Die Analyse der Fettsäuregehalt und Zusammensetzung in Mikroalgen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den gesamten Gehalt und die Zusammensetzung von Fettsäuren in Mikroalgen zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Probe hergestellt wird, die eine bekannte Menge lyophilisierter Algenbiomasse enthält. Der zweite Schritt besteht darin, die Mikroalgen-Biomasse aufzuschließen.

Anschließend werden die lipophilen Bestandteile extrahiert und isoliert. Der letzte Schritt ist die Umesterung der ACell-Lipide zu Fettsäuremethylestern. Abschließend erfolgt die Quantifizierung der Fettsäuren mittels Gaschromatographie.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie Tric-Bestimmungen besteht darin, dass diese Methode sehr genau ist und spezifisch alle Fettsäuren sowie alle weiteren lipophilen Bestandteile misst. Das Verfahren wird von NDI Afer, einer Technikerin aus unserem Labor, demonstriert. Bestimmen Sie vor Beginn des Verfahrens die Konzentration der Algentrockenmasse in Gramm pro Liter im Kulturansatz, wie im angegebenen Nachweis beschrieben. Überführen Sie ein Volumen des Kulturansatzes, das fünf bis 10 Milligramm Algentrockenmasse enthält, in ein Glaszentrifugenröhrchen.

Berechnen Sie die exakte Menge der übertragenen Biomasse unter Verwendung der zuvor bestimmten Biomassekonzentration, zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten bei 1200 Gs. Entsorgen Sie einen Teil des Überstandes, wobei etwa 0,25 Milliliter im Gefäß verbleiben. Suspendieren Sie anschließend die Algen im verbleibenden Überstand, indem Sie den Pellet vorsichtig mehrmals auf- und abpipettieren, und überführen Sie das Zellgemisch in ein Bead-Beater-Gefäß.

Unter Verwendung einer 200-Mikroliter-Pipette spülen Sie das Zentrifugenröhrchen und die Pipettenspitze mit etwa 0,15 Millilitern Milli-Q-Wasser aus und überführen die Flüssigkeit in das Bead-Beater-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Bead-Beater-Röhrchen eine Minute lang mit maximaler Drehzahl, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen am Boden des Röhrchens verbleiben. Anschließend lyophilisieren Sie das Material im Röhrchen wie folgt.

Stellen Sie eine Lösung mit 50 Milligramm pro Liter Tripenta-Deano in einem angereicherten Volumenverhältnis aus Chloroform zu Methanol her. Geben Sie mithilfe einer Kolbenhubpipette ein Milliliter der Tripod-no-Lösung in das Kügelchengefäß. Überprüfen Sie, ob sich keine Kügelchen mehr im Verschluss des Kügelchenzerstörergefäßes befinden, da dies zu einem Auslaufen des Kügelchens aus dem Gefäß führen kann.

Schlagen Sie die Bead-Breaker-Röhre achtmal bei 2.500 U/min, jeweils 60 Sekunden lang, mit einem Intervall von 122stel zwischen den einzelnen Schlägen. Überführen Sie danach die Lösung mit den Perlen aus der Bead-Breaker-Röhre in eine saubere, hitzebeständige 15-Milliliter-Glasküvette mit Schraubverschluss aus Teflon-Einsatz. Spülen Sie die Bead-Breaker-Röhre mit einem Milliliter der Tripod-Lösung aus, und überführen Sie den Abwasch in die Glasküvette.

Wiederholen Sie dies zweimal mehr. Den Probenbehälter fünf Sekunden lang wirbeln und anschließend 10 Minuten lang beschallen. Nach der Beschallung 2,5 Milliliter einer pH-7-Milli-Cube-Wasserlösung, die 50 Millimolar Triss und ein Mol Natriumchlorid enthält, in das Zentrifugenröhrchen geben.

Nachdem die Probe vortexiert und ein zweites Mal sonifiziert wurde, zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 1200. Danach überführen Sie vorsichtig die untere Chloroformphase mit einer Glas-Pasteur-Pipette in ein sauberes Glasröhrchen und wiederholen die Extraktion mit einem Milliliter Chloroform. Sammeln Sie abschließend die Chloroformphase mit einer Glas-Pasteur-Pipette und vereinigen Sie sie mit der ersten Chloroformfraktion.

Verdampfen Sie das Chloroform unter einem Strom von Stickstoffgas, um die getrockneten extrahierten Lipide zu erhalten. Geben Sie anschließend drei Milliliter Methanol mit 5 % Schwefelsäure in das Gefäß mit den getrockneten extrahierten Lipiden und verschließen Sie es fest. Vortexen Sie die Probe fünf Sekunden lang.

Die Proben drei Stunden lang bei 70 Grad Celsius in einem Blockheizgerät inkubieren. Regelmäßig überprüfen, ob die Proben nicht kochen, und nach jeder Kontrolle das Gefäß nach dem Vortexen mischen. Sobald die Probe auf Raumtemperatur abgekühlt ist, drei Milliliter Milli-Q-Wasser und drei Milliliter n-Heptan zum Gefäß geben und anschließend gründlich vortexen.

Schütteln Sie die Probe 15 Minuten lang mit einem Probenglas-Rotator. Nach dem Entfernen der Proben aus dem Probenglas-Rotator zentrifugieren Sie sie fünf Minuten bei 1200 G. Sammeln Sie mit einer Glas-Pasteurpipette zwei Milliliter der oberen Hexanphase und überführen Sie diese in ein frisches Glasrohr. Um die gesammelte Hexanphase zu waschen, geben Sie zwei Milliliter Milli-Q-Wasser in das Glasrohr.

Versetzen Sie die Probe anschließend fünf Sekunden lang im Vortex und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang. Übertragen Sie bei 1200 × g die Hexan-Phase mit einer Glas-Pasteur-Pipette aus dem Glasröhrchen in ein GC-Probengläschen. Danach setzen Sie eine Kappe auf das GC-Probengläschen und verschließen Sie sie fest, um eine Verdunstung des Lösungsmittels zu verhindern.

Platzieren Sie das Probenfläschchen in den Autosampler des GC-Geräts. Führen Sie schließlich die Probe am Gerät mit einer neuen Säule bei einer Gesamtflussrate von 20 Milliliter pro Minute und einem Injektionsvolumen von einem Mikroliter durch. Siehe Textprotokoll für Säulenspezifikationen und chromatographische Bedingungen?

Ein typisches Chromatogramm, das mit diesem Verfahren erhalten wird, ist hier dargestellt. Fettsäuremethylester werden anhand ihrer Größe und ihres Sättigungsgrads durch die GC-Säule getrennt, wobei kürzer gekettete Fettsäuren und stärker gesättigte Fettsäuren kürzere Retentionszeiten aufweisen. Die verwendete GC-Säule und das verwendete Protokoll sollen Fettsäureisomere nicht trennen, was jedoch durch die Verwendung einer anderen GC-Säule und eines anderen Protokolls erreicht werden könnte.

Der Gehalt und die Zusammensetzung der Fettsäuren von C. Desus UEX 3 93 unter stickstoffreichen und stickstoffarmen Bedingungen werden hier dargestellt. Die gesamten Fettsäuregehalte betrugen 8,6 ± 0,5 % bzw. 44,7 ± 1,7 % unter stickstoffreichen und stickstoffarmen Kultivierungsbedingungen. Diese Werte zeigen, dass die Zusammensetzung und der Gehalt an Fettsäuren stark durch Stickstoffverarmung beeinflusst werden.

Bei ESBL sind Palmitinsäure und Ölsäure die beiden am häufigsten vorkommenden Fettsäuren. Siehe den Textprotokollabschnitt für Einzelheiten zur Berechnung des Fettsäuregehalts und der Zusammensetzung. Der Fettsäuregehalt und die Zusammensetzung von Odum Trico UEX 6 4 0 unter sowohl stickstoffreichen als auch stickstoffarmen Bedingungen sind hier dargestellt.

Ähnlich wie bei schrägen UUs wird der Gehalt und die Zusammensetzung der Fettsäuren stark durch Stickstoffmangel beeinflusst. Unter stickstoffreichen und stickstoffarmen Bedingungen betrugen die gesamten Fettsäuregehalte jeweils 11,7 ± 0,9 % und 30,5 ± 1,1 %. P. trium produziert außerdem beträchtliche Mengen hochungesättigter Fettsäuren wie I csap, Penta-IC-Säure.

Außerdem können auch sehr langkettige Fettsäuren wie Lignerinsäure mit dieser Methode nachgewiesen werden. Dieses Verfahren kann durch Einfügen eines Schritts zur Trennung von Lipidgerinnseln zwischen der Lipidextraktion und der Umesterifizierung erweitert werden, um zusätzliche Einblicke in die Zusammensetzung der Lipidklassen von mikroskopischem LG zu erhalten, wie in den im Protokolltext genannten Referenzen beschrieben.