählen, eine optimale Wiederherstellung der Lipid-A-Arten. In unserem Protokoll wird eine chemische Lyse ganzer Bakterienzellen unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform, Methanol und Wasser, wo LPS kann durch Zentrifugation pelletiert werden. Eine Kombination von milder Säurehydrolyse und Lösemittelextraktion (Bligh-Dyer) werden verwendet, um Lipid A aus kovalent gebundenen Polysaccharids zu befreien. Das Verfahren von Bligh und Dyer wurde die Extraktion von Lipid-Spezies aus einer Vielzahl von Tier-und Pflanzengeweben 14 aufgebracht, hier modifiziert, um hydrolysierte Polysaccharid aus Lipid A. In diesem letzten Trennstufe zu trennen, Chloroform löslichen Lipide selektiv in die untere organische partitionieren Phase. Um weiter zu reinigen Lipid A, Umkehrphasen-oderAnionenaustausch-Säulenchromatographie verwendet werden 12. Nach der Isolierung von Lipid A-Spezies aus ganzen Zellen, kann eine Anzahl von analytischen Verfahren verwendet, um die chemische Struktur des isolierten Material, wie NMR, TLC und MS-basierte Analyse charakterisiert werden. NMR ermöglicht die zerstörungsfreie Strukturaufklärung und stellt strukturelle Details zu Glycosidbindungen, eindeutige Zuordnung von Acyl-Kettenpositionen und Zuordnung der Bindungsstellen für Lipid-A-Modifikationen wie Aminoarabinose oder Phosphoethanolamin 15-17 zusammen. NMR-Analyse des Lipid A ist nicht in unserem Protokoll diskutiert, hat aber ausreichend anderswo 15,16 beschrieben. Für die schnelle Analyse TLC basierte Methoden werden häufig verwendet, aber nicht, um direkte Informationen über die feinen chemischen Struktur zu schaffen. MS-basierte Protokolle sind die am häufigsten verwendete Methode zur Charakterisierung von Lipid-A-Strukturen 18,19. Matrix zugeordnet Laserdesorptions-Ionisation (MALDI)-MS wird oft verwendet, um zunächst intakt überblicken Lipid A-Spezies. Einfach geladene Ionen von Analyten gemäß unserer Extraktionsverfahren hergestellt erzeugt. Da immer mehr Feinstrukturanalyse erforderlich ist, MS / MS-basierte Methoden beweisen, informativer als MALDI-MS. Gekoppelt Elektrospray Ionisation (ESI) einzeln oder mehrfach geladenen Lipid-A-Vorläufer-Ionen sind weitere Fragmentierung durch Kollision induzierte Dissoziation (CID) oder UV-Photodissoziation (UV-PD), strukturell informative Produkt-Ionen 18,20,21 generieren. Neutralverlust Produkte von Lipid A-Vorläufer-Ionen werden häufig während ESI-MS erzeugt eine zusätzliche Schicht von Strukturinformationen. Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS) hat sich als notwendig und vielseitiges Verfahren zur Aufklärung der Lipid-A-Strukturen sein. Während MS / MS werden Ionen aktiviert wird, um eine Diagnosefragmentierungsmuster, die verwendet werden können, um die Struktur des Vorläuferionen aufzuklären ergeben. Die am weitesten AVAilable MS / MS-Methode ist CID. Dieses Verfahren erzeugt Fragment-Ionen durch Stöße der ausgewählten Vorläuferionen mit einem inerten Zielgas, was zu Energiedeposition, die zur Dissoziation führt. CID hat ein wichtiges Werkzeug bei der Zuordnung der Lipid A-Struktur für eine Vielzahl von Bakterienarten 22-33 bewährt. Obwohl CID ist die universell einsetzbar MS / MS-Verfahren, erzeugt es eine begrenzte Reihe von Produkt-Ionen. 193 nm UV-PD ist eine alternative und komplementäre MS / MS-Methode. Dieses Verfahren verwendet einen Laser, um Ionen zu bestrahlen, und die Absorption von Photonen führt Erregung der Ionen und anschließende Dissoziation. Diese höhere Energie MS / MS-Technik erzeugt eine Vielfalt von Produkt-Ionen als CID und bietet mehr informative Fragmentierungsmuster so. Insbesondere UV-PD bietet Informationen zu subtilen Veränderungen in der Lipid-A-Arten, basierend auf Spaltungen an glykosidischen, Amin-, Acyl-und CC-Bindungen verknüpft 18,21,34.

<table><tbody><tr><td>Chloroform</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C607</td><td>HPLC-Qualität</td></tr><tr><td></td><td>Methanol Thermo Fisher</td><td>Scientific A452</td><td>HPLC-Qualität</td></tr><tr><td>Teflon FEP Zentrifugenflaschen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-562-21</td><td></td></tr><tr><td>Kieselgel 60 DC-Platten</td><td>EMD Biosciences</td><td>5626-6</td><td></td></tr><tr><td>Klasse Nr. 3MM Chromatographie-Papier</td><td>Whatman</td><td>3030700</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Elite</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Massenspektrometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ExciStar XS Excimer Lasrer</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PicoTip Nanospray ESI Strahler</td><td>Neue Obektive</td><td></td><td>&#8805; 30 &mu; m zur Reduzierung von Verstopfungen</td></tr><tr><td>Modell 505 Impuls-/Verzögerungsgenerator</td><td>Berkeley Nucleonics Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte Thermoylne 2200</td><td>Barnstead/Thermolyne</td><td>HPA2235MQ</td><td></td></tr><tr><td>16x125 mm GPI 15-415 Einweg-Borosilikat-Kulturröhrchen mit Gewinde</td><td>Corning Pyrex</td><td>99449-16X</td><td></td></tr><tr><td>Wiederverwendbare PTFE-Schraubverschlüsse mit Gewinde GPI 45-415</td><td>Corning</td><td>9999-152</td><td></td></tr><tr><td>Personal Molecular Imager System (Phosphorimager)</td><td>BioRad</td><td>170-9400</td><td></td></tr><tr><td>Autoradiographie-Kassette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FBCS810</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorscreen SO230</td><td>Kodak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptid-Massenstandard-Kit</td><td>Sequazyme</td><td>P2-3143-00</td><td></td></tr><tr><td>Sonifikator S250-A</td><td>Branson</td><td>101063196</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml 12x32 mm Fläschchen mit konischem Boden und Schraubgewinde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C4000-V1</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und chemische charakterisierung von lipid a von gramnegativen bakterien

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharid (LPS) ist die Hauptzelloberflächenmolekül von gram-negativen Bakterien auf dem äußeren Blatt der äußeren Membran-Doppelschicht abgeschieden. LPS kann in drei Bereiche unterteilt werden: der distale O-Polysaccharid, ein Kern-Oligosaccharid und das Lipid A-Domäne, die aus einer Lipid-A-Molekularspezies und 3-Desoxy-D-manno-oct-2-ulosonic Säurereste (Kdo). Die Lipid-A-Domäne ist die einzige Komponente, die für bakterielle Zellüberleben. Nach der Synthese wird Lipid A chemisch in Reaktion auf Umwelteinflüsse, wie pH oder Temperatur verändert, die Förderung von Resistenz gegen Antibiotika-Verbindungen und die Erkennung durch Mediatoren der Wirts angeborenen Immunantwort zu entziehen. Das folgende Protokoll beschreibt die kleinen und großen Isolierung von Lipid A aus gram-negative Bakterien. Isoliert Material wird dann chemisch durch Dünnschicht-Chromatographie (DC) oder Massenspektrometrie (MS) gekennzeichnet. Zusätzlich zur Matrix-unterstützte Laser-Desorptions / Ionisations-Zeit fLicht (MALDI-TOF) MS beschreiben wir auch Tandem-MS-Protokolle für die Analyse von Lipid einer molekularen Spezies mit Elektrospray-Ionisation (ESI), um eine Kollision induzierte Dissoziation (CID) gekoppelt ist und neu eingestellten UV-Photodissoziation (UV-PD)-Methoden. Unsere MS-Protokolle ermöglichen die eindeutige Bestimmung der chemischen Struktur, ausschlaggebend für die Charakterisierung der Lipid-A-Moleküle, die einzigartig oder neuartige chemische Modifikationen enthalten. Wir beschreiben auch die Radioisotop-Markierung, und die anschließende Isolierung von Lipid A aus Bakterienzellen für die Analyse durch TLC. Bezogen auf MS-basierte Protokolle bietet TLC eine wirtschaftlichere und schnelle Charakterisierung Verfahren, kann aber nicht verwendet werden, um eindeutig zuordnen Lipid eine chemische Strukturen ohne die Verwendung von Standards bekannter chemischer Struktur sein. In den letzten zwei Jahrzehnten Isolierung und Charakterisierung von Lipid A auf zahlreiche spannende Entdeckungen geführt, die unser Verständnis der Physiologie von gram-negativen Bakterien, die Mechanismen der Antibiotika-Widerstand verbessert habentung, die menschliche angeborene Immunantwort, und viele neue Ziele in der Entwicklung antibakterieller Verbindungen vorgesehen.

Canonical Lipid A von E. coli und Salmonella enterica Serovar Typhimurium ist ein Hexa-acylierte Glucosamin-Disaccharid mit Phosphatgruppen an der 1 - und 4 &quot;-Positionen. Während des Wachstums in reichen Medien (z. B. Luria Broth) ein Teil des Lipid-A enthält eine Pyrophosphat-Gruppe an der 1-Position ergibt ein Tris-phosphorylierten Spezies 36 (Fig. 1). KDO-(3-Desoxy-D-manno-octulosonsäure), befestigt an der 6&#39;-Hydroxylgruppe und bildet e...

Isolierung und Charakterisierung der Lipid-A-Domäne von Lipopolysaccharid (LPS) von gramnegativen Bakterien gibt Einblick in Zelloberfläche basierend Mechanismen der Antibiotikaresistenz, bakterielle Überlebensrate und Fitness, und wie chemisch unterschiedlicher Lipid einer molekularen Spezies unterschiedlich modulieren Host angeborenen Immunantwort.

Isolierung und chemische Charakterisierung von Lipid A von gramnegativen Bakterien

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Lipopolysaccharid von der äußeren Oberfläche gramnegativer Bakterien zu isolieren und den Lipid-A-Anteil mithilfe von Tandem-MS-Protokollen strukturell zu charakterisieren. Dies wird durch chemische Extraktion von Lipopolysaccharid aus der bakteriellen Zelloberfläche und anschließende milde saure Hydrolyse erreicht, um Lipid A vom Polysaccharidanteil des Lipopolysaccharids zu lösen. Im zweiten Schritt wird eine Lösung von Lipid A mittels Elektrospray-Ionisations-MS/MS analysiert.In unserem Verfahren wird Lipid A entweder durch kollisionsinduzierte Dissoziation oder UV-Photodissoziation basierende MS/MS zur strukturellen Charakterisierung analysiert. Die Ergebnisse zeigen Unterschiede in den Fragmentierungsmustern der Massenspektren, die entweder aus kollisionsinduzierter Dissoziation oder aus UV-Photodissoziation basierenden MS/MS-Protokollen stammen, wobei UVPD ein aussagekr&auml;ftigeres Fragmentierungsmuster liefert. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden liegt darin, dass die Tandem-Massenspektrometrie die Aufkl&auml;rung der Zielanalyten anhand der Interpretation diagnostischer Fragmentierungsm

isolation-chemical-characterization-lipid-from-gram-negative

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Wir beschreiben ein modifiziertes heißen wässrigen-Phenolextraktion Verfahren zum Reinigen von Lipopolysaccharid (LPS) von Gram-negativen Bakterien. Sobald extrahiert wurden, kann die LPS anschließend durch SDS-PAGE analysiert und visualisiert werden durch direkte Färbung oder Western-Immunoblot-.

Reinigung und Visualisierung von Lipopolysaccharid aus Gram-negativen Bakterien durch heiße wäßrige-Phenol-Extraktion

Dieses Video demonstriert die auf Dünnschichtchromatographie basierende Trennung von Mykolsäuren. Bei dieser Technik werden die verschiedenen Mykolsäuren – langkettige Lipide, die in der Zellwand von Mykobakterien vorkommen – anhand ihrer Polarität getrennt.

Dünnschichtchromatographie-basierte Trennung von Mykolsäurevarianten: Eine Methode zur Trennung von mykobakteriellen Zellwandlipiden anhand der Polarität

Die bakterielle Zellwand besteht aus Peptidoglycan, einem makromolekularen Netzwerk von Zuckersträngen, die durch Peptide vernetzt sind. Ultra Performance Liquid Chromatography bietet eine hohe Auflösung und Durchsatz für neuartige Entdeckungen der Peptidoglykan-Zusammensetzung. Wir präsentieren ein Verfahren zur Isolierung von Zellwänden (Sacculi) und deren anschließender Vorbereitung auf die Analyse über UPLC.

Isolierung und Vorbereitung von bakteriellen Zellwänden für die Kompositionsanalyse durch Ultra Performance Liquid Chromatographie

Die Anreicherung von bakterielle Lipoproteine mit einem nichtionischen Tensid Phase Partitionierung Methode wird für die direkte Verwendung in TLR-Tests oder andere Anwendungen beschrieben. Weitere Schritte sind detailliert, um strukturelle Charakterisierung N-terminalen tryptic Lipopeptide Vorbereitung durch Massenspektrometrie.

Bereicherung der bakterielle Lipoproteine und Vorbereitung der N-terminalen Lipopeptide Strukturaufklärung durch Massenspektrometrie

Diese Methode bietet einen Rahmen für die Untersuchung der Einbeziehung von exogenen Fettsäuren aus komplexen Wirtsquellen in bakterielle Membranen, insbesondere Staphylococcus aureus. Um dies zu erreichen, werden Protokolle zur Anreicherung von Lipoproteinpartikeln aus Hühnereigelb und anschließende Fettsäureprofilierung von bakteriellen Phospholipiden unter Verwendung der Massenspektrometrie beschrieben.

Isolierung von Lipoproteinpartikeln aus Hühnereigelb zur Untersuchung des bakteriellen Pathogens Fettsäure-Inkorporation in Membranphospholipide

Gramnegative Bakterien produzieren zwei räumlich getrennte Membranen. Die äußere Membran wird durch ein Periplasma und eine Peptidoglykanschicht von der inneren Membran abgetrennt. Die Fähigkeit, die beiden Doppelschichten dieser Mikroben zu isolieren, war entscheidend für das Verständnis ihrer Physiologie und Pathogenese.

Trennung der Zellhülle für gramnegative Bakterien in innere und äußere Membranfraktionen mit technischen Anpassungen für Acinetobacter baumannii

Es wird ein Protokoll vorgestellt, um den Gesamtlipidgehalt der Zellwand einer Vielzahl von Mykobakterien zu extrahieren. Darüber hinaus werden Extraktions- und Analyseprotokolle der verschiedenen Arten von Mykolsäuren gezeigt. Ein dünnschichtchromatographisches Protokoll zur Überwachung dieser mykobakteriellen Verbindungen wird ebenfalls bereitgestellt.

Analyse der Lipidzusammensetzung von Mykobakterien mittels Dünnschichtchromatographie

Radical-basierte biomimetische Chemie hat zur Gebäude-up-Bibliotheken, die für Biomarker-Entwicklung angewendet.

Free Radicals in Chemical Biology: ab chemisches Verhalten, um Biomarker Entwicklung

DNA-Origami ist eine leistungsfähige Methode zur Herstellung präziser nanoskaliger Objekte durch Programmierung der Selbstorganisation von DNA-Molekülen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Faltung eines bioresponsiven Roboters aus DNA-Origami, seine Aufreinigung und Negativfärbung für die transmissionselektronenmikroskopische Bildgebung (TEM).

Falten und Charakterisierung eines Bio-responsive Robot von DNA-Origami

Das hierin beschriebene Protokoll zielt darauf ab, zu erläutern und verkürzen die zahlreichen Hindernisse in den Weg der komplizierten Weg führt zu modifizierten Nukleosidtriphosphaten. Folglich dieses Protokoll erleichtert sowohl die Synthese dieser aktiviert Bausteine ​​und ihre Verfügbarkeit für die Praxis.

Nucleosidtriphosphaten - von der Synthese zur biochemischen Charakterisierung

Erfahren Sie die Isolierung und chemische Charakterisierung von Lipid A aus gramnegativen Bakterien mittels Tandem-Massenspektrometrie. Diese Methode nutzt UV-Photodissoziation für präzise Strukturanalysen.

Isolierung und chemische Charakterisierung von Lipid A von gramnegativen Bakterien

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