Name: Markierungsfreie Isolierung und Anreicherung von Zellen durch Kontaktlose Dielektrophorese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Erfahren Sie die kontaktlose Dielektrophorese zur markierungsfreien Zellisolierung und -anreicherung. Diese schonende Methode ermöglicht die sterile Sortierung lebender Zellen basierend auf ihren dielektrischen Eigenschaften.

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Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt wurde von der National Science Foundation unter Grant No EFRI 0938047 und von der Virginia Tech-Institut für Kritische Technik und Angewandte Informatik (ICTAS) unterstützt. Die Autoren möchten die Wertschätzung Dr. Eva Schmelz und Dr. Paul Roberts für die freundliche Gabe des MOSE-L-Zellen exprimieren. Die Autoren danken Angela Anderson für ihre Hilfe bei der Zellkultur, Caitlan Swaffar für ihre Hilfe bei der Bearbeitung dieses Dokument und die Vorbereitung Experimente und Laborsysteme aller Bioelectromechanical Mitglieder.

1. Herstellung eines Prototypen cDEP Mikrofluidik-Gerät: Übersicht <ol><li> Folgen zuvor berichteten Verfahren 22 unter Verwendung von Fotolack und tiefe reaktive Ionenätzen (DRIE), um den gewünschten Kanal-Design (Figur 1) in einem Siliziumwafer (2) zu ätzen. Zahlen Sie eine dünne Schicht aus Teflon, die Freisetzung der Mikrovorrichtung aus dem Wafer zu verbessern. </li></ol><img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Schematische Darstellung einer Niederfrequenz-Dauersortiereinrichtung. Die Probenkanal verläuft von links nach rechts und 500 um breit mit Sägezahn Verengungen bis 100 um. Die zwei Paare von Fluidelektrodenkanäle bilden den Quellen-und Senkenelektroden, die jeweils, und von der Probenkanal mit einem 20 um dicken PDMS Barriere getrennt. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig2.jpg" /> 2. Die fabrication Prozess eines cDEP Vorrichtung. (a) für 60 Sekunden UV-Licht reagiert selektiv mit Photoresist durch ein Maskenmuster der cDEP Vorrichtungsgeometrie ausgesetzt. (b) Photoresist wird mit Entwickler entfernt. (c) tiefe reaktive Ionenätzen (DRIE) wird verwendet, um tief zu 50 Funktionen zu ätzen, und 5 min von nassen Radierung von Tetramethylammoniumhydroxid (TMAH) 25% bei 70 ° C wird zur Rauheit an den Seitenwänden zu reduzieren. (d) Eine Teflonbeschichtung wird hinzugefügt, um Entlassung aus dem Gerät zu verbessern der Wafer. (e) PDMS auf den wiederverwendbaren Wafermarke nach Entgasung gegossen und 45 min lang bei 100 º F (f) PDMS wird von dem Wafer entfernt. PDMS und einen sauberen Glasobjektträger sind Luft-Plasma für 2 min ausgesetzt und miteinander verbunden. <ol start="2"><li> Wickeln Sie die Wafer mit Aluminiumfolie zu spill-over verhindern. Mischen Polydimethylsiloxan (PDMS) in einem Verhältnis von 10:1 Elastomer zu Härter, de-Gas für etwa 20 min, Und gießen Sie auf den Wafer. Hitze für 45 Minuten bei 100 ° C um eine Beschädigung der Teflon-Beschichtung der Briefmarke. Lassen Sie das Gerät abkühlen. </li><li> Nach dem Abkühlen entfernen Aluminiumfolie, Trimm-PDMS mit einem Skalpell, und Punsch Zugangslöcher an Kanal Eingang / Ausgang mit einem stumpfen Puncher auf die Größe der Rohr geeignet. Hier wird ein 1,5 mm stumpf Puncher verwendet. </li><li> Reinigen Sie einen Glasobjektträger mit einer Spülung aus Wasser und Seife, Ethanol, DI-Wasser und Trocknen mit Luft auf. Reinigen Sie das Gerät mit PDMS Scotch Magic Klebeband. Unter dem Mikroskop untersuchen, um sicherzustellen, Kanäle sauber sind. Setzen Sie die Dia-und PDMS-Gerät Luft-Plasma für 2 min. Drücken Sie fest Kanalseite des Geräts, Glasträger, die Vermeidung Bildung von Luftblasen zwischen dem Gerät und dem Schieber (Abbildung 3). </li></ol><img alt="Fig. 3" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg"/> 3. </strong&gt; (a) Die für die Photolithographie bei der Silizium-Wafer Stempelherstellung, und (b) der fertigen PDMS-Glas-Gerät mit der Probe und Flüssigkeit Elektrodenkanäle mit grüner und roter Lebensmittelfarbe, jeweils gefüllt verwendete Maske. Siehe Abbildung 1 für Dimensionen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . 2. Vorbereiten einer Zellsuspension in DEP-Puffer <ol><li> Bereiten Sie eine niedrige Leitfähigkeit (100 uS / cm)-Puffer, die als &quot;DEP-Puffer&quot; bezeichnet wird (8,5% Saccharose [w / v], 0,3% Glukose [w / v], 0,725% RPMI [w / v]) . 16. </li><li> Aussetzen Zellen in DEP-Puffer bei 3 x 10 6 Zellen / ml. Hier werden Krebsspätstadium der Maus Eierstock-Oberfläche epithelialen (MOSE-L)-Zellen verwendet. </li></ol> Hinweis: Die Lebensfähigkeit der Zellen Analyse des Trypanblau-Ausschlussverfahren zeigten eine leichte Abnahme der Lebensfähigkeit(95,1-91,6%) der Early-Stage-MOSE (MOSE-E)-Zellen in DEP-Puffer bei Raumtemperatur nach 5 Stunden aufgehängt. Es wird vorausgesagt, dass eine ähnliche leichte Abnahme der Lebensfähigkeit tritt für MOSE-L-Zellen, was darauf hinweist, dass die Zellen nicht in DEP-Puffer gespeichert langfristigen werden. <ol start="3"><li> Farbstoff-Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff Membran durchlässig, wie z. B. die enzymatisch aktiviert Calcein AM. </li><li> Messung der Leitfähigkeit des gefärbten Zellsuspension. Die Leitfähigkeit sollte ungefähr 100 &amp;mgr; S / cm. Wenn die Leitfähigkeitsmessung zu hoch ist, drehen Sie die Probe ab, resuspendieren in DEP-Puffer bei 3 x 10 6 Zellen / ml und wiederholen Sie die Leitfähigkeitsmessung. </li></ol> 3. Laden der cDEP Mikrofluidik-Chip <ol><li> Legen Sie die Mikrofluidik-Chip unter Vakuum für 30 min. </li><li> Inzwischen, schneiden ein Stück flexible Rohrleitung um den Abstand von der Spritzenpumpe zu dem Mikroskoptisch, wo der Mikrofluid-Chip befinden wird überspannen. Hier wird ein 6-Zoll-Rohrlängeerforderlich. Fit Schlauch an Spitze auf Spritze Nadel. </li><li> Schätzung der erforderlichen Länge für Ablaufschlauch durch Dividieren des Ziel gesammelten Probenvolumen durch die Querschnittsfläche des Rohres. Schneiden Sie die Rohrlänge erfordern. </li><li> Zeichnen Zellsuspension in die Spritze. Überprüfen Sie, dass keine Blasen im Schlauch oder Spritze entfernt. </li><li> Nach Entfernen Chip von Vakuum, legen Sie die Ablaufschlauch und die Hauptprobenkanal schnell, um eingeschlossene Luftblasen in den Kanälen zu vermeiden. Klopfen Sie die Spritze beim Entlüften zu vermeiden Aufbrechen des dünn (20 um) isolierende Barriere, wenn es beobachtet wurde, dass die Barriere eine konstant hohe Durchsatz in der Nähe von 5 ml / h standhalten, ohne aufzureißen. </li><li> Um den Hauptelektrodenkanäle, schnell platzieren leer Pipettenspitzen in einem Auslass jeder Elektrode fluidischen Kanal. Je 200 &amp;mgr; l PBS, enthaltend eine geringe Menge an Rhodamin B und vorsichtig auf, um das Fluid in die entgegengesetzten Ende der Elektrode Kanal einzuführen. Pflegen Sie sanften Druckbis PBS mit Rhodamin B sichtbar fortschreitet bis die Spitze des leeren Pipettenspitze. Wiederholen Sie für jede Elektrode Kanal. Rhodamin B wird nur verwendet, um die Fluidkanäle Elektrode fluoreszenz visualisieren. </li><li> Nach der Grundierung, füllen jede Pipettenspitze Reservoir mit PBS mit Rhodamin B. vermeiden Blasenbildung in der Pipettenspitze Stauseen, und entfernen Sie alle sichtbaren Blase durch Pipettieren sanft auf und ab. Nehmen Sie den Ablaufschlauch und entsorgen angemessen, legen Sie eine neue Ablaufschlauch Reservoir, um das Zielvolumen zu sammeln. </li></ol> 4. Charakterisierung von Übergangsfrequenz der Zellen mit cDEP Chip <ol><li> Positionierung des Chips auf der Stufe eines umgekehrten Mikroskops mit Digitalkamera (Figur 4) ausgestattet. </li></ol><img alt="Fig. 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4.jpg" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg"/> 4. </strong&gt; (a) Gesamtversuchsaufbau für cDEP Experimenten. Die cDEP-Chip auf der Plattform des invertierten Mikroskops. Eine Kamera sendet Bilder auf den Computer für die Aufzeichnung. Die Spritzenpumpe sorgt für eine konstante Einlassstrom. Der Funktionsgenerator erzeugt ein Signal, das von der Hochspannungsverstärker abgestuft ist und an die cDEP-Chip durch Drahtelektroden verbunden sind. Das Oszilloskop überwacht die an den Chip gesendet wird. (B) Detailansicht der cDEP Chip und fluidische und elektronische Verbindungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <ol start="2"><li> Montieren Spritze auf Spritzenpumpe und legen Drahtelektroden in fluidischen Elektrode Kanal Stauseen. </li><li> Pumpen von Fluid durch 1 ml / h, um guten Kontakt zwischen der Spritzenpumpe und der Spritze zu gewährleisten. Sichtprüfung der Kanallänge, um eine ungehinderte Fluss von Zellen und das Fehlen von Blasen oder Lecks zu gewährleisten. Rotuce Flussrate auf 0,005 ml / Std. Hinweis: Durchsatz so hoch wie 1 ml / h 31,35 in Geräten anderer Geometrien erreicht. </li><li> Sicherheit, testen die Elektronik durch Einschalten des Funktionsgenerators, Hochspannungsverstärker und Oszilloskop und Einstellen auf die gewünschte Spannung und Frequenz. Diese Parameter sind hier 200 V und 20 kHz. Nach Überprüfung der akzeptablen Leistung, Kraft aus. Schließen Elektroden an Hochspannungsverstärker. Hinweis: Beachten Sie geeignete elektrische Sicherheitsvorkehrungen beim Betrieb der Elektronik bei den hohen Spannungen für diese Experimente verwendet. </li><li> Nach Erreichen stetigen Fluss gelten die gewünschte Spannung auf der gewünschten Frequenz. In diesem Experiment ist die Spannung 200 V RMS bei Frequenzen zwischen 5-60 kHz. </li><li> Aufzeichnen von Video-Dateien der Zell-Antwort mit Bildverarbeitungstechniken (Schritt 5), um die Zellverteilung in den Kanal zu quantifizieren und die Übergangsfrequenz zu charakterisieren. Um dies zu tun,eine konstante Spannung und die Frequenz variieren systematisch. Am Anfang und am Ende des Experiments sowie zufällig zwischen Versuchsläufen, erfassen die Steuerzellverteilung, die Verteilung der Zellen, ohne irgendeine elektrische Feld. Schätzung der Höhe der erforderlichen Zeit für Zellen, die von dem Einlass zu dem überwachten Ort (hier 5 min) fließen. Nach dem Einstellen einer neuen Frequenz, warten diese Menge an Zeit, dann beginnt die Aufnahme (hier eine 2-min-Video von Zellverteilung). </li></ol> 5. Bildverarbeitung für die Charakterisierung von Übergangsfrequenz <ol><li> Verwendung einer Rechen Skript analysieren jedes Videoeinzelbild, um die relative y-Position (wobei die z-Richtung ist die vertikale Tiefe des Kanals, ist die y-Richtung der Kanalbreite, und x-Richtung ist die Kanallänge) bestimmen, der einzelnen Zelle oder fluoreszierende Partikel an einem bestimmten x-Koordinate hinter dem Bereich der hohen DEP-Kraft im Kanal. Erstellen Sie ein Diagramm der relativen disBeitrag. </li><li> Vergleichen der Mittellinie der Verteilung bei jeder Spannung und Frequenz mit der Mittellinie des Steuerverteilung. Für eine gegebene Spannung und unterschiedlichen Frequenzen, bestimmen die Übergangsfrequenz, wobei die Mittellinie die Y-Position des Steuerelements entspricht. </li></ol> 6. Das Variieren der Versuchs to Cell Sorting oder Enrichment Führen <ol><li> Aussetzen gewünschte Mischung in DEP-Puffer bei einer Gesamtkonzentration von 3 x 10 6 Partikeln / ml. Hier ist diese Mischung MOSE-L-Zellen mit 4 um fluoreszierende Kügelchen in DEP-Puffer. Führen Sie die zuvor beschriebenen Schritte, um eine cDEP Gerät vorzubereiten. </li><li> Aus einem Gemisch Zellen zu sortieren oder zu bereichern, bestimmen die Übergangsfrequenzen der Zielzellen und die Hintergrundpartikel, wie zuvor beschrieben. Bedienung des Versuchs bei einer Frequenz zwischen den beiden Grenzfrequenzen der Zielzellen und der Hintergrundpartikel, so dass die beiden Populationen von Partikeln zu erfahren DEP-Kräfte in entgegengesetzten directions. Um MOSE-L-Zellen und 4 um Perlen zu sortieren, betreiben die Kleinst über 11,90 ± 0,63 kHz. die erste Übergangsfrequenz von MOSE-L-Zellen vor kurzem von Salmanzadeh et al. berichteten 33 </li><li> Um den Inhalt einer sortierten Probe zu sammeln, entfernen Sie den Ablaufschlauch bei der Erfassung des Zielvolumens, indem Sie ein Handschuhfinger über die Austrittsöffnung und leichtes Ziehen an dem Schlauch. Gießen Sie die gesammelten Zielvolumen in ein Reservoir für die weitere Analyse. Hinweis: Andere Probengewinnungsverfahren könnten Anbringen eines permanentes Reservoir an den Chip und das Entfernen der Probe durch einfaches Pipettieren. </li></ol>

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<li>Salmanzadeh, A., Shafiee, H., Davalos, R. V., Stremler, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+mixing+using+contactless+dielectrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Microfluidic mixing using contactless dielectrophoresis.</a> Electrophoresis. 32, 2569-2578 (2011).</li>
</ol>

Dr. Rafael Davalos hat ein Patent angemeldet für die kontaktlose Dielektrophorese.

DEP ist eine leistungsfähige Technik zur Bestimmung von dielektrischen Eigenschaften von Partikeln und Partikelbewegung in Richtung Regie Sortierung, Trennung oder Anreicherung Anwendungen. Wegen der nachteiligen Wirkung der direkten Elektrodenkontakt mit einer Probe, andere ähnlich dem zuvor dargestellten Verfahren, um den Kontakt zu vermeiden Ansätze gemacht. Zum Beispiel Bashir et al. Durch die Verwendung eines mikrofluidischen PDMS-Gerät aus der Leiterplattenelektroden mit einer dünnen Deckglas getrennt entwickelt berührungsfreie DEP-Geräte, und diese Technik wird auch in Video-Format gemacht. 23,36 Hier haben wir die Herstellung einer Chip cDEP und fluidischen Elektroden unter Verwendung einer einzigen PDMS-Substrat und die Versuchsprotokoll zum Trennen Eierstockkrebszellen aus einer Mischung von Zellen und fluoreszierenden Beads gezeigt. Das vorgestellte Verfahren wurde erfolgreich für eine Vielzahl von komplexeren und physiologisch relevante Anwendungen, einschließlich Sortierung liv verwendete und toten Zellen, 28 tumorauslösende Zellen von Prostata-Krebszellen, 30 Krebszellen aus verdünnten roten Blutkörperchen, 31,32 und Differenzierung unter den Stadien von Brustkrebs 37 und Eierstockkrebs. cDEP 29 ist auch für Mischpartikel verwendet. Diese 38 Anwendungen zeigen, dass durch die Verwendung der einfachen Technik dargestellt, unterschiedliche Zwecke kann einfach durch Veränderung der Gestaltung der Kanalgeometrie erreicht werden. . DEP ist nützlich im Mikro zur Manipulation von Teilchen 13 Für kugelförmige Teilchen hängt die Translations dielektrophoretische Kraft auf die Größe und elektrischen Eigenschaften der Partikel und ihrer Suspensionsmedium sowie der Gradient des elektrischen Feldes im Quadrat: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq1.jpg" /> wobei ε m die Dielektrizitätskonstante des Suspensionsmediums ist, r der Radiusdes Teilchens, und Rc [k (ω)] ist der Realteil des Clausius-Mossotti (CM)-Faktor. Die CM-Faktor ist ein Maß für die relative Polarisierbarkeit des Teilchens gegenüber dem Suspensionsmedium und bestimmt die Richtung der dielektrophoretischen Kraft. Es wird, wie beschrieben, <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq2.jpg" /> wo <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq3.jpg" /> und <img alt="Gleichung 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq4.jpg" /> die komplexen Permittivitäten des Teilchens und des Mediums sind. Die komplexe Dielektrizitätskonstante, <img alt="Gleichung 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq5.jpg" /> , Hängt Leitfähigkeit (σ) und der Frequenz (ω). Die CM-Faktor von sphärischen Teilchen theoretisch zwischen -0.5 und 1 gebunden. Wenn der CM-Faktor negativ, erfahren die Teilchen nDEP, weil das Medium mehr als die Partikel polarisierbaren, also Teilchen bewegen sich weg von Regionenhohe elektrische Feld Steigungen. Wenn der CM-Faktor positiv ist, sind die Teilchen mehr als polarisierbare Medium und sie pDEP, in dem sie zu Regionen mit hoher elektrischer Feldgradienten bewegen zu erleben. Für biologische Partikel, die in nicht-homogenen Struktur sind, wie Zellen, kann das Clausius-Mossotti Faktor von einer effektiven Wert für die Partikel Permittivität bestimmt werden: <img alt="Gleichung 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq6.jpg" /> wo <img alt="Gleichung 7" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq7.jpg" /> und <img alt="Gleichung 8" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq8.jpg" /> sind die komplexe Dielektrizitätskonstante der effektiven komplexen Permittivität des Inneren der Zelle, wie z. B. im Zytoplasma, und der Plasmamembran sind;. r der Radius der Zelle ist, und d die Dicke der Plasmamembran 26 Wenn DEP tritt mit Partikeln in eine abgehängteFlüssigkeit, die Bewegung der Partikel relativ zu der Flüssigkeit eine Widerstandskraft auf die Partikel zu erzeugen. Diese Widerstandskraft muss bei der Bestimmung der Gesamtkraft auf die Teilchen wirken werden. Für die Situationen, die hier von Interesse, viskose Kräfte dominieren und Partikel davon ausgegangen, kugelförmig, klein, und bewegt sich mit relativ geringer Geschwindigkeit, so Stokes &#39;drag Gesetz sieht eine gute Näherung für die Widerstandskraft: <img alt="Gleichung 9" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq9.jpg" /> wobei η die Viskosität der Flüssigkeit ist, u p die Geschwindigkeit des Teilchens und u f die Geschwindigkeit des Fluids, das auch bewegen kann. Angesichts der Dielektrophoresekraft, bekannt Fluid-und Partikeleigenschaften, und eine bekannte Strömungsgeschwindigkeit kann die Balance zwischen der Widerstandskraft und dem Dielektrophoresekraft gelöst werden, um die Partikelgeschwindigkeit zu schätzen. Die Scherrate, die die Zellen Erfahrung sollte unter der Schwelle liegen, bei der cell Lyse auftreten können. Charakterisierung der elektrischen Eigenschaften von Teilchen notwendig ist, vorherzusagen und zu steuern, wie sie unter DEP reagieren sie. In dieser Arbeit, die wir speziell niedrige Frequenz genutzt cDEP mit MOSE-L-Zellen, um das Protokoll für die Bestimmung ersten Crossover-Frequenz von Zellen zu demonstrieren, und dann zeigte kontinuierliche Sortierung von Polystyrol-Kügelchen und MOSE-L-Zellen auf der Basis ihrer gegenüberliegenden DEP Antworten. Veränderung der Geometrie der cDEP Gerät die räumlichen Gradienten des elektrischen Feldes für die hohe Selektivität und Effizienz von Sortier für einen bestimmten Zelltyp zu ändern, so dass Vorrichtungen zur Hochfrequenz-oder Niederfrequenzbetrieb ausgelegt werden kann, und. Zusätzlich können Hochdurchsatz-Geräten durch Herstellen breitere Kanäle entwickelt werden 30 Kanäle parallel, 30 oder durch Mehrschichtherstellungs 35, bei der die Elektrodenkanäle vertikal oberhalb und unterhalb eines relativ tiefen gestapeltenProbenkanal. Dünne Membranen bilden die Barriere zwischen den Schichten. Vorläufige Tests mit Geräten in Polymethylmethacrylat (PMMA) und Polycarbonat hergestellt (PC)-Dünnfilme haben DEP Antwort von MOSE-L-Zellen demonstriert. Die derzeitigen Bemühungen sind im Gange, um Mehrschicht-Hochdurchsatz-Geräte zu verfeinern und die Peripheriesystems in Richtung einer möglichen Plug-and-Play-Plattform zu verbessern. Um aus der Grund experimentelle Technik vorgestellt erweitern, können die Anwendungen und Daten des Gerätes zugeschnitten auf besondere Anforderungen, wie z. B. Sortieren gegen Charakterisierung, oder das Hinzufügen von Probenbehältern und einem halbautomatisches System an das Gerät angepasst werden.

Biologische Probenanreicherung und Partikelsortierung ist oft notwendig für die nachfolgende Analyse. 1 beispielsweise Isolierung seltener Zellen aus Körperflüssigkeiten, hat wichtige Anwendungen in der Krebs-Erkennung und eine personalisierte Medizin. 2,3 Die am häufigsten verwendeten Anreicherungstechniken sind Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS ) 4 und der magnetischen Zellsortierung (MACS), 5, die auf Oberflächenmarker exprimiert verlassen, um Zellen zu differenzieren. Andere Strategien umfassen die hydrodynamischen Trägheits 6 oder 7,8 Sortierung, optische Pinzetten, acoustophoresis 9, 10 und Dielektrophorese. 11,12 Dielektrophorese ist die Bewegung eines polarisierten Teilchen in der Gegenwart eines nicht-gleichförmigen elektrischen Feldes. 13 DEP für benutzt eine breite Palette von Anwendungen, einschließlich Sortierung 2,14 Zellen auf Lebensfähigkeit, 15 Charakterisierung bioelektrischen Eigenschaften von Zellen, 16 und Artten beim induzierten Veränderungen in den biophysikalischen Eigenschaften der Zellen. 17,18 Traditionelle DEP verwendet planaren Elektroden in einem mikrofluidischen Kanal, um eine Spannung zu induzieren, und ein nicht-gleichförmiges elektrisches Feld. 13. Zwar ist dies eine wirkungsvolle Technik strukturiert wird, können Probleme auftreten, wie z. B. Elektrode Delaminierung und Elektrolyse. Isolatorbasis Dielektrophorese (iDEP) 19 hat die Herausforderungen des Fouling Elektrode Delaminierung und räumliche Verschlechterung der Feldelektrode durch Strukturieren isolierende Strukturen, die Ungleichmäßigkeiten in einem elektrischen Gleichstromfeld induziert gerichtet. iDEP verwendet worden ist, um selektiv zu trennen lebenden und toten Bakterienzellen, Bakteriensporen 19 zu isolieren, 20 und manipulieren DNA, 21 unter anderen Anwendungen. Joulesche Erwärmung kann eine Herausforderung sein, da es infolge der hohen Gleichspannungen auftreten, oft erforderlich. Um diese Herausforderungen zu verbessern, haben die berührungslose DEP Mikrobauelementen entwickelt. 22-24 <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Die hier vorgestellte Technik nutzt kontakt Dielektrophorese (cDEP), das Fehlen eines direkten Kontakts zwischen den Metallelektroden und den Probenkanal so benannt. 22 Einzigartig an dieser Strategie ist der Ersatz von metallischen Elektroden mit Flüssigkeit gefüllten Elektrodenkanäle mit eine hoch leitfähige Lösung. Diese Fluid Elektroden kapazitiv über eine dünne isolierende Barriere zur Probe Kanal über eine Wechselspannung gekoppelt. Die Beseitigung Probe Kontakt mit den Elektroden reduziert Probleme mit DEP-basierte Methoden wie Elektrolyse und Blasenbildung, Probenkontamination und Delamination Elektrode verbunden. Als Ergebnis ist cDEP besonders nützlich für biologische Proben, da es unterstützt die Lebensfähigkeit der Zellen in der Probe. Wichtig ist, dass cDEP Probe Sterilität zu erhalten. Ein Chip kann in einer Zellkultur Haube vorbereitet werden und das Experiment kann ohne Probenkontakt zu Metallelektroden oder zu verlangen, dass die Probe offen für die environme sein durchgeführt werdennt. Eine einfache Reservoir kann auf den Chip Steckdose befestigt werden, um sterile Probenrückgewinnung erleichtern. Zusätzlich ist die Herstellung von Fluid Elektroden aus demselben biokompatiblen Polymermaterial (PDMS) als Probenkanal reduziert die hohe Kosten mit benutzerdefinierten Strukturierung von Metallelektroden, die für die Herstellung erforderliche Zeit entstehen, und begrenzt die Notwendigkeit für spezielle Reinraumanlagen für die Anfangsmuster der wiederverwendbaren Silizium-Wafer-Briefmarke. Bewegung der Teilchen aufgrund DEP hängt von den Eigenschaften des Teilchens und des Mediums, als auch die räumlichen Gradienten des elektrischen Feldes. Ein Partikel-und frequenzabhängigen Faktor, genannt der Clausius-Mossotti (CM)-Faktor, nimmt einen Wert im Bereich von -0,5 bis 1 und bestimmt die Richtung der DEP-Kraft. Die Frequenz, bei der das CM Faktor gleich Null ist, die Übergangsfrequenz bezeichnet. Dies ist der Punkt, an dem kein dielektrophoretische Kraft auf ein Partikel und dem CM Faktoränderungen Vorzeichen ausgeübt wird. A single Gangsfrequenz für inerte feste Mikrokügelchen tritt auf, wenn die CM-Faktor ändert sich von negativ auf positiv 25 Für Säugerzellen in geringer Leitfähigkeit Puffer in der Größenordnung von 0,01 S / m, einer ersten Übergangsfrequenz, die einen Übergang von nDEP zu pDEP nahe 10 existiert. - 100 kHz, und wird durch die Größe, Form, Zytoskelett und Membraneigenschaften der Zelle beeinflusst. 26,27 Eine zweite Übergangsfrequenz bei einer Verschiebung von der pDEP zu nDEP Regime ist in der Größenordnung von 10 MHz und wird durch das beeinflusst Kern-Zytoplasma-Verhältnis, Zytoplasma Leitfähigkeit und endoplasmatischen Retikulum. 27 DEP-Kraft kann ohne die Anwesenheit der Fluidströmung verwendet werden, aber hier verwenden wir ein fließendes Fluid kontinuierlich Sortierung der suspendierten Partikel zu erzielen. Der kombinierte Einfluss der Dielektrophoresekraft und des Stokes &#39;Widerstandskraft diktieren die translatorische Bewegung eines Teilchens. Wir haben Vorrichtungen für den Betrieb in zwei Frequenzbereichen entwickelt. Höhere frequency-Geräte (100-600 kHz) betrieben haben mit pDEP und erzielte Batch Sortierung von Zellen, wie Prostata-Tumor initiierende Zellen (TIC), Eierstock-Maus-Oberfläche Epithelzellen (MOSE)-Zellen, MDA-MB-231 Brustkrebszellen oder leben THP -1 Zellen durch selektive Fang Zellen von Interesse auf isolierenden Beiträge im Probenkanal befindet. 28-31 Niederfrequenz (5-100 kHz) Geräte arbeiten kontinuierlich, und wenn bei einer Frequenz betrieben, zu dem eine Bevölkerung erfährt pDEP während die Bevölkerung Erfahrungen Hintergrund nDEP kann Teilchenbahnen umleiten Sortierung zu erzielen. 32-34 Diese Niederfrequenz-Geräte wurden verwendet, um Krebszellen zu sortieren von roten Blutzellen zu bestimmen, die Veränderungen der dielektrischen Eigenschaften einer progressiven MÖSE Zelllinie, und um die Auswirkungen von nicht-aufzuklären toxischen Sphingolipid Behandlungen auf Umkehr aggressiven Eigenschaften von aggressiven MOSE Zellen. Zusätzlich kann cDEP Mikrovorrichtungen ausgelegt sein, um einen erhöhten Durchsatz zu arbeiten, derzeit bis zu 1 ml / hr. 31,35 Wie beschrieben, wird die Flexibilität und die geringen Kosten des Herstellungsprozesses ermöglicht eine kundenspezifische Vorrichtungsgeometrien, die die vorgelegten experimentellen Verfahren für eine Vielzahl von Anwendungen relevant sein können. Das langfristige Ziel ist es, cDEP markierungsfreien Zellsortierung und Bereicherung auf einem klinischen Niveau zu realisieren, mit Probenrückgewinnung für die nachfolgende Kultur-oder Verarbeitung. Das hier vorgestellte Verfahren ist ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur Herstellung von Experimenten, welche die Zugänglichkeit von DEP erhöht. Wir zeigen die Herstellung eines cDEP Chip und das Versuchsprotokoll, um die Charakterisierung und Anreicherung von Eierstockkrebszellen von fluoreszierenden Mikrosphären zu erreichen.

<table><tbody><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS)</td><td>Dow Corning, Midland, MI,USA</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger </td><td>Das Mikroskop Depot</td><td>76079</td><td>2x3 Zoll geschliffene Kanten</td></tr><tr><td>Microbore PTFE-Schlauch</td><td>Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-06417-31</td><td>Dünnwandige 20 Gauge, 0,032" ID x 0,056" OD, 100 ft/Rolle</td></tr><tr><td>Luer-Slip-Kunststoffspritzen</td><td>National Scientific Firma</td><td>S7510-1</td><td></td></tr><tr><td>Nadelspitze</td><td>Howard Electronic Instrumente</td><td>JG20-1.0</td><td>20 Gauge 1.0", ID=0.025" OD=0.036"</td></tr><tr><td>D(+)-Saccharose</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>S3-500</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glukose, Reagenz ACS, wasserfrei</td><td>Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ</td><td>AC410955000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>112-025-101</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM, Molecular Probes</td><td>Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA</td><td>C3100MP</td><td>Anregungswellenlänge 488/Emissionswellenlänge 516</td></tr><tr><td>Rhodamin B, O</td><td>Science Lab</td><td>SLR1465-100G</td><td>Anregungswellenlänge 540/Emissionswellenlänge 625</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10X)</td><td>Gbiosciences, St. Louis, MO</td><td>RC-147</td><td></td></tr><tr><td>Leica, Inverslichtmikroskop </td><td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td><td>Leica DMI 6000B</td><td></td></tr><tr><td>Leica DFC420, Farbkamera</td><td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td><td>Leica DFC420</td><td></td></tr><tr><td>Funktionsgenerator </td><td>GW Instek, Taipei, Taiwan</td><td>GFG-3015</td><td></td></tr><tr><td>Breitband-Leistungsverstärker </td><td>Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA</td><td>AL-50HF-A</td><td></td></tr><tr><td>HFHV Ausgang Transformator</td><td></td><td>AL-T50-V25/300-F100K-600K</td><td></td></tr><tr><td>Hochspannungsverstärker</td><td>Trek</td><td>Modell 2205</td><td></td></tr><tr><td>USB Modulares Oszilloskop, 100</td><td>MHz AgilentTechnologies</td><td>U2701A</td><td></td></tr><tr><td>Expanded Plasma Cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001/002 (115/230V)</td><td>air</td></tr><tr><td>plasma Scotch Magic Tape</td><td>3M</td><td></td><td>jede verfügbare Breite ist ausreichend</td></tr><tr><td>1,5-mm-Stanzer </td><td>Harris Uni-Core</td><td>Z708836-25EA.25</td><td></td></tr><tr><td>% Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres Sulfat-Mikrosphären</td><td>Invitrogen</td><td>F8858 4,0</td><td>&mu; m, rot fluoreszierend (Anregungswellenlänge 580/Emissionswellenlänge 605)</td></tr><tr><td>AZ 9260 Fotolack </td><td>AZ Electronic Materials</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ 400 K Entwickler</td><td>AZ Electronic Materials</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylammoniumhydroxid (TMAH) 25% </td><td></td><td></td><td>bereitgestellt von Virginia Tech Reinraum</td></tr><tr><td>Teflonbeschichtung</td><td></td><td></td><td>aufgebracht mit DRIE-Maschine</td></tr><tr><td>Silikon Wafer</td><td>University Wafer</td><td>452</td><td>100 mm Durchmesser, 500 &mu; m Dicke, einseitig poliert (SSP) </td></tr><tr><td>Tiefes reaktives Ionenätzen (DRIE)</td><td>Alcatrel</td><td>AMS SDE 100</td><td></td></tr></tbody></table>

markierungsfreie isolierung und anreicherung von zellen durch kontaktlose dielektrophorese

Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Dielektrophorese (DEP) ist das Phänomen, durch das polarisierte Teilchen in einer nicht-gleichförmigen elektrischen Feldes Translationsbewegung unterzogen, und kann verwendet werden, um die Bewegung der Mikropartikel in einer Oberflächenmarker-unabhängigen Weise zu lenken. Traditionell DEP Geräten gehören planaren Metallelektroden im Probenkanal gemustert. Dieser Ansatz kann teuer werden und erfordert eine spezielle Reinraumumgebung. Kürzlich wurde eine berührungsfreie Ansatz namens kontakt Dielektrophorese (cDEP) entwickelt worden. Dieses Verfahren nutzt die klassischen Prinzip der DEP, dabei direkten Kontakt zwischen Elektroden und Probe durch Strukturierung fluidischen Elektroden und ein Probenkanal aus einer Polydimethylsiloxan (PDMS)-Substrat und findet Anwendung als schneller Mikrofluidik-Strategie, zu sortieren und zu bereichern Mikropartikeln. Einzigartig an dieser Methode ist, dass das elektrische Feld über fluidische Elektrodenkanäle hat, die eine leitfähige Flüssigkeit, die von der getrennt erzeugtProbenkanal durch eine dünne isolierende Barriere. Da Metallelektroden nicht direkt an die Probe, Elektrolyse, Elektrode Delamination und Kontamination der Probe vermieden werden. Zusätzlich ermöglicht dies eine preiswerte und einfache Herstellungsverfahren. cDEP ist somit zur Manipulation sensitive biologische Partikel geeignet. Die auf die Partikel wirkenden Dielektrophoresekraft hängt nicht nur von räumlichen Gradienten des elektrischen Feldes durch anpassbare Design des Gerätes Geometrie erzeugt, aber die inneren biophysikalischen Eigenschaften der Zelle. Als solches ist cDEP eine markierungsfreie Technik, die je nach Oberflächen ausgedrückt molekularen Biomarkern, die variabel innerhalb einer Population ausgedrückt werden kann, während weiterhin Charakterisierung, Anreicherung, und Sortierung von Biopartikel vermeidet. Hier zeigen wir die Grundlagen der Herstellung und Experimentieren mit cDEP. Wir erklären die einfache Zubereitung eines cDEP Chip mit weichen Lithographiey-Techniken. Wir diskutieren die experimentelle Verfahren zur Charakterisierung Gangsfrequenz eines Teilchens oder einer Zelle, die Frequenz, bei der die dielektrophoretische Kraft Null. Schließlich zeigen wir die Verwendung dieser Technik zum Sortieren einer Mischung von Eierstockkrebszellen und fluoreszierenden Mikrokugeln (Perlen).

DEP soll qualitativ in den Probenkanal beobachtet werden um zu bestätigen, das Gerät ist betriebsbereit, wenn das elektrische Feld vorhanden ist. Ein Verfahren, um das Vorhandensein von DEP zu testen, ist die Frequenz auf Werte weit von der Übergangsfrequenz, wo starke pDEP und nDEP vorhergesagt (etwa&gt; 40 kHz bis pDEP und &lt;10 kHz bis nDEP für die meisten Säugetierkrebszellen in einem beobachten beobachten einzustellen Puffer mit einer Leitfähigkeit von 100 uS / cm). Es sei darauf hingewiesen, dass Mikrokügelchen aufweisen inerten pDEP unterhalb ihrer Übergangsfrequenz und nDEP oberhalb ihrer Grenzfrequenz sein. Für die Sägezahn-Feature-Geometrie hier vorgestellten sollte pDEP für Zellen bei der höheren Testfrequenz gesehen werden, die durch das Auftreten der Perle Verkettung und die Konzentration von Zellen oder Partikel an der Sägezahn-Funktion Rand des Kanals angezeigt, während am unteren Testfrequenz, nDEP sollte offensichtlich sein, wenn die Zellen in den Bereich näher an der geraden Kante des Kanals beschränkt. Bei diesen niedrigen Frequenzen können Zellen Lyse durch Elektroporation, so kann die Probe scheinen weniger Zellen enthalten, und diejenigen, die sichtbar sind, erscheinen ein oder verschwommen, wenn unter Verwendung einer enzymatisch aktivierten fluoreszierenden Farbstoff. Verifizieren der Frequenzen, bei denen pDEP und nDEP auftreten ermöglicht die Bestimmung der Übergangsfrequenz, wie in dem Protokoll beschrieben. Für Säugetierkrebszellen, wie z. B. L-MÖSE welche hier beobachteten wir nDEP bei 5 kHz (Fig. 5a) und starke pDEP bei 60 kHz (Fig. 5b). MÖSE-L-Zellen hatten einen Durchmesser von 17,7 ± 3,3 &amp;mgr; m (n = 268 Zellen) und die Kügelchen einen Nenndurchmesser 4 um. Eine vollständige Analyse der dielektrischen Eigenschaften von MOSE-L-Zellen im Vergleich zu Zellen MOSE in früheren Stadien der Progression kann in der jüngsten Arbeit von Salmanzadeh et al. Gefunden werden 33 Wenn pDEP nDEP und sind nicht an diesen Extremen beobachtet, könnte verschiedene Probleme auftreten werden. Die Leitfähigkeit der Probe kann durch Verunreinigungen oder Zell lysierenden zu hoch sein. UNZUREICHEnt elektrische Feld kann durch Blasen in den Flüssigkeitskanälen Elektrode, die Stromleitung zu dem Teil der Kanäle angrenzend an den Probenkanal zu verhindern, gefangen erzeugt werden. Instationäre Strömung durch eine Blase in der Spritze oder Einlassschlauch eingeschlossen verursacht werden, Blasen aus nicht Halten der Vorrichtung unter Vakuum für eine ausreichende Zeit ist oder nicht schnell Füllen der Vorrichtung nach dem Entfernen aus der Vakuumleck durch Delamination schlecht verbundenen PDMS um die resultierende Objektträger aus Glas, Risse in der Barrieremembran durch übermäßige Kraft ausgeübt wird, wenn das Füllen der Kanäle oder Durchflussraten bei den Extremen der Pumpenbetriebsbereich. Zusätzlich zur Bestimmung der Übergangsfrequenz von Zellen kann diese Technik verwendet, um eine Mischung, die hier durch eine Mischung von MÖSE-L-Zellen und Perlen dargestellt sortieren. Dieses Beispiel nutzt die negative Dielektrophorese (nDEP) von 4 um Perlen bei Frequenzen, bei denen MOSE-L-Zellen erleben positive Dielektrophorese (pDEP) ausgestellt. Wir operated die Vorrichtung bei 200 V RMS und 10 kHz (Fig. 6a) und beobachteten, dass beide Zellen und Kügelchen wurden gemischt, wie sie nDEP erlebt. Bei 50 kHz haben wir beobachtet Bewegung MÖSE-L-Zellen an der Oberseite des Kanals, während die Kügelchen wurden mit dem unteren Abschnitt des Kanals beschränkt, so dass die Trennung des Gemisches in zwei Komponenten (Abbildung 6b). <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg"/> 5. Die Position des MÖSE-L-Zellen wird durch Änderung der Frequenz des angelegten elektrischen Feldes manipuliert. Die Bilder werden in der letzten Sägezahn-Funktion in den Probenkanal entnommen und die fluidischen Elektroden sind an den Ecken auf der rechten Seite. Sie werden mit PBS, das Rhodamin B, die, um die Kanäle zu visualisieren fluoresziert gefüllt. (A) MOSE-L-Zellen erleben nDEP bei 200 V RMS<html> und 5 kHz. (b) MOSE-L-Zellen erleben Perle Verkettung und pDEP bei 200 V RMS und 60 kHz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Fig. 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6highres.jpg"/> 6. Durch die letzte Sägezahn-Funktion Eine Mischung von MOSE-L-Zellen (grün) und 4 um Perlen (rot) (a) fließen in den Probenkanal mit einer niedrigen Frequenz cDEP Gerät. Bei 200 V und 10 kHz-Zellen und Perlen sind gemischt. Pfeile zeigen auf schwach erscheinen, Zellen, die haben wahrscheinlich aufgrund der geringen Frequenzbedingungen gestorben. (B) Bei 200 V und 50 kHz Zellen pDEP erleben und zu bewegen, um die Funktion Rand des Kanals, während Perlen nDEP erleben und sich weiterhin für die Region näher beschränkt die gerade Kante.p_upload/50634/50634fig6highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.

Kontaktlose Dielektrophorese (cDEP) erreicht Sortierung und Anreicherung der Partikel über ihren inneren dielektrischen Eigenschaften. Fluidic Elektrodenkanäle ersetzen traditionelle metallische Elektroden, um DEP, passend cDEP auf nicht-sterile beschädigen Charakterisierung und Sortierung von biologischen Partikeln. Wir zeigen, wie man eine cDEP Kleinst vorzubereiten und durchzuführen Zellcharakterisierung und Sortierversuche.

Markierungsfreie Isolierung und Anreicherung von Zellen durch Kontaktlose Dielektrophorese

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe der Farbstoff-Elektrophorese eine translatorische Bewegung von in einer druckgetriebenen Strömung suspendierten Zellen zu erzeugen, ohne die Elektroden mit der Probe in Kontakt zu bringen. Dies wird erreicht, indem man zunächst die betreffenden Zellen in einem Puffer mit geringer Leitfähigkeit suspendiert. Der zweite Schritt besteht darin, die mikrofluidische Vorrichtung mit der Zellsuspension zu befüllen und ein hochleitfähiges Fluid in die Elektrodenkanäle einzubringen.Anschließend wird das vorbereitete Gerät mit Hochspannungselektronik verbunden, und die Frequenzantwort der Zellbewegung wird durch ein von einer an ein inverses Mikroskop angebrachte Kamera geliefertes Video aufgezeichnet. Der letzte Schritt besteht darin, die Videobilder zu analysieren, um elektrische Eigenschaften der Zellen quantitativ vorherzusagen. Letztendlich wird die kontaktlose dielektrische Elektrophorese genutzt, um zu zeigen, dass Zellen mit unterschiedlichen elektrischen Eigenschaften auf schonende, markierungsfreie Weise sortiert werden können, wobei kostengünstige und einfach herzustellende mikrofluidische Vorrichtungen verwendet werden.Daher eignet sich diese Methode für Anwendungen wie die Sortierung lebender von toten Zellen, die Isolierung von Tumorzellen, die Anreicherung von Tumorzellen nach Krankheitsstadium sowie die Untersuchung der Wirkung von Wirkstoffen auf verschiedene Zellen hinsichtlich ihrer dielektrischen Eigenschaften. Die Hauptvorteile dieser Technik im Vergleich zu etablierten Verfahren wie der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung bestehen darin, dass Zellen basierend auf ihren intrinsischen biophysikalischen Eigenschaften sortiert und charakterisiert werden können, ohne dass eine Markierung mittels Biomarkern erforderlich ist, und dass die Probensterilität gewahrt bleibt, da ein Kontakt zwischen Elektroden und Probe vermieden wird. Wir hatten diese Idee ursprünglich, als wir eine Technik entwickeln wollten, die mehrere Probleme vermeidet, wie beispielsweise Probenkontamination, Elektrolyse, aufwendige Herstellung, die mit herkömmlichen dielektrophoretischen Vorrichtungen verbunden sind.Zur Isolierung von Säugetierzellen. Befolgen Sie zuvor beschriebene Verfahren unter Verwendung von Fotolack und tiefer reaktiver Ionenätztechnik, um das gewünschte Kanaldesign in eine Siliziumscheibe zu ätzen, und bringen Sie eine dünne Teflonschicht auf, um die Freisetzung des Mikrogeräts von der Scheibe zu verbessern. Wickeln Sie die Scheibe mit Aluminiumfolie ein, um Verschütten zu verhindern.Mischen Sie Polymethylaluminat oder PDMS im Verhältnis 10 zu 1 von Elastomer zu Härtungsmittel DGA etwa 20 Minuten lang und gießen Sie die Mischung auf das Wafer. Anschließend das Wafer 45 Minuten bei 100 Grad Celsius erhitzen, um nach dem Abkühlen eine Beschädigung der Teflonbeschichtung des Stempels zu vermeiden. Entfernen Sie die Aluminiumfolie.Schneiden Sie das PDMS mit einem chirurgischen Skalpell zurecht und stanzen Sie Zugangsöffnungen an Einlass und Auslass des Kanals. Verwenden Sie hierzu einen stumpfen Stanzgerät, das der Tubing-Größe angepasst ist; in diesem Fall wird ein 1,5-Millimeter-Stanzgerät verwendet. Reinigen Sie anschließend einen Objektträger gemäß der schriftlichen Protokollanweisung.Reinigen Sie das PDMS-Gerät mit Scotch-Magic-Tape. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Kanäle sauber sind. Anschließend setzen Sie den Objektträger und das PDMS-Gerät zwei Minuten lang einer Luft-Plasma-Behandlung aus und drücken die Kanalseite des Geräts fest auf den Glasobjektträger, wobei die Bildung von Luftblasen zwischen Gerät und Objektträger vermieden werden sollte.Bereiten Sie einen Puffer mit niedriger Leitfähigkeit wie im Textprotokoll beschrieben vor, der als DEP-Puffer bezeichnet wird. Suspendieren Sie die Zellen im DEP-Puffer bei 3 Millionen Zellen pro Milliliter, wobei hier fluoreszenzmarkierte, krebsartige, spätstadiige Maus-Ovarial-Epithelzellen oder Moos-L-Zellen verwendet werden. Messen Sie die Leitfähigkeit der gefärbten Zellsuspension mithilfe eines fluoreszenten, membranpermeablen Farbstoffs.Die Leitfähigkeit sollte etwa 100 Mikrosiemens pro Zentimeter betragen. Wenn die Leitfähigkeitsmessung zu hoch ist, zentrifugieren Sie die Probe. Resuspendieren Sie sie in Tiefenpuffer und wiederholen Sie die Leitfähigkeitsmessung.Der schwierigste Aspekt dieses Protokolls besteht darin, Blasen in den Elektrodenkanälen und im Probenkanal zu vermeiden. Blasen in den Elektrodenkanälen können die elektrolytische Verbindung verhindern, und Blasen im Probenkanal können einen gleichmäßigen Fluss verhindern. Achten Sie darauf, die gezeigten Schritte durchzuführen, um Blasen zu vermeiden und einen stabilen Fluss sicherzustellen, bevor Sie den C-dip-Mikrofluidik-Chip beladen. Stellen Sie ihn dafür 30 Minuten unter Vakuum.Inzwischen schneiden Sie ein Stück flexiblen Schlauches so zu, dass es die Distanz von der Spritzenpumpe bis zur Mikroskopbühne überbrückt, an der sich der mikrofluidische Chip befinden wird. Es wird ein sechs Zoll langes Schlauchstück benötigt. Bringen Sie den Schlauch an der Nadelspitze der Spritze an.Schätzen Sie dann die erforderliche Länge der Auslassleitung ab, indem Sie das Zielvolumen der gesammelten Probe durch die Querschnittsfläche des Schlauchs teilen. Schneiden Sie die erforderliche Schlauchlänge zu. Ziehen Sie anschließend die Zellsuspension in eine Spritze.Überprüfen Sie, dass sich keine Blasen in der Schlauchleitung oder der Spritze befinden. Nach dem Entfernen des Chips aus dem Vakuum setzen Sie das Auslassrohr ein und befüllen den Probenkanal schnell. Um eingeschlossene Luftblasen in den Kanälen zu vermeiden, klopfen Sie vorsichtig auf die Spritze, während Sie den Kanal befüllen.Um zu vermeiden, dass die dünne isolierende Barriere beschädigt wird, platzieren Sie leere Pipettenspitzen schnell zur Vorbereitung der Elektrodenkanäle an einem Auslass jedes fluidischen Elektrodenkanals, pipettieren Sie 200 Mikroliter PBS, das eine kleine Menge Brom B enthält, und klopfen Sie vorsichtig, um die Flüssigkeit in das gegenüberliegende Ende des Elektrodenkanals einzubringen. Halten Sie vorsichtig Druck aufrecht, bis PBS mit Brom B sichtbar in die Spitze der leeren Pipettenspitze vorr&uuml;ckt; wiederholen Sie dies f&uuml;r jeden Elektrodenkanal. Kanal R domine B wird nur zur fluoreszierenden.Visualisieren Sie die fluidischen Elektrodenkanäle nach dem Befüllen. Füllen Sie jedes Pipettenspitzenreservoir mit PBS, mit R domine B. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen in den Pipettenspitzenreservoiren und entfernen Sie sichtbare Blasen, indem Sie vorsichtig mehrmals auf- und abpipettieren. Trennen Sie die Auslassleitung ab und entsorgen Sie sie ordnungsgemäß.Danach ein neues Auslassschlauch-Reservoir einsetzen. Das Zielvolumen sammeln. Den Chip auf dem Objekttisch eines umgekehrten Mikroskops mit digitaler Kamera positionieren.Befestigen Sie die Spritze an der Spritzenpumpe und führen Sie die Drahtelektroden in die Reservoire der fluidischen Elektrodenkanäle ein. Pumpen Sie die Flüssigkeit mit einer Geschwindigkeit von einem Milliliter pro Stunde durch, um einen guten Kontakt zwischen der Spritzenpumpe und der Spritze sicherzustellen. Überprüfen Sie visuell die Kanallänge, um einen ungehinderten Zellfluss sowie das Fehlen von Blasen oder Leckagen zu gewährleisten. Verringern Sie anschließend die Flussrate auf fünf Mikroliter pro Stunde.Aus Sicherheitsgründen. Prüfen Sie die Elektronik, indem Sie den Funktionsgenerator, den Hochspannungsverstärker und das Oszilloskop einschalten und auf die gewünschte Spannung und Frequenz einstellen. Hier betragen diese Parameter 200 Volt und 20 Kilohertz.Nach der Überprüfung einer akzeptablen Leistung schalten Sie die Stromversorgung aus. Anschließend schließen Sie die Elektroden an den Hochspannungsverstärker an. Sobald ein stabiler Durchfluss erreicht ist, legen Sie die gewünschte Spannung bei der gewünschten Frequenz an. In diesem Experiment beträgt die Spannung 200 Volt Effektivwert bei Frequenzen zwischen fünf und 60 Kilohertz.Nehmen Sie die Videodateien der Zellreaktion mit Bildverarbeitungstechniken auf, um die Zellverteilung im Kanal zu quantifizieren und die Übergangsfrequenz zu charakterisieren. Gehen Sie dazu folgendermaßen vor: Halten Sie eine konstante Spannung aufrecht und variieren Sie die Frequenz systematisch zu Beginn und am Ende des Experiments sowie zufällig zwischen den experimentellen Durchläufen. Nehmen Sie die Kontrollzellverteilung auf, also die Verteilung der Zellen ohne Anlegen eines elektrischen Feldes.Nachdem eine neue Frequenz eingestellt wurde, warten Sie die Zeitspanne ab, die erforderlich ist, damit die Zellen vom Einlass bis zur überwachten Position fließen und anschließend die Aufzeichnung beginnt. Führen Sie dann die Bildverarbeitung zur Charakterisierung der Crossover-Frequenz wie im Textprotokoll beschrieben durch und suspendieren Sie die gewünschte Mischung in DEP-Puffer bei einer Gesamtkonzentration von 3 Millionen Partikeln pro Milliliter. In diesem Fall handelt es sich bei der Mischung um Moos-L-Zellen zusammen mit vier Mikrometer großen fluoreszierenden Kügelchen in DEP-Puffer; führen Sie die zuvor beschriebenen Schritte durch. Um ein CEP-Gerät vorzubereiten, betreiben Sie das Experiment bei einer Frequenz zwischen den beiden bestimmten Crossover-Frequenzen der Zielzellen und der Hintergrundpartikel, sodass die beiden Partikelpopulationen DEP-Kräfte in entgegengesetzte Richtungen erfahren.Um den Inhalt verschiedener Proben zu sammeln, entfernen Sie das Abflussrohr nach dem Sammeln des Zielvolumens, indem Sie einen Handschuhfinger über die Abflussöffnung legen und vorsichtig am Schlauch ziehen. Gießen Sie das gesammelte Zielvolumen in ein Reservoir zur weiteren Analyse. Bei Säugetumorzellen, wie den hier am häufigsten verwendeten L-Zellen, wurde bei fünf Kilohertz negativer DEP und starker positiver DEP beobachtet.Bei 60 Kilohertz haben MOS L-Zellen einen Durchmesser von 17,7 ± 3,3 Mikrometern, und die Kügelchen haben einen Nenndurchmesser von vier Mikrometern. Neben der Bestimmung der Übergangsfrequenz von Zellen kann diese Technik verwendet werden, um ein Gemisch zu sortieren, wie hier anhand einer Mischung aus MO'S L-Zellen und Kügelchen veranschaulicht. Dieses Beispiel nutzt die negative Dielektrophorese aus, die von vier Mikrometer großen Kügelchen bei Frequenzen zeigt, bei denen MO'S L-Zellen positiven dielektrophoretischen Kräften unterliegen.Wenn das Gerät bei 200 Volt Effektivwert und 10 Kilohertz betrieben wurde, wurden beide hier grün dargestellten Zellen und hier rot dargestellten Kügelchen gemischt, da sie eine negative DEP bei 50 Kilohertz erfuhren. Es wurde eine Bewegung der MOS-L-Zellen zum oberen Kanalbereich beobachtet, während die Kügelchen auf den unteren Kanalabschnitt beschränkt blieben, wodurch eine Trennung des Gemischs in zwei Komponenten ermöglicht wurde. Nach diesem Verfahren können anschließend weitere Techniken durchgeführt werden, wie Zellkultivierung und immunfluoreszenzgestützte Bildgebung oder biochemische Assays, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie die dielektrischen Eigenschaften mit den physikalischen Merkmalen der Zellen korrelieren.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Biologen den Weg dazu, mithilfe eines Maus-Ovarialkarzinom-Modells zu untersuchen, wie metabolitenbedingte Veränderungen im Cytoskelett der Zelle mit deren dielektrischen Eigenschaften korreliert werden können. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Zellen mithilfe der kontaktlosen Elektrophorese angereichert und sortiert werden können.

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