Ein Protokoll für genetische Induktion und Visualisierung von Gut-und invasiven Tumoren in Cephalic Komplexe von Drosophila melanogaster

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, gutartige und invasive Tumoren in Drosophila zu induzieren und sie dann durch Präparieren des Kopfkomplexes der Larve sichtbar zu machen. Dies beginnt mit der Einrichtung zwischen den gewünschten Stämmen und der Isolierung der Larvennachkommen, die entweder den invasiven oder den gutartigen Tumor tragen. Der nächste Schritt besteht darin, die ausgewählten Larven zu sezieren.

Um den Kopfkomplex freizulegen, indem man sie zuerst zu zwei Dritteln abschneidet, fixiert und dann auf links dreht. Als nächstes werden Fett, Körper und Darmgewebe gereinigt, und dann werden auch alle Nerven aufgebrochen, die noch am ventralen Nervenstrang und an der Epidermis der Larve befestigt sind. Der letzte Schritt besteht darin, den Kopfkomplex abzubilden oder für nachgelagerte Anwendungen zu fixieren.

Letztendlich können die Ergebnisse durch den Einsatz der Fluoreszenzmikroskopie GFP-markierte invasive oder gutartige Tumoren zeigen. Diese Methode kann helfen, einige der Schlüsselfragen der Krebsbiologie zu beantworten. Zum Beispiel möchten Sie vielleicht verstehen, welche Gene das Fortschreiten von Tumoren in einem intakten Organismus hemmen könnten.

Sobald die erforderlichen genetischen Bestände erhalten wurden, bereiten Sie eine Starterkultur des Testerstamms vor. Bereiten Sie auch eine Starterkultur für den getesteten Bestand vor. Kreuzen Sie 10 weibliche Jungfrauen aus dem Testbestand mit 10 Rüden aus dem getesteten Stamm.

Lassen Sie die Fliegen sich 24 bis 48 Stunden lang bei 25 Grad Celsius paaren und Eier legen, und setzen Sie sie dann in ein frisches Fläschchen um, um mehr Nachkommen zu produzieren. Überwachen Sie die Kreuzfläschchen auf Eier und die ersten Larven im Stadium. Richten Sie ein neues Kreuz ein.

Wenn die gesammelten Durchstechflaschen eine schlechte Eiablage aufweisen. Wenn die gesammelten Fläschchen zu trocknen beginnen, fügen Sie nur drei bis vier Tropfen destilliertes Wasser aus dem Autoklaven hinzu, um die Kultur feucht zu halten. Überwachen Sie die Fläschchen weiter, bis sie umherwandern.

Es sind Larven des dritten Stadiums vorhanden. Fahren Sie dann mit der Überwachung unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop fort. Mit dem gleichen Verfahren sammeln Sie Fliegen mit invasiven Tumoren unter Verwendung der aufgeführten Bestände bis zum fünften oder sechsten Kulturtag, wandernde Larven des dritten Stadiums werden aus den gutartigen Tumorkulturen verfügbar sein.

Sie werden jedoch erst am Tag 10 aus den invasiven Tumorkulturen zur Verfügung stehen. Um die Larven des dritten Stadiums zu sammeln, befeuchten Sie einen feinen Pinsel mit destilliertem Wasser und kratzen Sie sie von der Wand des Fläschchens. Legen Sie die Larven mit kaltem XPBS und dann mit einem feuchten Pinsel in eine Vertiefungsrutsche.

Kratzen Sie jegliches Nahrungsmaterial von der Epidermis ab. Legen Sie die Larve für einige Minuten zur Ruhigstellung 30 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius auf den Teller. Für eine längere Immobilisierungszeit legen Sie die Larven in ein Kulturfläschchen mit nur Fliegenschlaf auf einem Stab.

Stecken Sie das Kulturfläschchen ein und lassen Sie es 40 Minuten stehen. Übertragen Sie anschließend die immobilisierten Larven auf einen Objektträger. Fügen Sie einen Tropfen helles Halo-Kohlenhydratöl hinzu und bedecken Sie die Larven mit einem Deckglas.

Beobachten Sie nun die Larven unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop. Für die GFP-Expression wählen Sie die grün fluoreszierenden Larven aus und fahren Sie mit der Dissektion fort. Gutartige tumortragende Larven fluoreszieren grün im vorderen Bereich, wo der Kopfkomplex vorhanden ist.

Invasive Tumoren fluoreszieren auch im vorderen Bereich der Larven am Kopfkomplex grün. Wenn möglich, stellen Sie sicher, dass Sie die fluoreszierenden Tumoren fotografisch dokumentieren. Die durchscheinende Epidermis der Larve macht es also schwierig, das Ausmaß der Migration der Tumoren zu beobachten, und deshalb müssen wir die Tumoren sezieren.

Beginnen Sie damit, eine frische Larve mit einem der beiden Tumore mit einer Pinzette zu übertragen. Geben Sie in eine Vertiefung eine Sezierschale ein, die einen Milliliter kalten XPBS enthält. Halten Sie die Larven mit einer Pinzette in etwa zwei Dritteln des Abstands vom vorderen Ende fest.

Trennen Sie mit einer weiteren Pinzette das hintere Drittel der Larven geschickt ab und entsorgen Sie es. Dann ließ es die vorderen zwei Drittel los. Wenn der Druck in den Larven nachlässt, sickert der Inhalt aus der Körperhöhle.

Entferne mit einer Pinzette das Gewebe, das aus der Körperhöhle gesickert ist. Halten Sie dann den Mundhaken der Larve fest und schieben Sie ihn in die Epidermis der Larve. Mit dem anderen Pinzettenpaar drehen Sie die Larven vollständig um.

Entfernen Sie nun mit der Pinzette vorsichtig und vorsichtig den Fettkörper, die Speicheldrüsen, den Darm, den Flügelscheibenkomplex und eventuelle Trachealtuben. Der Kopfkomplex kann nun sichtbar sein, wenn er am Mundhaken befestigt ist. Die Gehirnhälften und der VNC sind immer noch über Nerven, die vom VNC ausgehen, mit der Epidermis der Larve verbunden.

Lösen Sie diese Verbindungen vorsichtig mit einer Pinzette. Entfernen Sie dann überschüssiges Fett, Körper oder anderes Gewebe, so dass der Kopfkomplex deutlich sichtbar wird. Befestigt an der Epidermis der Larve an den Maulhaken.

Lassen Sie den Kopfkomplex so, wie er ist, um ihn vor der Visualisierung weiter zu verarbeiten. Andernfalls, um den Kopfkomplex direkt sichtbar zu machen, lösen Sie ihn von der Epidermis und legen Sie ihn in einen Tropfen Glycerin-basiertes Einbettmedium wie z. B. Vector Shield. Unter Verwendung des beschriebenen Protokolls wurden Tumore im Auge induziert.

Anin-Scheibe, gutartige Tumoren blieben in der Auge-Anin-Scheibe lokalisiert, wo sie induziert werden. Beachten Sie, dass das GFP-markierte Gewebe nicht in angrenzende Organe wie den ventralen Nervenstrang im Kopfkomplex migriert ist, der invasive Tumoren von einem Tag 10 Larvenüberwucherung von Tumorgewebe trägt. Wie der rote Pfeil zeigt, drangen die Tumore auch in angrenzende Organe wie das VNC und die Mundhaken ein.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man gutartige und invasive Tumoren genetisch induziert und sie dann durch Präparieren des Kopfkomplexes intra ano gastro visualisiert.