Generation und 3-Dimensional Quantifizierung der arterielle Läsionen in Mäuse mit optischen Projektionstomographie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu zeigen, wie die optische Projektionstomographie zur Visualisierung und dreidimensionalen Quantifizierung von atherosklerotischen und neointimalen Läsionen in der Maus eingesetzt werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst arterielle Läsionen bei Mäusen erzeugt werden, entweder chirurgisch oder durch Verfütterung einer cholesterinreichen Diät an Mäuse mit einer Veranlagung zur Entwicklung von Atherosklerose. Der nächste Schritt besteht darin, die Zielarterie zu isolieren und mit Hilfe der optischen Projektionstomographie zu scannen.

Die letzten Schritte bestehen darin, die Bildrekonstruktion durchzuführen, die Läsion zu identifizieren und das Läsionsvolumen zu messen. Letztendlich können die Ergebnisse anatomische Rekonstruktionen der Läsion und die Quantifizierung des Läsionsvolumens und der arteriellen Verengung durch Bildanalyse zeigen. Unsere Gruppe ist daran interessiert, die Mechanismen zu verstehen, die der Bildung von Läsionen zugrunde liegen, die eine arterielle Verengung verursachen, die zu lebensbedrohlichen Komplikationen wie Herzinfarkt und Schlaganfall führt.

Diese Anwendung der optischen Projektionstomographie wurde in unserer Gruppe von Dr. Nicholas Kirkby in Zusammenarbeit mit Dr. Lucy Lowe entwickelt und wird von Dr. Jung Shi Wu, einem Postdoktoranden, der in unseren Labors arbeitet, demonstriert. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Histologie und Immunhistochemie besteht darin, dass sie weniger arbeitsintensiv ist und eine dreidimensionale statt zweidimensionale Analyse ermöglicht. Diese Technik zur Induktion von Läsionen der Oberschenkelarterie ist modifiziert von denen von R and Company und Sada and Company.

Das Textprotokoll erklärt, wie atherosklerotische Läsionen durch diätetische Manipulation induziert werden können. Beginnen Sie mit einer 10 bis 12 Wochen alten C 57 black six Maus mit einem Gewicht zwischen 25 und 30 Gramm. Legen Sie die Maus nach der Betäubung auf ein warmes Polster, um ihre Körpertemperatur zu halten und Fluor in einer Höhe von zwei bis 3 % über einen Nasenkegel bereitzustellen.

Wenn die Maus nicht auf ein Einklemmen der Zehen reagiert, verabreichen Sie Buprenorphin in einer Menge von 0,1 Milligramm pro Kilogramm. Legen Sie dann die Maus auf den Rücken und rasieren Sie die Bauchfläche der linken Hintergliedmaße. Machen Sie dann einen Schnitt, um die Muskeln der oberen hinteren Extremität zwischen der Bifurkation der Kniekehle und der Bauchdecke freizulegen.

Führen Sie eine stumpfe Dissektion durch, um den Nervus femoralis während des gesamten Eingriffs von der Oberschenkelarterie und -vene zu isolieren. Halten Sie das Gewebe feucht mit 1 % Vol.-% Li Eckzahn. Platzieren Sie als nächstes temporäre 6.0 Mers Seidenligaturen um die Oberschenkelarterie und -vene in der Nähe der Bauchdecke und unmittelbar unter dem Ast mit der Kniekehle.

Diese dienen dazu, den Blutfluss zu steuern. Isolieren Sie dann die Kniekehle, zwei bis fünf Millimeter distal des Astes mit der Oberschenkelarterie, und ligieren Sie die Kniekehlenarterie unter der Kniekehle. Platzieren Sie eine zweite Ligatur.

Machen Sie nun einen kleinen Schnitt für die Drahteinführung in die Kniekehle unmittelbar distal des Astes mit der Oberschenkelarterie. Üben Sie Druck auf die proximale temporäre Ligatur aus, um Blutungen durch den Schnitt und in die Oberschenkelarterie in Richtung Bauchdecke zu verhindern. Führen Sie einen 0,014 Zoll G-Draht etwa einen bis 1,5 Zentimeter ein.

Lassen Sie es 30 Sekunden lang an Ort und Stelle und entfernen Sie es dann. Dann mit den Ligaturen Ligate, der Kniekehle oberhalb des Schnittes. Achten Sie darauf, dass Sie die Oberschenkelarterie nicht verschließen.

Entfernen Sie nun die temporären Ligaturen. Verschließen Sie die Wunde mit diskontinuierlichen Laufnähten mit 5.0 mercal. Tragen Sie anschließend die EMLA-Creme auf.

Lassen Sie das Tier im Auffangkäfig wieder zu Bewusstsein kommen und sich bewegen, bevor Sie es in den Heimkäfig zurückbringen. Es wird erwartet, dass das Bein zwei oder drei Tage lang Lahmheit zeigt, aber das bedeutet nicht, dass die Maus isoliert werden muss. Für OPT muss die Maus euthanasiert werden, eine terminale Anästhesie mit Pentobarbital induzieren.

Nehmen Sie dann eine transkardiale Perfusionsfixation mit Exsanguination vor. Isolieren Sie nun die Oberschenkelarterien oder den Aortenbogen und dessen Äste. Entfernen Sie dabei jegliches gefährliche Fremdmaterial.

Dann das Gewebe über Nacht in 10%neutral gepuffertem Formalin postfixieren. Lagern Sie das Gewebe am nächsten Tag entweder in 70%igem Ethanol oder betten Sie die Arterien in gefilterte 1,5%LMP-Aeros ein. Senken Sie das Gewebe vorsichtig bei etwa 40 Grad Celsius in die geschmolzenen Aeros ab.

Schneiden Sie die Aeros so ab, dass sie eine konische Form erhalten. Dehydrieren Sie nun dieses Präparat mindestens 12 Stunden lang in 100%Methanol. Nach dem Dehydrieren reinigen Sie die Gefäße in einer Mischung aus ein bis zwei Benzoalkohol und Benzobenzoat.

Lassen Sie die Gefäße 12 bis 24 Stunden in dieser Lösung inkubieren. Laden Sie am nächsten Tag die freigegebene Probe in den Tomographen, der vorkalibriert werden sollte. Die Auflösung ist auf 1024 festgelegt.

Um 1024 Pixel. Stellen Sie die Vergrößerung für den Interessenbereich ein. Die Z-Achse wird automatisch auf die gleiche Auflösung eingestellt.

Die Voxelgröße beträgt etwa 200 Mikrometer. Positionieren Sie dann mit dem Hellfeldkanal das Sample so, dass es sich in der Mitte des Sichtfelds um seine eigene Achse dreht. Stellen Sie mit dem GFP-Ein-Filter-Emissionskanal den Fokus ein und passen Sie die Belichtung an, um den Dynamikbereich des Bildes zu maximieren.

Vermeiden Sie Übersättigung. Scannen Sie nun das Gefäß im GFP einen Emissionskanal nur noch in 0,9 Grad Schritten. Die Proben sollten dann mindestens 24 Stunden lang auf 100%Methanol zurückgeführt werden, bevor sie in Wachs eingebettet werden.

Öffnen Sie für die histologische Analyse die aufgenommenen Bilder in einer Aufklärungssoftware oder einer ähnlichen Software mit der Datenbetrachtungssoftware. Überprüfen Sie die Qualität der Bildrekonstruktion, verbessern Sie die Bildqualität, passen Sie die Bildintensität an und lassen Sie die Software eine Fehlausrichtung der Probe von ihrer idealen Rotationsachse ausgleichen. Definieren Sie für jeden Scan den vertikalen Bereich von Interesse, der die Läsion enthält.

Zeichnen Sie in jeder 50. Scanzeile die Grenze zwischen dem Medium und die Position der inneren elastischen Lamina nach. Die Software kann dann den Rand in allen anderen Scans interpolieren, diese Interpolationen manuell überprüfen und bei Bedarf korrigieren. Erstellen Sie nun einen binären Bildsatz, bei dem die weißen Pixel Neointima und die schwarzen Pixel das Patentlumen darstellen.

Dies wird durch die Definition der Intensitätsschwellenwerte erreicht. Sobald dies erreicht ist, ist das Objektvolumen das Gesamtvolumen der Läsion, und das luminale Volumen ist das Gesamtvolumen, abzüglich des Objektvolumens. Auf diese Weise wird die Verteilung der Läsion und des Lumens entlang der axialen Länge beurteilt.

Die Oberschenkelarterien der Maus wurden 28 Tage nach einer Draht- oder Ligatur-induzierten Verletzung entnommen. Die neointimale Verdickung zeigte sich in den Emissionsprojektionen in rekonstruierten zweidimensionalen Rutschen. Konzentrische neointimale Läsionen konnten unterschieden werden.

Optische Projektionstomographie-Emissionsbilder des gesamten Aortenbogens einer APOE-defizienten Maus identifizierten die erwarteten Läsionen in der kleinen Krümmung des Aortenbogens, der Arteria brachiocephalica und in den Ursprüngen der linken Halsschlagader und der Arteria subclavia. Dieselbe Läsion wurde segmentiert und rot dargestellt. Um die Verteilung der Plaques bei Überlagerung mit dem Originalbild hervorzuheben, konnten das Medium und das Lumen in Schnittbildern unterschieden werden, die zeigten, dass es sich um exzentrische Läsionen handelte.

Wenn sich der Scan distal entlang dieser Äste bewegt, verkleinern sich die Läsionen allmählich und verschwinden zunächst in der Arteria subclavia, dann in der Halsschlagader und schließlich in der Arteria brachiocephalic. Interessanterweise wandert diese Läsion in der Arteria brachiocephalica weiter zum Flussteiler, da sich dieses Gefäß in die rechte Halsschlagader und die rechte Arteria subclavia teilt. Nach dem OPT-Verfahren können andere Methoden wie Histologie und Immunhistochemie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. wie ist die Zusammensetzung der Läsion?

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Wissenschaftler, die auf dem Gebiet der Gefäßforschung arbeiteten, um die Rolle von Endotheldrezeptoren, Lektinen und steroidmetabolisierenden Enzymen bei der Entwicklung neointimaler und atherosklerotischer Läsionen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Läsionen aus den Rine-Arterien mit Hilfe der optischen Projektionstomographie gewinnen und analysieren können.