Name: Generation und 3-Dimensional Quantifizierung der arterielle Läsionen in Mäuse mit optischen Projektionstomographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Erfahren Sie die optische Projektionstomografie zur dreidimensionalen Visualisierung und Quantifizierung arterieller Läsionen bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht präzise Volumenmessungen von atherosklerotischen Veränderungen.

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(; Henry Dryerre Schema LL) und Finanzierung von der British Heart Foundation (PWFH, BRW, DJW; Diese Arbeit wurde von student von der University of Edinburgh (NSK) und Carnegie Vertrauen unterstützt RG / 05/008; PG / 05/007; PG / 08/068/25461) und Wellcome Trust (JRS, BRW, DJW; 08.314 / Z / 07 / Z). Die Autoren sind dankbar für ihre Arbeit von der BHF-finanzierten Forschungsschwerpunkt Auszeichnung an das Zentrum für Herz-Kreislauf vorgesehen Wissenschaft unterstützt. Die Autoren sind besonders dankbar für Tipps von Professor Masataka Sata (Universität Tokushima) und Dr. Igor Chersehnev (in Dr Ernane Reis &#39;Gruppe am Mount Sinai School of Medicine) über die Einrichtung einer operativen Modelle der neointimale Läsion Produktion. Das Video produziert und von Sata et al, zur Verfügung gestellt. (Http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm) war besonders nützlich.

1. Chirurgische Induktion neointimaler Läsionen in der Maus-Oberschenkelschlagader <ol><li> Versuche an Tieren sollten gemäß dem nationalen und Ethikanforderungen durchgeführt werden. All Operation sollte durchgeführt unter Verwendung von geeigneten aseptischen werden. Induktion der neointimalen Läsionen unter Verwendung einer Modifikation des von Roque et al. 12 und Sata et al. 13 beschriebene Technik erreicht. </li><li> Wiegen männlichen C57Bl6 / J-Mäusen (Alter 10-12 Wochen, Gewicht 25-30 g) dann durch die Bereitstellung von 4-5% Isofluran in einer Induktionskammer betäuben. Sobald die Betäubung induziert worden ist, übertragen die Maus auf einer beheizten Matte, um die Körpertemperatur auf 37 ° C zu halten. Weiter Verabreichung von Isofluran (2-3%) über eine Maske. </li><li> Sobald ein angemessenes Niveau der Anästhesie induziert wurde (fehlende Reaktion auf Zehen pinch), bieten analgetische Abdeckung durch Verabreichung von Buprenorphin (0,1 mg / kg -1). Dann legen Sie die Maus in Rückenlage eind rasieren die Bauchseite des linken Hinterlauf. </li><li> Einen Einschnitt, um die Muskeln der oberen Hinterlauf freizulegen und zwischen der Gabelung mit der Arteria poplitea und der Bauchwand, verwenden stumpf, um die Arteria und Vena femoralis vom N. femoralis zu isolieren. Bewässerung der Wunde unter Verwendung von 1% w / v Lignocain erforderlich. </li><li> Zeigen proximal (in der Nähe der Bauchwand) und distalen (direkt unter dem Zweig mit der Arteria poplitea) temporäre Ligaturen (6/0 Mersilk) um die Arteria und Vena femoralis um den Blutfluss zu steuern. Dann isolieren die Arteria poplitea (ca. 2-5 mm distal der Zweig mit der Oberschenkelarterie) und distal zu ligieren. Legen Sie eine zweite, ungebundene Blattschraube unterhalb der A. poplitea. </li><li> Einen kleinen Einschnitt (Arteriotomie) in der Arteria poplitea, unmittelbar distal zu dem Zweig mit der Oberschenkelarterie, zu verhindern Blutungen durch Aufbringen von Druck auf das proximale temporären Ligatur. Voran einer geraden, entstanden 0.014 &quot;Führungsdraht1-1,5 cm entlang der Oberschenkelarterie in die Richtung der Bauchwand und lassen Sie an Ort und Stelle für 30 Sekunden (Abbildung 1A). </li><li> Entfernen Sie den Führungsdraht und Ligation der Arteria poplitea oberhalb des Arteriotomie, mit der Ligatur zu diesem Zweck gegeben und kümmert sich nicht um die Oberschenkelarterie zu verschließen. HINWEIS: Für die Ligation induzierte Verletzung. Neointimale Umbau ohne intraluminale Verletzung kann durch Ligation der Oberschenkel- oder Kniekehlenarterien (1B und 1C) induziert werden. Um dies zu erreichen folgen die Schritte 1,1-1,5. Doch die Arteriotomie nicht machen, aber (Vermeidung von Schritt 1.6) entweder (i) zu ligieren die Arteria poplitea unmittelbar distal der Oberschenkelarterie oder (ii) zu ligieren der A. femoralis communis an der Verzweigungsstelle mit der Arteria poplitea. Dann fahren Sie mit Schritt 1.8. </li><li> Entfernen Sie temporäre Ligaturen, die Wunde mit einem diskontinuierlichen äußeren Naht (5/0 Mersilk) und gelten EMLA-Creme (2,5% Lidocain, Prilocain 2,5%). Damit die Tiere neu<html> gewinnen Bewusstsein (in der Regel 5-10 min) und sicherzustellen, dass sie frei um ihren Käfig bewegt (leichte Lahmheit kann in das betroffene Bein offensichtlich sein, aber dies sollte in den ersten 2-3 Tagen nach der Operation zu beheben) vor der Rückkehr in Tierräumen. Mäuse müssen nicht einzeln nach der Operation untergebracht werden. </li><li> Damit die Tiere für bis zu 3 Monate zu erholen. Kleine Läsionen beginnen zu 7 Tage nach Draht Verletzungen scheinen ~ und eine stabile maximale Größe zu erreichen, nachdem ~ 21-28 Tage. </li></ol> 2. Induktion von atherosklerotischen Läsionen in der Apolipoprotein E - / - Mäusen <ol><li> Verwalten westliche Ernährung (0,2% Cholesterin, Diäten Forschung, USA), um männlich, 6 Wochen alten ApoE-null-Mäusen (in eigener Zucht) für 12 Wochen. </li><li> Atherosklerotischen Läsionen sind häufig auf die Brutto Inspektion des Aortenbogens und seiner Hauptzweige (Abbildung 2) sichtbar. </li></ol> 3. Analysieren arterielle Läsionen mit optischen Projektionstomographie (OPT) nt &quot;&gt; Hinweis: OPT Bilder von Läsionen in murine Oberschenkelarterien und Aortenbogen Proben wurden unter Verwendung eines optischen Projektionstomographen erhaltene. <ol><li> Euthanize Mäusen durch transcardiac Perfusionsfixierung und Ausbluten unter Betäubung Anschluß (80 mg / kg Natriumpentobarbital) mit heparinisiertem (10 U / ml) Phosphat-gepufferter Saline (PBS) und anschließend mit 10% neutralem gepuffertem Formalin. </li><li> Isolieren Oberschenkelarterien oder die Aortenbogen und seine wichtigsten Branchen (linke Halsschlagader, linken Schlüsselbeinarterie, Truncus brachiocephalicus), soweit angemessen, und entfernen Sie Fremd peri-adventitiellen Material. Postfix-in 10% gepuffertem Formalin O / N, vor der Lagerung in 70% Ethanol, bis sie benötigt. </li><li> Einbetten Arterien in 1,5% niedrigschmelzender Agarose, durch Whatman 113 V Papier vorgefiltert. Befestigen Sie jede Probe auf eine Magnethalterung mit OPT Cyanacrylatklebstoff mit den Gefäßachse im Einklang mit der von der Halterung. Schneiden Sie überschüssige Agarose zu einer konischen Form. Dehydratisieren in 100% Methanol für mindestens 12 Std. </li><li> CLear Gefäße durch Eintauchen (12-24 h) in einer Mischung aus Benzylalkohol und Benzylbenzoat (1: 2 v / v). </li><li> Platzieren gelöscht Proben in einem kalibrierten Tomographen. Stellen Sie die Auflösung auf 1.024 x 1.024, und festzustellen, eine optische Vergrößerung, die das gesamte Gebiet von Interesse zu sehen erlaubt. OPT Volumen isotrop die z-Achse wird auf die gleiche Auflösung rekonstruiert (dh 1,024 x 1,024 x 1,024) Voxelgrße ~ 200 um. Dies kann eine Überschätzung der Auflösung darstellen, da es wahrscheinlich Rekonstruktion Artefakte sein. Probenposition einzustellen, so dass er sich dreht, auf seiner eigenen Achse in der Mitte des Sichtfeldes in der Hellfeld, Übertragungskanal. </li><li> Im GFP1 Filteremissionskanal (Anregungsfilter 425 nm mit 40 nm Bandpass; Emissionsfilter: 475 nm Langpass), konzentrieren sich die Probe und die Belichtungszeit, den Dynamikbereich des sich ergebenden Bildes zu maximieren (Vermeidung von Übersättigung). Scannen Sie den Behälter nur in der GFP1 Emissionskanal, mit einem 0,9 ° -Drehung Schritt. &lt;/ Li&gt; <li> Nach Abschluss bestätigen Qualität der Datenerfassung mit Dataviewer-Software. Probe entfernen aus dem Scanner. </li><li> Um die anschließende histologische Untersuchung, Ort Probe in 100% Methanol für&gt; 24 h vor der Bearbeitung zu ermöglichen Wachs als normale Paraffin. </li></ol> 4. Bildrekonstruktion und -analyse Tomographische Rekonstruktion durch gefilterte Rückprojektion durchgeführt wird unter Verwendung NRecon Software oder ähnliches. Rekonstruktionen können unbeaufsichtigt durchgeführt werden, in den Reihen. <ol><li> Verbesserung der Bildqualität durch Ausgleich der Fehlausrichtung und Einstellung der Bildintensitätsstufen. </li><li> Prüfen Sie die Qualität der Bildrekonstruktion mit Dataviewer-Software. </li><li> Identifizieren Sie den entsprechenden Abschnitt der Probe zur Analyse. Bewahren Sie diese Länge konsistent zwischen Schiffen, wenn luminalen Abmessungen sind aufzuzeichnen. </li><li> Definieren Sie den Überblick über die Läsionen durch manuelles Tracing die entsprechende Grenze für 1 in jeden 50 rekonstruierten Querschnitten. </li><li> Überprüfen Sie jede verschachtelt Querschnitt, um sicherzustellen, computer-generierte Interpolationen korrekt sind. Die Grenze manuell anpassen, wenn nötig. </li><li> Legen Sie die Grauwertschwelle, so dass nur die Läsion ausgewählt ist und exportieren Sie die Messdaten. </li><li> Für jeden Scan, definieren einen vertikalen Bereich von Interesse, die die Läsion und Spuren die Grenze zwischen Medien und Neointima (dh., Die Position der innere elastische Lamina) für jede 50-Scan-Linie. Interpolieren Intima / Media-Grenzen für den verschachtelten Abtastzeilen in Software und überprüfen und korrigieren Sie den Sitz, wo erforderlich. Weitere Segment diese definierten dreidimensionalen Volumens zu einer manuell definierten Intensitätsschwelle um ein binäres Bild Satz, in dem weiße Pixel darstellen Neointima und schwarze Pixel darstellen Patent Lumen zu erzeugen. </li><li> Messungen sind: Gesamt Läsionsvolumen (Objektvolumen), Lumenvolumen (Volumen - Objektvolumen) und die Verteilung der Läsion und Lumenquer Sekteional Bereich entlang der axialen Länge des untersuchten Behälters. </li></ol>

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

3-dimensionale Analyse hat ein großes Potenzial für den Ersatz oder zur Ergänzung der 2-dimensionalen histologischen Techniken, die immer noch den Großteil der Untersuchungen der arteriellen Läsion Bildung zu untermauern. Hier OPT in kleinen murine Arterien (mit Maus-Oberschenkelarterien wahrscheinlich, die die kleinsten Gefäße, die erfolgreich mit dieser Technik analysiert werden kann) gezeigt. Es ist jedoch auch für die Verwendung mit Arterien (und Läsionen) von anderen Arten, darunter kleine bis mittelgroße menschliche Gefäße; unsere Gruppe erfolgreich die Technik verwendet, um Läsionen in Kaninchenaorta analysieren (Bezuidenhout et al;. unveröffentlicht). OPT verspricht schnellere Analyse und eine erhöhte strukturelle Information im Vergleich zu herkömmlichen Histologie und hat den Vorteil der anschließenden Analyse der Probe unter Verwendung sowohl histologische und immunhistochemische Techniken nicht verhindert wird. Die Verwendung OPT erzeugten Bilder gab anatomischen Details, welche Websites der Läsion Bildungund die Größe der Läsionen in diesen Bereichen. Die in diesen Untersuchungen verwendet Arterien sind wahrscheinlich in der Nähe der Grenze der Auflösung für die Technik und die Bildqualität wird daher zu einem gewissen Grad durch Artefakte (in der Regel von Drehfehlausrichtung, unvollständige Clearing, Reflexion / Refraktion an den Ecken Agarose und Fokussierung Probleme ergeben) beeinträchtigt . Trotz dieser, die Angaben (dh Schichten der Gefäßwand) erkennbar bleiben und somit der Technik ist äußerst nützlich für die Quantifizierung der einzelnen Schichten. Tatsächlich könnte Bilder schnell und reproduzierbar zu quantifizieren, um Messungen der Läsion und Lumenvolumen in Plaque-Lagerabschnitte des Schiffes sowie Querschnittsflächen der Läsion und Lumen an ausgewählten Stellen in der Probe bereitzustellen. Large (Aorta) und mittlere (Oberschenkel, Carotis, subclavia) murine Arterien - diejenigen, die allgemein für die Analyse von atherosklerotischen und neotintimal Läsion Bildung in Mäusen verwendet - erfolgreich warenanalysiert mit dieser Methode. In der Tat haben wir nun verwendet OPT, um die Wirkung von pharmakologischen Interventionen und genetische Manipulation auf atherosklerotische und neointimale Läsion Größe zu demonstrieren. Zum Beispiel Endothelin-Rezeptor-Blockade verändert neointimale Läsion Bildung in der Erwägung, selektives Löschen des Endothelin B Rezeptor aus der vaskulären Endothel nicht 15. Bei der Atherosklerose neigen Mäusen wurden genetische Deletion der Enzyme 11β-HSD1 16 oder Galectin 3 17 gezeigt, um die Größe von atherosklerotischen Läsionen zu verringern. Die Quantifizierung der Läsionsvolumen ist eine offensichtliche Vorteil der OPT. Es gibt eine informative Anzeige der Gesamtlast Läsion in einer Arterie 4 als normalerweise mit histologischen Methoden erhalten. Analyse des gesamten Läsion reduziert Selektionsbias und Fehler, die unweigerlich auftreten, wenn einzelne Abschnitte eines Gefäßes für die Analyse ausgewählt. Herstellung von Längsprofilen Läsion ist eine weitere Stärke des OPTDurch den Vergleich von Läsionen, die durch verschiedene Arten von Verletzungs 13,16 (Abbildung 5) induzierten hervorgehoben. Beispielsweise können sowohl vollständige Ligation und Drahteinführungs induzierte fast vollständigen Verschluss der Nähe des femero-poplitea Bifurkation. Draht Schädigung erzeugte jedoch Läsionen, die entlang der gesamten Länge des abgetasteten Abschnitt verlängert, während Läsionen durch Arterienligation induziert rasch verkleinert und verschwinden. Dieses Muster stimmt mit dem größeren Umfang der Verletzung durch Insertion des Angioplastie-Führungsdraht verursacht. Erzeugen ähnliche Ergebnisse unter Verwendung von histologischen Schnitten ist teuer, zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Die Vorteile des OPT gehören die Qualität der Bilder, sie produziert und dessen relative Geschwindigkeit und Einfachheit (wir routinemäßig gescannt 20 Schiffe pro Tag). Bildqualität angezeigt überlegen oder zumindest vergleichbar sind, zu anderen Verfahren zur Erzeugung von 3-dimensionalen Bildern ex vivo (wie MRI und Mikro CT), yet OPT erfordert kürzere Scanzeiten (Integrationszeit für unsere Studien war typisch 1-2sec / Bild) und ist weniger teuer. Probenvorbereitung erstreckt sich über mehrere Tage benötigt aber wenig Arbeit können Gefäße in Chargen hergestellt werden, und die Daten können in einem Durchgang erfasst werden. Folglich ist Hochdurchsatz und erweiterte Nutzung der Scanner nicht erforderlich. Wichtig ist, dass die nicht-destruktive Natur des OPT bedeutet, es kann verwendet werden, um Seiten von Interesse für die immunhistochemische Untersuchung zu identifizieren; wodurch die Menge an Schneidreduktions und Färben erforderlich. Es ist möglich, dass die Entwicklung von hochauflösenden Ultraschalls wird ein alternatives Verfahren zur volumetrischen Quantifizierung von Läsionen in Arterien diese Größe bereitzustellen, aber die Autoren keine Kenntnis von Publikationen, die diese Anwendung zeigen. Vielleicht nicht überraschend, ist die Bildqualität in OPT legen mikroskopischen Techniken (die natürlich nur auf kleinere Stichproben durchgeführt werden können). Vorgeschlagene Verfeinerungen wiederaufbaun von Daten kann diese Einschränkung zu beheben, indem zukünftige Verbesserung der Bildqualität 19,20. Ein weiteres Anliegen ist, dass methodische Gewebebearbeitung verändert Eigenschaften der Probe. Zum Beispiel die lipophile Natur der Clearingstelle, dürfte Lipid von atherosklerotischen Läsionen zu entfernen, während vor Austrocknung kann Schrumpfung führen (obwohl natürlich auch Dehydration und Lipidentfernungsschritte eine Funktion von Benzylalkohol / Benzylbenzoat (BABB) Probenvorbereitung für die Einbettung in Paraffin). BABB wurde in dieser Untersuchung als verwendet wird, im Vergleich zu hydrophilen Clearingstellen (zB Glycerin 21) es nur kleine Veränderungen in der Morphologie bewirkt. Es gibt verschiedene Möglichkeiten für die weitere Entwicklung und Verfeinerung der OPT, insbesondere im Hinblick auf die Verfolgung der 3-dimensionale Anordnung von Schlüsselzellen und Signalfaktoren im arteriellen Remodeling beteiligt. Die starke Autofluoreszenz Arteriengewebe, das eine solche istn Vorteil bei der Erzeugung von anatomischen Bildern wird nicht durch bestehende Verfahren zum Bleichen von 22 abgeschreckt und können die Verwendung von Fluoreszenzsonden zu beschränken, um RNA und Proteinverteilungsmuster zu beurteilen. Die Verwendung von farbmetrischen Sonden (zB β-Galactosidase) durch Übertragung Bildgebung visualisiert kann diese Einschränkung zu überwinden. Abschließend weist OPT großes Potential für 3-dimensionale Darstellung von Läsionen in der Intima von murinen Arterien. Es stellt einen erheblichen Fortschritt gegenüber 2-dimensionale Methoden, die in der Regel sind arbeitsintensiv und nicht wirksam vertreten Gesamt Läsionsvolumen. OPT ist relativ schnell, bequem und zerstörungsfrei. Neue Entwicklungen in der Bildanalyse versprechen, die Macht und die Nützlichkeit der Technik weiter zu erhöhen.

Die Bildung von arteriellen Läsionen ist zentral für die hohe Morbidität und Mortalität mit einer kardiovaskulären Erkrankung 1 verbunden. Läsionsbildung wird als durch einen ungehinderten entzündliche Reaktion hervorgerufen werden, um Verletzungen 2 arterielle. Atherosklerotischen Läsionen bilden sich langsam in Reaktion auf chronische Schädigung der Arterienwand in der Erwägung, Restenose Läsionen entwickeln sich schnell nach einer akuten mechanischen Beschädigungen (beispielsweise nach Stentimplantation). Die Mechanismen, die für die Entwicklung von arteriellen Läsionen tragen erheblich durch die Verwendung von geeigneten Tiermodellen häufig in Kombination mit relevanten genetischen Manipulationen 1 geklärt. Analyse der Läsionsgröße und Zusammensetzung hat klassischer stark abhing ex vivo, 2-dimensional Histologie (obwohl dies ändert sich mit der Entwicklung von verbesserten Verfahren zur in vivo und ex vivo-Detektion und Analyse von Läsionen im Kleintiere &lt;sup&gt; 3). Die histologische Analyse von arteriellen Läsionen ist arbeitsintensiv, zeitaufwendig und begrenzt aussage von 3-dimensionalen Struktur. Beispielsweise wird Läsion Belastung üblicherweise durch Messen der Querschnittsfläche einer Läsion beurteilt (entweder an zufällig ausgewählten Stellen oder an der Stelle der maximalen Okklusion). Dies stellt eine unvollständige Analyse der Gesamtbelastung Läsion. Whole-Mount-3-dimensionalen Bildtechnologie stellt eine mögliche Lösung für dieses Problem, aber überraschend wenige geeignete Ansätze wurden beschrieben. Dies kann darauf zurückzuführen vorwiegend auf die Größe des Maus-Arterien, die zu groß für die Einzelphotonen Konfokalmikroskopie aber zu klein für die Magnetresonanztomographie (MRI) 4 und der Röntgen-Computertomographie (CT) 5 sein. Anwendung der Ex-vivo-MRI und Mikro-CT auf das Studium der atherosklerotischen Läsionen in Mäusen schlägt sie bieten begrenzte Auflösung, auch in größeren Arterien. Hinzu kommt, benötigt die relativ langen MesszeitenDurchsatz begrenzen (und erhöhen Scankosten) 4,6. Entwicklung von neuen optischen bildgebenden Verfahren (wie beispielsweise die optische Kohärenztomographie 3,7 und photoakustischen Tomographie 8) bietet noch viel Potenzial zur Verbesserung der Darstellung von Läsionen in murine Arterien. Ähnliches Potential wird durch optische Projektionstomografie (OPT), die entwickelt wurde, um die Analyse der Maus-Embryonen ermöglichen gezeigt. OPT wurde auf Bild Proben im Bereich von ~ 0,3 bis 10 mm im Durchmesser 9 ausgelegt. Übertragungsabbildungs ​​zeichnet die Opazität eines halbdurchscheinend Probe mit polychromatischer sichtbares Licht und können zur Identifizierung von anatomischen Strukturen verwendet werden. Emissionsabbildungssätze Emission von Licht nach der Anregung bei spezifischen Wellenlängen von endogenen (beispielsweise Kollagen, Elastin) und exogenen Fluorophoren in der Probe. Dies kann auch eine anatomische Information (da verschiedene Gewebekomponenten kann in der Art und Dichte des autofluoreszierenden Arten unterscheidenvorhanden). Zusätzlich kann die Verteilung der Immunreaktivität oder die Genexpression unter Verwendung von geeigneten fluoreszierenden Sonden 10 festgestellt werden. Für beide Bildaufnahmemodus (Übertragung oder Emission) wird Licht auf eine ladungsgekoppelte Anordnung fokussiert, um iterative Bildaufnahme, wie die Probe dreht (in der Regel 400 Bilder bei 0,9 ° Schritten) ermöglichen. Diese können für die Berechnung des Volumens durch Standard tomographische Rekonstruktionsverfahren (wie der gefilterten Rückprojektion (mit einem Kegel-Algorithmus) oder der iterativen Rekonstruktion) verwendet werden. Dieses Video zeigt unsere neue Anwendung der OPT für eine schnelle, messbare und kostengünstige 3-dimensionale Analyse von atherosklerotischen Läsionen und neointimale, wie bereits in Kirkby et al. 11 beschrieben. Die Technik wurde gezeigt, geeignet zur Quantifizierung Läsionsgröße in drei häufigsten verwendeten Modelle zu sein: (i) Femoralarterie Draht-Verletzung; (Ii) Ligation Femoralarterie, und (iii) Diät-induzierten Atherosklerose in apolipoprotein E defizienten (apoE - / -) Mäusen.

<table><tbody><tr><td>Operationsmikroskop</td><td>Zeiss, Deutschland</td><td></td><td>OPMI Pico i</td></tr><tr><td>Anästhesiemaschine</td><td>Vet Tech, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluovac</td><td>Harvard Apparatur UK</td><td>340387</td><td></td></tr><tr><td>Fluosorber</td><td>Harvard Apparatus UK</td><td>340415</td><td></td></tr><tr><td>Bead Sterilizer</td><td>Fine Science Tools, UK</td><td>1800-45</td><td></td></tr><tr><td>Beheizte Matte</td><td>Fine Sceince Werkzeuge, UK</td><td>21061-10</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>MS1602S</td><td>PB1502 oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Nahtmaterial</td><td>Ethicon, UK</td><td></td><td>5/0 Mersilk</td></tr><tr><td>Guidewire</td><td>Cook Inc, USA</td><td>C-PMS-251</td><td>0.014"</td></tr><tr><td>Nahtseide</td><td>Fine Science Tools, UK</td><td>18020-60</td><td>6/0 Mersilk</td></tr><tr><td>Chirurgische Werkzeuge</td><td>Fine Science Tools, UK</td><td>14058-09</td><td>Toughcut Irisschere</td></tr><tr><td>Cohan-Vannas Federschere</td><td>Fine Science Tools, UK</td><td>15000-01</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Pinzette</td><td>Fine Science Tools, UK</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Moria Iris Pinzette</td><td>Fine Science Tools, Großbritannien</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito Hämostat</td><td>Fine Science Tools, UK</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>Bulldog Clips</td><td>Fine Science Tools, UK</td><td>18050-35</td><td></td></tr><tr><td>Bioptonics 3001 Tomograph</td><td>Bioptonics, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetic OPT Mount</td><td>Bioptonics, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell Inc, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Gilson</td><td>F117606</td><td>Minipuls 3</td></tr><tr><td>DataViewer Software&nbsp;</td><td>Skyscan, Belgien</td><td>v.1.4.4</td><td></td></tr><tr><td>NRecon Software&nbsp;</td><td>Skyscan, Belgien</td><td>v.1.6.8</td><td></td></tr><tr><td>CTan-Software</td><td>Skyscan, Belgien</td><td>v.1.12</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Merial Animal Health Ltd, Großbritannien</td><td>AP/Drugs/220/96</td><td>100% Inhalationsdampf, flüssig</td></tr><tr><td>Medizinischer Sauerstoff</td><td>BOC Medical, Großbritannien</td><td>UN1072</td><td></td></tr><tr><td>Vetergesic</td><td>Alstoe Animal Health Ltd, Großbritannien</td><td></td><td>0,3 mg/ml</td></tr><tr><td>1% Lignocain</td><td>Hamlen Pharmaceuticals, Großbritannien</td><td>LD1010</td><td>10 ml Ampulle</td></tr><tr><td>EMLA Creme</td><td>Astra Zeneca, Großbritannien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natrium Pentobarbital</td><td>Ceva Animal Health Ltd, Großbritannien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Western Diet</td><td>Research Diets, USA</td><td>D12079B</td><td>0,2% Cholesterin</td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma UK</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Heparin (Schleim)</td><td>Leo Laboratories, Großbritannien</td><td>PL0043/003GR</td><td>250.000 Einheiten</td></tr><tr><td>Neutral gepuffertes Formalin</td><td>Sigma, UK</td><td>HT501128</td><td>10</td>%</tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR BDH Prolabo, UK</td><td>20821.33</td><td>Absolute AnalaR&nbsp;</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen, Vereinigtes Königreich</td><td>16020050</td><td>Filterpapier mit niedrigem Schmelzpunkt</td></tr><tr><td></td><td>GE Healthcare, Großbritannien</td><td>113v</td><td>Whatman</td></tr><tr><td>Cyanacrylat-Klebstoff</td><td>Henkel, Großbritannien</td><td>4304</td><td>Loctite</td></tr><tr><td>Benzylalkohol</td><td>Sigma, Großbritannien</td><td>B6630</td><td></td></tr><tr><td>Benzylbenzoat</td><td>Sigma, Großbritannien</td><td>402834</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR BDH Prolabo, Großbritannien</td><td>20856.296</td><td>100%</td></tr></tbody></table>

generation und 3-dimensional quantifizierung der arterielle läsionen in mäuse mit optischen projektionstomographie

Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography

Die Erzeugung und Analyse von Gefäßläsionen in geeigneten Tiermodellen ist ein Eckpfeiler der Erforschung von Herzkreislauferkrankungen, Erzeugung wichtige Informationen über die Pathogenese der Läsion Bildung und die Wirkung neuer Therapien. Verwendung von Atherosklerose anfälligen Mäusen, chirurgische Verfahren Läsion Induktion und diätetische Modifikation dramatisch verbesserte Verständnis der Mechanismen, die die Entwicklung der Krankheit und dem Potential neuer Anwendungen beitragen. Klassischerweise Analyse der Läsionen durchgeführt ex vivo unter Verwendung von 2-dimensionalen histologische Techniken. Dieser Artikel beschreibt die Anwendung des optischen Projektionstomografie (OPT), um 3-dimensionale Quantifizierung von arteriellen Läsionen. Da diese Technik ist nicht destruktiv, kann sie als Zusatz zu Standard histologischen und immunhistochemischen Analysen verwendet werden. Neointimale Läsionen wurden durch Drahteinführungs oder Unterbindung der Maus Oberschenkelkunst induziertery während atherosklerotische Läsionen wurden durch Verabreichung einer atherogenen Diät auf apoE-defiziente Mäuse erzeugt. Läsionen wurden mit OPT Abbildungs ​​autofluoreszierender Emission gefolgt von komplementären histologische und immunhistochemische Analyse untersucht. OPT klar unterschieden Läsionen von der zugrunde liegenden Gefäßwand. Läsionsgröße wurde in 2-dimensionalen Abschnitte Planimetrie berechnet, was die Berechnung von Läsionsvolumen und maximale Querschnittsfläche. Erzeugt mit OPT Daten waren konsistent mit Messungen mit Histologie erhalten, bestätigt die Genauigkeit der Technik und sein Potential als Ergänzung (eher als alternative) zu herkömmlichen Analyseverfahren. Diese Arbeit zeigt das Potenzial der OPT zur Abbildung von atherosklerotischen Läsionen und neointimale. Es bietet eine schnelle, dringend benötigte ex vivo-Technik für die routinemäßige 3-dimensionalen Quantifizierung der Gefäßumbau.

Vorabtastung gesunder (unverletzten) murine Oberschenkelarterien (n = 5), dass Übertragungsabbildungs ​​keine präparativ Bilder. Dies war eine Folge der ausgeglichenen Adern immer zu transparent (anstatt zu opak) zur Übertragung imaging.However, ist dies vorteilhaft für die Emissions Bildgebung, da es keine Absorption / Streuung des emittierten Signals. Im Gegensatz dazu Autofluoreszenz Femoralarterien stark im Emissionskanal, mit dem größten Signal nach Anregung bei 405 bis 445 nm (im Einklang mit einer 410 nm Anregungsspitzen für Elastin 14). 2-dimensionalen Schichten aus diesen Bildern rekonstruiert klar unterschieden das Medium aus dem Hohlraum und Adventitia und Lumen. In murinen Oberschenkelarterien entnommen 28 Tage nach der Draht- (n = 6) oder Verknüpfungs (n = 5) induzierte Schädigung neointimale Verdickung zeigte sich in nicht-Tomographieemissions Vorsprüngen (3A). Im rekonstruierten 2-dimensional Scheiben könnte konzentrischen neointimale Läsionen aus den Medien von ihren schwächeren Emissions (3B und Abbildung S1) zu unterscheiden. OPT Emissions Bilder der ganze Berg Proben des Aortenbogens und seiner Zweige von atherosklerotischen Mäusen (n = 8) identifizierten Läsionen, die mit der zu erwartenden anatomische Verteilung (dh., In der kleinen Kurvatur des Aortenbogens, der Truncus brachiocephalicus und die Ursprünge der linke Halsschlag und linken Schlüsselbeinarterien (4A). Schnittbilder angedeutet, dass es sich in der Regel exzentrische Läsionen und waren leicht von den Medien und Lumen (4B, Fakten S2 und S3). Verarbeitung Arterien für die histologische Analyse folgende OPT bestätigte die zerstörungsfreie Art des OPT, mit Abschnitten mit histologischen (USA Trichrome, Picr erfolgreich gefärbtosirius rot) und immunhistochemischen (α-SMA, Mac-2) Techniken (3C und 4C). Die Messung der Größe der Läsion mit OPT hat sich gezeigt, die mit Messungen mittels Bildanalyse von histologischen Schnitten von der gleichen Arterie 11 entnommen erhalten sein. Planimetrische Messungen Läsionsfläche von OPT und Histologie eng durch lineare Regression korreliert für drahtlose (R 2 = 0,92) und Ligation induzierte (R 2 = 0,89) neointimale Läsionen und atherosklerotischen Plaques (R 2 = 0,85) erhalten. Ein wichtiger Vorteil der OPT ist ihre Fähigkeit, 3-dimensionale Analyse zu ermöglichen. Durch die Entwicklung von Volumen Quantifizierung von Läsionen, die mit dieser Technik konnten wir die Läsion Volumina in kabel Aufzeichnung (0,1100 ± 0,0091 mm 3; n = 6) und Ligation-verletzten Oberschenkelarterien (0,0200 ± 0,0089 mm 3; n = 5) und auch in atherosklerotischen brachiocephalic Arterien (0.180 ± 0,018 mm 3; n = 8). Messungen wurden in hohem Maße reproduzierbar (Variationskoeffizienten von 5,4%, 11,4% bzw. 4,8%, bzw. n = 4) für alle Arten von Läsionen. Neointimale Läsionen in draht verletzten Gefäße waren größer (p &lt;0,0001) als die durch Ligation erzeugt, im Einklang mit dem höheren Grad der Schäden, die durch die ehemalige Schaden ein. Die erzeugten Daten können auch als Läsion Profile (5) ausgedrückt und für dynamische, qualitative Beurteilung gemacht werden (siehe S1 - S3). Dieser Ansatz zeigte deutlich die Ausdehnung der Läsionsbildung in Reaktion auf verschiedene Verletzungen Verfahren und hob die ungleichmäßige Verteilung der Bildung von Läsionen in verletzten Gefäßen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50627/50627fig1.jpg" /> Abbildung 1: Methoden für die Einleitung Läsion Bildung in Maus-Oberschenkelarterie &amp; #.160 (a) Retrograde Insertion einer Angioplastie in die Femoralarterie Führungsdraht mittels einer Arteriotomie in der A. poplitea stimuliert die Bildung von Läsionen in Reaktion auf eine Verletzung und Entfernen des Endothels zu dehnen. Blutstrom über den verletzten Gefäßabschnitt wiederhergestellt. (B) Proliferation der Neointima in Abwesenheit von intraluminalen Streck Denudation oder Unterbrechung des Blutflusses kann durch Ligation entweder den Oberschenkel- oder Kniekehlenarterie unmittelbar distal zu der Bifurkation Oberschenkelarterie induziert werden. (C) Eine strengere nicht denuding Verletzung / Proliferationsantwort kann durch Ligation sowohl die Oberschenkel- und Kniekehlenarterien über den Verzweigungspunkt des gemeinsamen Oberschenkelarterie induziert werden. Diese Technik wird auch die Durchblutung in dem distalen Abschnitt des Oberschenkelarterie zu blockieren. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50627/50627fig2.jpg" /> Abb. 2: Kenn Ablagerung von Atherom in der Maus Aortenbogen Atherosklerose neigen (Apolipopotein E defizienten Mäusen) gefüttert einen hohen Cholesterin-westliche Ernährung für 12 Wochen entwickeln ein charakteristisches Muster der Läsion Abscheidung in den Aortenbogen und seine wichtigsten Branchen. Wie gezeigt, Läsionen sichtbar (Pfeile), durch grobe Inspektion unter einem Binokular, im Aortenbogen, der Truncus brachiocephalicus und der Ostien der linken Halsschlagader und der linken Schlüsselbeinarterie. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/50627/50627fig3.jpg" /> Abb. 3: Bildung von Läsionen nach Ligation des linken Oberschenkelarterie (A) Nicht-Fluoreszenz-Emissionstomographiebilder (invertiert, um Klarheit zu erhöhen - dunkle Bereiche entsprechen stärkere Emission) die Identifizierung der Verdickung der Intima (red arrowheAnzeigen). (B) Ausgeprägte Gefäßregionen und das Lumen können in tomographischen Rekonstruktionen unterscheiden. (C) Die histologische Analyse (USA trichrome) betont die klare Ähnlichkeit mit Bildern mit OPT erhalten. Maßstabsbalken in (AC) sind 200 mm. Von Kirkby et al. 11 Maßstabsbalken in (AC) angepasst sind 200 um. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/50627/50627fig4.jpg" /> Abb. 4: Imaging Atherom im Aortenbogen von Atherosklerose neigen Mäusen (A) Atherom (rote Pfeile) ist leicht ersichtlich, in einer Nicht-Schichtaufnahmen (invertiert, so daß dunkleren Bereiche zeigen stärkere Emission verbessert so die Klarheit) des Aortenbogens, in Websites wie vorhergesagt Atherom-Lager durch Inspektion unter dem Lichtmikroskop (siehe Abbildung 2). (B) Das Muster der Verteilung wird in tomographischen cr bestätigtoss-Sektionen. (C) Die histologische (USA trichrome) Färbung zeigt große Ähnlichkeit mit tomographischen Abschnitten und Immunhistochemie unter Verwendung von mehreren verschiedenen Antikörpern unterstreicht die Komplementarität von OPT mit traditionellen Ansätze zur Läsion Analyse. Maßstabsbalken in (A-B) sind 1 mm; Maßstabsleiste in (C) ist 250 um. RSA, rechten A. subclavia; RCA, rechte Halsschlagader; LCA, linken Halsschlagader; LSA, links subclavia; BCA, brachiocephalic Arterie; AAO, aufsteigend Aorta; Dao, Aorta descendens. Von Kirkby et al angepasst. 11 <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/50627/50627fig5.jpg" /> Figur 5: Analyse der Läsion und Lumen Profile anzeigt unterschiedlichem Ausmaß der neointimalen Proliferation in Reaktion auf verschiedene Methoden der arteriellen Verletzung optische Projektionstomografie ermöglicht Läsion und Lumenquerschnitts Messung!.ts gegen Entfernung entlang der Oberschenkelarterie, aufgetragen werden. Dies zeigt deutlich, dass, verglichen mit einem unverletzten Arterie (A), partielle Ligation (B) erzeugt kleine, relativ diskreten Läsionen, die Gesamtbindung (C) produziert komplette Okklusion am Ort der Ligation, aber die Läsion nicht weit entlang der Arterie erweitern . Intraluminal Draht Schädigung (D) eine Läsion, die fast vollständig verschließt das distale Teil der Probe ist und sich entlang der gesamten Länge des abgetasteten Schnitt der Arterie. Von Kirkby et al angepasst. 11 Abbildung S1. Animated Rekonstruktion der Schnittbilder nach Ligation Verletzungen von einer Maus Femoralarterie gewonnen. Dies ist Art von animiertes Bild nützlich für sowohl qualitative und quantitative Analyse. Als die Animation bewegt sich von dem proximalen zu dem distalen Abschnitt der Arterie die allmähliche Entwicklung eines okklusiven Neointima, Scheibenernible aus dem Lumen und der Medien, ist leicht ersichtlich. Seitenzweige können leicht identifiziert werden, und es ist offensichtlich, luminale Okklusion und nach außen Remodeling der Arterie wie die Läsion in der Größe zunimmt. Vollständige Verschluss des Gefäßes eintritt, nachdem der Ligationsstelle erreicht ist. Von Kirkby et al angepasst. 11 .. Abbildung S2 Animated Rekonstruktion von Querschnittsbildern eines Aortenbogen aus einer Atherosklerose anfällig Maus Die Animation beginnt mit Querschnitten des aufsteigenden (links - die zuerst erscheint) und absteigend (rechts) Aorta. Kleine Läsionen erscheinen in der aufsteigenden Aorta als Scan bewegt sich in Richtung des Aortenbogens. Die Bilder dann durch den Bogen zu bewegen, um den stark lädierten Ostien des brachiocephalicus (links), linke Halsschlag (Mitte) und linken Schlüsselbein (rechts) Arterien zeigen. Da der Scan bewegt distal entlang dieser Zweige die Läsionen schrittweise zu reduzieren und verschwinden, zuerst in der subcLavian Arterie, dann in der Carotis und schließlich in die Arteria brachiocephalica. Interessanterweise ist die Läsion in der brachiocephalic Arterie bewegt sich auf den Strömungsteiler wie diesem Schiff teilt sich in die rechte Halsschlagader und rechten subclavia. Von Kirkby et al angepasst. 11 Abbildung S3. Animation, Volumen-gerenderten Bild eines Aortenbogen aus einer Atherosklerose anfällig Maus. Optische Projektionstomografie erlaubt die Erzeugung von 3-dimensionalen Bildern, in diesem Fall demonstriert Läsion Verteilung in den Aortenbogen eines Apolipoprotein E-defizienten Mäusen. (A) Atherom ist in der erwarteten Stellen vorhanden (in der gesamten brachiocephalic Arterie, in der Ostien der linken Halsschlagader und subclavia und in der kleinen Kurvatur des Aortenbogens). (B) Segmentierung und Wiedergabe der Läsion (in rot) tragenden Querschnitte unterstreicht die Verteilung der Plaques, wenn sie auf dem Originalbild überlagert.Von Kirkby et al angepasst. 11

Die Ex-vivo-Analyse von arteriellen Läsionen aus Tiermodellen für Herz-Kreislauf-Erkrankungen stützt sich klassischerweise auf histologische und immunhistochemische Techniken. Diese ermöglichen 2-dimensionale Messungen in 3-dimensionalen Läsionen. Dieses Manuskript beschreibt die Erzeugung von arteriellen Läsionen für die quantitative Analyse in 3-Dimensionen mittels optischer Projektionstomographie.

Generation und 3-Dimensional Quantifizierung der arterielle Läsionen in Mäuse mit optischen Projektionstomographie

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu zeigen, wie die optische Projektionstomographie zur Visualisierung und dreidimensionalen Quantifizierung atherosklerotischer und neointimaler Läsionen bei der Maus eingesetzt werden kann. Dazu werden zunächst arterielle Läsionen bei Mäusen entweder chirurgisch oder durch Fütterung mit einer cholesterinreichen Nahrung bei genetisch prädisponierten Mäusen erzeugt. Im nächsten Schritt wird die Zielarterie isoliert und mittels optischer Projektionstomographie untersucht.Die letzten Schritte bestehen darin, die Bildrekonstruktion durchzuführen, die Läsion zu identifizieren und das Läsionsvolumen zu messen. Letztendlich können die Ergebnisse anatomische Rekonstruktionen der Läsion sowie eine Quantifizierung des Läsionsvolumens und der arteriellen Engstelle mittels Bildanalyse zeigen. Unsere Arbeitsgruppe beschäftigt sich damit, die Mechanismen zu verstehen, die der Entstehung von Läsionen zugrunde liegen und zu arteriellen Engstellen führen, welche lebensbedrohliche Komplikationen wie Herzinfarkt und Schlaganfall verursachen können.Diese Anwendung der optischen Projektionstomographie wurde in unserer Arbeitsgruppe von Dr. Nicholas Kirkby in Zusammenarbeit mit Dr. Lucy Lowe entwickelt und wird von Dr. Jung Shi Wu demonstriert, einem Postdoktoranden in unseren Laboren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Histologie und Immunhistochemie liegt darin, dass sie weniger arbeitsaufwändig ist und eine dreidimensionale anstelle einer zweidimensionalen Analyse ermöglicht. Die Technik zur Induktion von Läsionen in der Arteria femoralis ist abgewandelt von Methoden von R et al. und Sada et al.Das Textprotokoll beschreibt, wie atherosklerotische Läsionen durch gezielte Ernährungsmanipulation induziert werden können. Beginnen Sie mit einer 10 bis 12 Wochen alten C57BL/6-Maus mit einem Gewicht zwischen 25 und 30 Gramm. Nach der Anästhesie legen Sie die Maus auf eine Wärmematte, um ihre Körpertemperatur zu stabilisieren, und führen über eine Nasenkappe Isofluran mit einer Konzentration von 2 bis 3 % zu.Wenn die Maus nicht auf eine Zehenquetschung reagiert, verabreichen Sie Buprenorphin in einer Dosis von 0,1 Milligramm pro Kilogramm. Legen Sie anschließend die Maus auf den Rücken und rasieren Sie die ventrale Fläche des linken Hinterbeins. Anschließend führen Sie einen Schnitt durch, um die Muskulatur des oberen Hinterbeins zwischen der Bifurkation der A. poplitea und der Bauchwand freizulegen.Führen Sie eine stumpfe Dissektion durch, um während des gesamten Verfahrens den Nervus femoralis von der Arteria und Vena femoralis zu isolieren. Halten Sie das Gewebe mit 1 % (Gewicht pro Volumen) lidocainhaltigem Lösungsmittel für Hunde feucht. Bringen Sie anschließend temporäre Ligaturen aus 6.0 Mersilken um die Arteria und Vena femoralis nahe der Bauchwand und unmittelbar unterhalb des Abzweigs zur Arteria poplitea an.Diese dienen zur Kontrolle des Blutflusses. Danach die A. poplitea zwei bis fünf Millimeter distal zum Abzweig der A. femoralis isolieren und die A. poplitea unterhalb der A. poplitea ligieren. Eine zweite Ligatur anlegen.Nun einen kleinen Einschnitt für die Drahteinführung in die A. poplitea unmittelbar distal zur Bifurkation mit der A. femoralis anlegen. Den proximalen vorübergehenden Ligaturstrang abdrücken, um eine Blutung durch den Einschnitt in die A. femoralis in Richtung Bauchwand zu verhindern. Einen 0,014 inch G-Draht etwa ein bis 1,5 Zentimeter einführen.Lassen Sie es 30 Sekunden lang an Ort und Stelle und nehmen Sie es dann heraus. Anschließend mit den Ligaturen die A. poplitea oberhalb des Einschnitts ligieren. Achten Sie darauf, eine Okklusion der Arteria femoralis zu vermeiden.Entfernen Sie nun die temporären Ligaturen. Verschließen Sie die Wunde mit diskontinuierlichen Laufnahten unter Verwendung von 5,0 Mercal. Anschließend EMLA-Creme auftragen.Lassen Sie das Tier im Erholungskäfig das Bewusstsein und die Bewegungsfähigkeit wiedererlangen, bevor es in den Heimkäfig zurückgebracht wird. Es ist damit zu rechnen, dass das Bein zwei bis drei Tage lang lahmt, dies bedeutet jedoch nicht, dass die Maus isoliert werden muss. Für die OPT muss die Maus euthanasiert werden; leiten Sie eine Tiefenbetäubung mit Pentobarbital ein.Danach eine transkardiale Perfusionsfixierung mit Exsanguination durchführen. Anschließend die Femoralarterien oder den Aortenbogen mit seinen Ästen isolieren. Dabei jegliches überflüssige perivaskuläre Gewebe entfernen.Anschließend das Gewebe über Nacht in 10 % neutral gepuffertem Formalin nachfixieren. Am nächsten Tag das Gewebe entweder in 70 % Ethanol aufbewahren oder damit fortfahren, die Arterien in filtriertem 1,5 % LMP-Agarose einzubetten. Das Gewebe vorsichtig in die geschmolzene Agarose bei etwa 40 Grad Celsius absenken.Schneiden Sie die Aeros, um eine konische Form zu erzeugen. Dehydrieren Sie dieses Präparat anschließend mindestens 12 Stunden in 100 % Methanol. Nach der Dehydrierung klären Sie die Gefäße in einem Gemisch aus Benzylalkohol und Benzylbenzoat im Verhältnis 1:2.Lassen Sie die Gefäße 12 bis 24 Stunden in dieser Lösung inkubieren. Am nächsten Tag geben Sie die geklärte Probe in das Tomographiegerät, das vorab kalibriert sein sollte. Die Auflösung wird auf 1024 eingestellt.Mit 1024 Pixeln. Stellen Sie die Vergrößerung für den interessierenden Bereich ein. Die Z-Achse wird automatisch auf dieselbe Auflösung eingestellt.Die Voxelgröße beträgt etwa 200 Mikrometer. Positionieren Sie als Nächstes die Probe mithilfe des Hellfeldkanals so, dass sie sich um ihre eigene Achse im Zentrum des Sichtfeldes dreht. Stellen Sie mithilfe des GFP-Emissionskanals den Fokus ein und passen Sie die Belichtung an, um den Dynamikbereich des Bildes zu maximieren.Vermeiden Sie eine Übersättigung. Scannen Sie das Objekt nun im GFP-Emissionskanal mit Schritten von 0,9 Grad. Die Proben sollten anschließend mindestens 24 Stunden lang in 100 % Methanol zurückgestellt werden, bevor sie in Wachs eingebettet werden.Öffnen Sie die erfassten Bilder zur histologischen Analyse in der n recon-Software oder einer ähnlichen Software mithilfe einer Datenbetrachtungs-Software. Überprüfen Sie die Qualität der Bildrekonstruktion, verbessern Sie die Bildqualität, passen Sie die Bildintensität an und lassen Sie die Software eine eventuelle Fehlausrichtung der Probe gegenüber ihrer idealen Rotationsachse kompensieren. Definieren Sie für jeden Scan den vertikalen interessierenden Bereich, der die Läsion enthält.Verfolgen Sie in jeder 50. Scan-Zeile den Rand zwischen dem Medium und der Position der internen elastischen Lamina. Die Software kann dann den Rand in allen anderen Scans interpolieren, überprüfen Sie diese Interpolationen manuell und korrigieren Sie sie bei Bedarf. Erstellen Sie nun einen Satz binärer Bilder, bei denen weiße Pixel die Neointima und schwarze Pixel das durchgängige Lumen darstellen.Dies wird durch die Festlegung der Intensitätsschwellenwerte erreicht. Sobald dies erfolgt ist, entspricht das Objektvolumen dem gesamten Läsionsvolumen, und das Lumenvolumen ergibt sich aus dem Gesamtvolumen abzüglich des Objektvolumens. So wird die Verteilung der Läsion und des Lumens entlang der axialen Länge beurteilt.Murine Femoralarterien wurden 28 Tage nach einer drahtinduzierten oder ligaturinduzierten Verletzung entnommen. Eine neointimale Verdickung war in den Emissionsprojektionen in rekonstruierten zweidimensionalen Schnitten erkennbar. Konzentrische neointimale Läsionen konnten unterschieden werden.Optische Projektionstomographie-Emissionsbilder des gesamten Aortenbogens von einer APOE-defizienten Maus zeigten die erwarteten Läsionen an der kleineren Krümmung des Aortenbogens, der Arteria brachiocephalica sowie an den Ursprüngen der linken Arteria carotis und der Arteria subclavia. Dieselbe Läsion wurde segmentiert und rot dargestellt. Um die Verteilung der Plaques hervorzuheben, wenn sie über das ursprüngliche Bild gelegt wurden, konnten Media und Lumen in Querschnittsbildern unterschieden werden, wodurch ersichtlich wurde, dass es sich um exzentrische Läsionen handelte.Hier nehmen die Läsionen im Verlauf der distalen Bewegung der Aufnahme allmählich ab und verschwinden zuerst in der Arteria subclavia, dann in der Arteria carotis und schließlich in der Arteria brachiocephalica. Interessanterweise verlagert sich diese Läsion in der Arteria brachiocephalica auf den Flusstrenner, wenn sich dieses Gefäß in die rechte A. carotis und die rechte A. subclavia aufteilt. Nach dem OPT-Verfahren können weitere Methoden wie die Histologie und die Immunhistochemie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise welche Zusammensetzung die Läsion aufweist.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Wissenschaftlern auf dem Gebiet der Geforschkung den Weg, um die Rolle von endothelialen Rezeptoren, Lektinen und steroidmetabolisierenden Enzymen bei der Entstehung von neointimalen und atherosklerotischen Läsionen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Läsionen aus Nierenarterien mithilfe der optischen Projektionstomographie gewinnt und analysiert.

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Wir beschreiben ein Protokoll für hybride Bildgebung, das die Fluoreszenz-vermittelte Tomographie (FMT) mit der Mikro-Computertomographie (μCT) kombiniert. Nach der Fusion und Rekonstruktion führen wir eine interaktive Organsegmentierung durch, um quantitative Messungen der Fluoreszenzverteilung zu extrahieren.

Hybrid μCT-FMT-Bildgebung und Bildanalyse

Implantation von autologen und allogenen Knochentransplantaten bilden akzeptiert Ansätze zur Hauptgesichtsschädelknochenverlust zu behandeln. Doch die Wirkung der Transplantatzusammensetzung auf das Zusammenspiel zwischen den Neovaskularisation, Zelldifferenzierung und Knochenbildung, ist unklar. Wir präsentieren eine multimodale Bildgebungsprotokoll zum Ziel, die Angiogenese-Osteogenese Interdependenz im Transplantat Nähe aufzuklären.

Computertomographie und Optical Imaging von Osteogenesis-Angiogenese-Kopplung an Integration von Schädelknochen Autografts und Allografts Beurteilen

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von kombinierten nahen Infrarot fluoreszierende (NIRF) Bildgebung und Mikrocomputertomographie (microCT) für zerebrale Thromboemboli zu visualisieren. Diese Technik ermöglicht die Quantifizierung von Thrombus Belastung und Evolution. Die NIRF-Bildgebungstechnik zur Visualisierung von Thrombus innerhalb lebenden Tieren unter Verwendung von Gold-Nanopartikeln Thrombus in exzidierten Gehirn fluoreszenzmarkierte, während die microCT Technik visualisiert.

Kombinierte Near-Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung und Mikrocomputertomographie für Direkt Visualizing Cerebral Thromboembolie

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Blutgefäß Bildung in Vivo zu visualisieren und in Echtzeit in 3D Gerüste multiphoton Mikroskopie. Angiogenese in gentechnisch veränderten Gerüste wurde in einem murinen calvarial kritische Knochen-defekt-Modell untersucht. Mehr neue Blutgefäße waren in der Behandlungsgruppe als Kontrollen erkannt.

Visualisierung von Angiogenese durch Multiphoton Mikroskopie In Vivo in gentechnisch veränderten 3D-PLGA/nHAp Gerüst für Calvarial kritische Knochen defekt Reparatur

Murine Modelle der Arteriosklerose sind nützliche Werkzeuge, um pathogene Pfade auf molekularer Ebene zu untersuchen, erfordern aber eine standardisierte Quantifizierung der Läsionsentwicklung. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Bestimmung der Läsionsgröße in den hauptartiellen Gefäßen, einschließlich der Aortenwurzel, des Aortenbogens und der brachiocephalen Arterie.

Quantifizierung von Atherosklerose bei Mäusen

Hier beschreiben wir eine Visualisierungs- und Quantifizierungsmethode für murine Hintergliedmaßengefäße mittels Mikro-Röntgen-Computertomographie.

Probenvorbereitung für computertomographisch basierte dreidimensionale Visualisierung von Murinen Hintergliedmaßengefäßen

In dieser Arbeit stellen wir optimierte Gewebe-Clearing-Protokolle vor, um die murine Aorta in drei Dimensionen (3D) abzubilden. Wir beschreiben modernste Verfahren zur Immunfärbung, optischen Klärung und Bildgebung mit dem Ziel, die anatomische Nähe des peripheren Nervensystems zu atherosklerotischen Plaques und die Adventitia bei Atherosklerose zu definieren.

Dreidimensionale Bildgebung von Aortengewebe bei Atherosklerose

Erfahren Sie die optische Projektionstomografie zur dreidimensionalen Visualisierung und Quantifizierung arterieller Läsionen bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht präzise Volumenmessungen von atherosklerotischen Veränderungen.

Generation und 3-Dimensional Quantifizierung der arterielle Läsionen in Mäuse mit optischen Projektionstomographie

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