Markierungsfreie Isolierung und Anreicherung von Zellen durch Kontaktlose Dielektrophorese

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe der Farbstoff-Elektrophorese eine translatorische Bewegung von in einer druckgetriebenen Strömung suspendierten Zellen zu erzeugen, ohne die Elektroden mit der Probe in Kontakt zu bringen. Dies wird erreicht, indem man zunächst die betreffenden Zellen in einem Puffer mit geringer Leitfähigkeit suspendiert. Der zweite Schritt besteht darin, die mikrofluidische Vorrichtung mit der Zellsuspension zu befüllen und ein hochleitfähiges Fluid in die Elektrodenkanäle einzubringen.

Anschließend wird das vorbereitete Gerät mit Hochspannungselektronik verbunden, und die Frequenzantwort der Zellbewegung wird durch ein von einer an ein inverses Mikroskop angebrachte Kamera geliefertes Video aufgezeichnet. Der letzte Schritt besteht darin, die Videobilder zu analysieren, um elektrische Eigenschaften der Zellen quantitativ vorherzusagen. Letztendlich wird die kontaktlose dielektrische Elektrophorese genutzt, um zu zeigen, dass Zellen mit unterschiedlichen elektrischen Eigenschaften auf schonende, markierungsfreie Weise sortiert werden können, wobei kostengünstige und einfach herzustellende mikrofluidische Vorrichtungen verwendet werden.

Daher eignet sich diese Methode für Anwendungen wie die Sortierung lebender von toten Zellen, die Isolierung von Tumorzellen, die Anreicherung von Tumorzellen nach Krankheitsstadium sowie die Untersuchung der Wirkung von Wirkstoffen auf verschiedene Zellen hinsichtlich ihrer dielektrischen Eigenschaften. Die Hauptvorteile dieser Technik im Vergleich zu etablierten Verfahren wie der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung bestehen darin, dass Zellen basierend auf ihren intrinsischen biophysikalischen Eigenschaften sortiert und charakterisiert werden können, ohne dass eine Markierung mittels Biomarkern erforderlich ist, und dass die Probensterilität gewahrt bleibt, da ein Kontakt zwischen Elektroden und Probe vermieden wird. Wir hatten diese Idee ursprünglich, als wir eine Technik entwickeln wollten, die mehrere Probleme vermeidet, wie beispielsweise Probenkontamination, Elektrolyse, aufwendige Herstellung, die mit herkömmlichen dielektrophoretischen Vorrichtungen verbunden sind.

Zur Isolierung von Säugetierzellen. Befolgen Sie zuvor beschriebene Verfahren unter Verwendung von Fotolack und tiefer reaktiver Ionenätztechnik, um das gewünschte Kanaldesign in eine Siliziumscheibe zu ätzen, und bringen Sie eine dünne Teflonschicht auf, um die Freisetzung des Mikrogeräts von der Scheibe zu verbessern. Wickeln Sie die Scheibe mit Aluminiumfolie ein, um Verschütten zu verhindern.

Mischen Sie Polymethylaluminat oder PDMS im Verhältnis 10 zu 1 von Elastomer zu Härtungsmittel DGA etwa 20 Minuten lang und gießen Sie die Mischung auf das Wafer. Anschließend das Wafer 45 Minuten bei 100 Grad Celsius erhitzen, um nach dem Abkühlen eine Beschädigung der Teflonbeschichtung des Stempels zu vermeiden. Entfernen Sie die Aluminiumfolie.

Schneiden Sie das PDMS mit einem chirurgischen Skalpell zurecht und stanzen Sie Zugangsöffnungen an Einlass und Auslass des Kanals. Verwenden Sie hierzu einen stumpfen Stanzgerät, das der Tubing-Größe angepasst ist; in diesem Fall wird ein 1,5-Millimeter-Stanzgerät verwendet. Reinigen Sie anschließend einen Objektträger gemäß der schriftlichen Protokollanweisung.

Reinigen Sie das PDMS-Gerät mit Scotch-Magic-Tape. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Kanäle sauber sind. Anschließend setzen Sie den Objektträger und das PDMS-Gerät zwei Minuten lang einer Luft-Plasma-Behandlung aus und drücken die Kanalseite des Geräts fest auf den Glasobjektträger, wobei die Bildung von Luftblasen zwischen Gerät und Objektträger vermieden werden sollte.

Bereiten Sie einen Puffer mit niedriger Leitfähigkeit wie im Textprotokoll beschrieben vor, der als DEP-Puffer bezeichnet wird. Suspendieren Sie die Zellen im DEP-Puffer bei 3 Millionen Zellen pro Milliliter, wobei hier fluoreszenzmarkierte, krebsartige, spätstadiige Maus-Ovarial-Epithelzellen oder Moos-L-Zellen verwendet werden. Messen Sie die Leitfähigkeit der gefärbten Zellsuspension mithilfe eines fluoreszenten, membranpermeablen Farbstoffs.

Die Leitfähigkeit sollte etwa 100 Mikrosiemens pro Zentimeter betragen. Wenn die Leitfähigkeitsmessung zu hoch ist, zentrifugieren Sie die Probe. Resuspendieren Sie sie in Tiefenpuffer und wiederholen Sie die Leitfähigkeitsmessung.

Der schwierigste Aspekt dieses Protokolls besteht darin, Blasen in den Elektrodenkanälen und im Probenkanal zu vermeiden. Blasen in den Elektrodenkanälen können die elektrolytische Verbindung verhindern, und Blasen im Probenkanal können einen gleichmäßigen Fluss verhindern. Achten Sie darauf, die gezeigten Schritte durchzuführen, um Blasen zu vermeiden und einen stabilen Fluss sicherzustellen, bevor Sie den C-dip-Mikrofluidik-Chip beladen. Stellen Sie ihn dafür 30 Minuten unter Vakuum.

Inzwischen schneiden Sie ein Stück flexiblen Schlauches so zu, dass es die Distanz von der Spritzenpumpe bis zur Mikroskopbühne überbrückt, an der sich der mikrofluidische Chip befinden wird. Es wird ein sechs Zoll langes Schlauchstück benötigt. Bringen Sie den Schlauch an der Nadelspitze der Spritze an.

Schätzen Sie dann die erforderliche Länge der Auslassleitung ab, indem Sie das Zielvolumen der gesammelten Probe durch die Querschnittsfläche des Schlauchs teilen. Schneiden Sie die erforderliche Schlauchlänge zu. Ziehen Sie anschließend die Zellsuspension in eine Spritze.

Überprüfen Sie, dass sich keine Blasen in der Schlauchleitung oder der Spritze befinden. Nach dem Entfernen des Chips aus dem Vakuum setzen Sie das Auslassrohr ein und befüllen den Probenkanal schnell. Um eingeschlossene Luftblasen in den Kanälen zu vermeiden, klopfen Sie vorsichtig auf die Spritze, während Sie den Kanal befüllen.

Um zu vermeiden, dass die dünne isolierende Barriere beschädigt wird, platzieren Sie leere Pipettenspitzen schnell zur Vorbereitung der Elektrodenkanäle an einem Auslass jedes fluidischen Elektrodenkanals, pipettieren Sie 200 Mikroliter PBS, das eine kleine Menge Brom B enthält, und klopfen Sie vorsichtig, um die Flüssigkeit in das gegenüberliegende Ende des Elektrodenkanals einzubringen. Halten Sie vorsichtig Druck aufrecht, bis PBS mit Brom B sichtbar in die Spitze der leeren Pipettenspitze vorrückt; wiederholen Sie dies für jeden Elektrodenkanal. Kanal R domine B wird nur zur fluoreszierenden.

Visualisieren Sie die fluidischen Elektrodenkanäle nach dem Befüllen. Füllen Sie jedes Pipettenspitzenreservoir mit PBS, mit R domine B. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen in den Pipettenspitzenreservoiren und entfernen Sie sichtbare Blasen, indem Sie vorsichtig mehrmals auf- und abpipettieren. Trennen Sie die Auslassleitung ab und entsorgen Sie sie ordnungsgemäß.

Danach ein neues Auslassschlauch-Reservoir einsetzen. Das Zielvolumen sammeln. Den Chip auf dem Objekttisch eines umgekehrten Mikroskops mit digitaler Kamera positionieren.

Befestigen Sie die Spritze an der Spritzenpumpe und führen Sie die Drahtelektroden in die Reservoire der fluidischen Elektrodenkanäle ein. Pumpen Sie die Flüssigkeit mit einer Geschwindigkeit von einem Milliliter pro Stunde durch, um einen guten Kontakt zwischen der Spritzenpumpe und der Spritze sicherzustellen. Überprüfen Sie visuell die Kanallänge, um einen ungehinderten Zellfluss sowie das Fehlen von Blasen oder Leckagen zu gewährleisten. Verringern Sie anschließend die Flussrate auf fünf Mikroliter pro Stunde.

Aus Sicherheitsgründen. Prüfen Sie die Elektronik, indem Sie den Funktionsgenerator, den Hochspannungsverstärker und das Oszilloskop einschalten und auf die gewünschte Spannung und Frequenz einstellen. Hier betragen diese Parameter 200 Volt und 20 Kilohertz.

Nach der Überprüfung einer akzeptablen Leistung schalten Sie die Stromversorgung aus. Anschließend schließen Sie die Elektroden an den Hochspannungsverstärker an. Sobald ein stabiler Durchfluss erreicht ist, legen Sie die gewünschte Spannung bei der gewünschten Frequenz an. In diesem Experiment beträgt die Spannung 200 Volt Effektivwert bei Frequenzen zwischen fünf und 60 Kilohertz.

Nehmen Sie die Videodateien der Zellreaktion mit Bildverarbeitungstechniken auf, um die Zellverteilung im Kanal zu quantifizieren und die Übergangsfrequenz zu charakterisieren. Gehen Sie dazu folgendermaßen vor: Halten Sie eine konstante Spannung aufrecht und variieren Sie die Frequenz systematisch zu Beginn und am Ende des Experiments sowie zufällig zwischen den experimentellen Durchläufen. Nehmen Sie die Kontrollzellverteilung auf, also die Verteilung der Zellen ohne Anlegen eines elektrischen Feldes.

Nachdem eine neue Frequenz eingestellt wurde, warten Sie die Zeitspanne ab, die erforderlich ist, damit die Zellen vom Einlass bis zur überwachten Position fließen und anschließend die Aufzeichnung beginnt. Führen Sie dann die Bildverarbeitung zur Charakterisierung der Crossover-Frequenz wie im Textprotokoll beschrieben durch und suspendieren Sie die gewünschte Mischung in DEP-Puffer bei einer Gesamtkonzentration von 3 Millionen Partikeln pro Milliliter. In diesem Fall handelt es sich bei der Mischung um Moos-L-Zellen zusammen mit vier Mikrometer großen fluoreszierenden Kügelchen in DEP-Puffer; führen Sie die zuvor beschriebenen Schritte durch. Um ein CEP-Gerät vorzubereiten, betreiben Sie das Experiment bei einer Frequenz zwischen den beiden bestimmten Crossover-Frequenzen der Zielzellen und der Hintergrundpartikel, sodass die beiden Partikelpopulationen DEP-Kräfte in entgegengesetzte Richtungen erfahren.

Um den Inhalt verschiedener Proben zu sammeln, entfernen Sie das Abflussrohr nach dem Sammeln des Zielvolumens, indem Sie einen Handschuhfinger über die Abflussöffnung legen und vorsichtig am Schlauch ziehen. Gießen Sie das gesammelte Zielvolumen in ein Reservoir zur weiteren Analyse. Bei Säugetumorzellen, wie den hier am häufigsten verwendeten L-Zellen, wurde bei fünf Kilohertz negativer DEP und starker positiver DEP beobachtet.

Bei 60 Kilohertz haben MOS L-Zellen einen Durchmesser von 17,7 ± 3,3 Mikrometern, und die Kügelchen haben einen Nenndurchmesser von vier Mikrometern. Neben der Bestimmung der Übergangsfrequenz von Zellen kann diese Technik verwendet werden, um ein Gemisch zu sortieren, wie hier anhand einer Mischung aus MO'S L-Zellen und Kügelchen veranschaulicht. Dieses Beispiel nutzt die negative Dielektrophorese aus, die von vier Mikrometer großen Kügelchen bei Frequenzen zeigt, bei denen MO'S L-Zellen positiven dielektrophoretischen Kräften unterliegen.

Wenn das Gerät bei 200 Volt Effektivwert und 10 Kilohertz betrieben wurde, wurden beide hier grün dargestellten Zellen und hier rot dargestellten Kügelchen gemischt, da sie eine negative DEP bei 50 Kilohertz erfuhren. Es wurde eine Bewegung der MOS-L-Zellen zum oberen Kanalbereich beobachtet, während die Kügelchen auf den unteren Kanalabschnitt beschränkt blieben, wodurch eine Trennung des Gemischs in zwei Komponenten ermöglicht wurde. Nach diesem Verfahren können anschließend weitere Techniken durchgeführt werden, wie Zellkultivierung und immunfluoreszenzgestützte Bildgebung oder biochemische Assays, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie die dielektrischen Eigenschaften mit den physikalischen Merkmalen der Zellen korrelieren.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Biologen den Weg dazu, mithilfe eines Maus-Ovarialkarzinom-Modells zu untersuchen, wie metabolitenbedingte Veränderungen im Cytoskelett der Zelle mit deren dielektrischen Eigenschaften korreliert werden können. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Zellen mithilfe der kontaktlosen Elektrophorese angereichert und sortiert werden können.