Name: Matrix-assistierte Laser Desorptions / Ionisations-Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie-Analyse von intakten Proteinen mit mehr als 100 kDa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Erfahren Sie die MALDI-TOF-Massenspektrometrie für die Analyse intakter Proteine über 100 kDa. Diese Methode ermöglicht hochsensitive Proteincharakterisierung mit verbesserter Toleranz gegenüber Verunreinigungen.

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Wir danken Dr. Christophe Masselon (IRTV, CEA, Grenoble) und die Mitglieder der Virusinfektion und Krebs-Gruppe an der IBS, für die kritische Bewertung des Manuskripts und für hilfreiche Diskussionen. Wir sind dankbar, dass Cyril Dian für die Art Geschenk des Proteins Crm1. Diese wissenschaftliche Arbeit fand in der Massenspektrometrie-Anlage von Grenoble Weisen Centre (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL). Es wurde von der Französisch-Infrastruktur für Integrated Structural Biology Initiative (FRISBI, ANR-10-InSb-05-02) unterstützt wird, GRAL (ANR-10-LABX-49-01) [in der Grenoble Partnerschaft für Strukturbiologie] und durch die Französisch Nationalen Zentrum für wissenschaftliche Forschung (CNRS).

1. Protein-Probenvorbereitung: Puffer Exchange (Optional) 5-25 ul mikromolaren Konzentrationen von Protein (1 bis 20 um) erforderlich. Pufferaustausch kann mit Kreiselultrafiltrationseinheiten (z. B. Vivaspin, Sartorius) oder Mikro Gelfiltrationssäulen (zB Micro Bio-Spin-6-Säulen, Bio-Rad) 29,30 durchgeführt werden. Pufferaustausch Schritte können wiederholt werden, 2-3x. Ausführliche Beschreibung des Pufferaustausch wurde zuvor vorgestellt 29,30. Zum Beispiel nutzen wir 20 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan (dh Tris) pH 8 als endgültige Puffer. Anmerkung: Dieser Schritt könnte in vielen Fällen weggelassen werden. Es sollte ausgeführt werden, wenn eine Proteinprobe enthält Moleküle oder Puffer, die stark mit MS-Detektion stören können [z. B. Glycerin, 4 - (2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure, HEPES]. Es ist auch sinnvoll, die qu verbessernnalität der Spektren. 2. Umkristallisation von Matrizen, um ihre Reinheit (Optional) verbessern <ol><li> Gießen von 10 ml 40% Ethanol (EtOH) in einem Pyrex-Kolben. </li><li> Add 600 mg einer Matrix. </li><li> Verwendung eines Wasserbades und einer Widerstandsheizung, erwärmt die Matrixlösung und rühren, bis die Matrix vollständig mit einem Glasstab oder einem Magnetrührer gelöst. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2, bis Sie eine gesättigte Lösung zu haben. </li></ol> Anmerkung: Die Verwendung einer zu großen Menge des Lösungsmittels oder durch Auflösen der Matrix weit unter dem Siedepunkt der Lösung eine schlechte Ausbeute der Kristalle oder gar keine Kristalle führen. <ol start="5"><li> Lassen Sie die Lösung langsam abkühlen. Sie können es bei Raumtemperatur für mehrere Stunden bei 4 ° C über Nacht verlassen und wieder. Hinweis: Wenn keine Kristalle gebildet werden, kann die Kristallisation durch Kratzen der Innenseite des Bechers (gerade unterhalb der Oberfläche der Lösung) mit einem Glasstab ausgelöst werden. </li><li> Sammle die Matrix Kristalle durch Filtration. </li><li> Mit einem Mindestbetrag von eiskaltem Lösungsmittel Spülen der Kristalle und filtrieren sie. </li><li> Ermöglichen, dass die Kristalle zu trocknen. Sie können Vakuum für diesen Schritt zu verwenden. </li></ol> 3. Reinigung von MALDI Edelstahl Ziel <ol><li> Spülen Sie die MALDI-Platte mit Methanol (MeOH) und wischen Sie vorsichtig mit einem Reinigungstuch speziell für Laboranwendungen (zB Kimwipe) gefertigt. </li><li> Mit H 2 O spülen das Ziel und wischen Sie sie mit einem Reinigungstuch. </li><li> Legen Sie die MALDI-Platte in einem 600 ml-Becherglas und decken Sie es mit 50% EtOH. </li><li> Beschallen das Ziel in der EtOH-Lösung für 10 min in ein Ultraschallbad. </li><li> Wenn es noch Reste auf dem Teller, wiederholen Sie die Schritte 1-4 erneut. </li><li> Schließlich spülen Sie das Ziel mit MeOH (oder mit Wasser, siehe Hinweis unten), kippen sie in einer Weise, die alle die Flüssigkeit auf einem Reinigungstuch gesammelt. Lassen die Ziel trocknen bei Raumtemperatur oder unter Verwendung einer stickstoffGasstrom. </li></ol> Hinweis: Ein ähnliches Verfahren wurde zuvor beschrieben 15. Hinweis: Die für die letzte Spülung der Ziel verwendete Lösungsmittel (MeOH oder Wasser) bestimmt einige Zielfunktionen. Wenn das Ziel mit MeOH gespült, breitet sich die Probe auf der Ziel viel mehr als bei der Verwendung von Wasser. 4. α-CHCA Dünnschicht-Lösung: Vorbereitung und Deposition auf dem MALDI-Target <ol><li> Lösen α-CHCA in Aceton, um eine gesättigte Lösung zu machen. </li><li> Von Hand (ohne Pipette) tauchen Sie ein 10 ul Spitze (zB GELoader Tipp, Eppendorf) in α-CHCA gesättigte Lösung: eine kleine Menge der Lösung wird in der Spitze (aufgrund der Kapillarwirkung) fließen. </li><li> Berühren Sie sehr schnell (dh 1 sec) die MALDI-Target mit Pipettenspitze und die Hinterlegung der α-CHCA Aceton-Lösung auf der MALDI-Target. Dies wird die Matrix dünne Schicht, in der das Protein bildenProbe aufgebracht werden. Versuchen Sie, eine dünne Schicht vor Ort so gering wie möglich zu generieren. </li></ol> Hinweis: Bei der Verwendung von SA als Matrix, bereiten wir eine dünne Schicht mit einer gesättigten Lösung von SA in Aceton. 5. Vorbereitung der Natrix Lösungen: SA, α-CHCA, DHB und CHCA_DHB Mischung 25 <ol><li> Vorbereitung einer 20 mg / ml SA-Lösung in ACN, 0,1% TFA (70:30, v / v). </li><li> Es werden 20 mg / ml α-CHCA Lösung in ACN und 5% Ameisensäure (70:30, v / v) [als &quot;α-CHCA-Lösung&quot; bezeichnet]. </li><li> Vorbereitung einer 20 mg / ml Lösung in DHB ACN und 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) (70:30, v / v) [als &quot;DHB-Lösung&quot; bezeichnet]. </li><li> Mix &quot;α-CHCA Lösung&quot; und &quot;DHB-Lösung&quot; im Verhältnis 1:1 (v / v), um die &quot;CHCA_DHB Lösung&quot; zu erhalten. </li></ol> Hinweis: Man kann &quot;α-CHCA Lösung&quot; und &quot;DHB-Lösung&quot; in unterschiedlichen Verhältnissen zu mischen, bei der Analyse von Proteinen mit einer Masse von weniger als 100 kDa. Für example ein Verhältnis von 40:60 zwischen α-CHCA und DHB (vol / vol) ergibt eine bessere Auflösung, aber weniger Empfindlichkeit (siehe Diskussion). 6. Probenabnahme auf das MALDI-Target <ol><li> Kaution 0,5 ul der Proteinprobe auf der zuvor hergestellten α-CHCA dünne Schicht. Unmittelbar danach werden 0,5 &amp;mgr; l der Matrix-Lösung (dh der SA-Lösung oder die α-CHCA Lösung oder das &quot;CHCA_DHB mix&quot;). Dies bedeutet, Mischen der Probe und der Matrix auf dem Ziel. </li></ol> Hinweis: Die mit der Matrix in einem Verhältnis von 1:1 in der Regel ein mischt die Proteinprobe. Dieses Verhältnis ist entscheidend für die gute Qualität der MALDI-Spektren. Wenn Sie möchten, um verschiedene Probenkonzentrationen zu testen, können Sie die ACN_formic-Lösung (oben beschrieben) verwenden, um die Probe zu verdünnen. Hinweis: Wenn Sie möchten, können Sie die Probe und die Matrix in einem Rohr zu mischen und dann die Hinterlegung der gemischten &quot;sample_matrix Lösungention &quot;auf der dünnen Schicht. Hinweis: Wir empfehlen Ihnen, verschiedene Probenkonzentrationen testen, weil Verdünnen der Probe können Sie die Störung von Schadstoffen zu reduzieren. Um die Probe zu verdünnen, können Sie die ACN_formic-Lösung (oben beschrieben) verwenden, um die Probe zu verdünnen. 7. Calibrant Deposition <ol><li> Kaution 0,5 ul der Kalibrierungsstandard (zB &quot;Protein Standard II&quot;, Bruker Daltonics, Bremen), dann mit 0,5 ul der Matrix-Lösung. </li></ol> Hinweis: Legen Sie das Kalibrierungs auf der MALDI-Platte neben den Probenflecken Protein (siehe Diskussion). 8. MALDI Spectra Erwerb von Calibrant und Protein-Proben Sobald die Proben und die Eich werden getrocknet, können Sie die &quot;Spots&quot; unter dem Mikroskop beobachten. Diese Beobachtung ist optional und kann vor allem interessant sein, Novizen. Um den Probenspektren erwerben, legen the Ziel in der MALDI-TOF-Instruments und der Auswahl der geeigneten Geräteparameter, die für jeden Gerätetyp unterschiedlich sind. Um die am besten geeignete Set-up zu bekommen sollte man die Empfehlungen des Herstellers zu folgen. Als allgemeine Überlegungen bei der Analyse intakter Proteine, sollte man das Gerät im linearen Modus (nicht im Reflektor-Modus, der für Peptide entsprechende Analysen ist) zu verwenden. Normalerweise nutzen wir unser Instrument in Positiv-Ionen-Modus. Darüber hinaus ist ein Schlüsselparameter der &quot;gepulsten Ionenextraktion&quot;, die die instrumentelle Auflösung 31 verbessert. In einfachen Worten kann die &quot;gepulster Ionenextraktion&quot; als eine Pause zwischen der Erzeugung der Probenionen und der Zeit, wenn die Ionen in Richtung auf den Detektor beschleunigt definiert werden. Bei der Analyse intakter Proteine, sollte man verwendet eine &quot;gepulste Ionenextraktion&quot; (zB 500 ns) größer als bei der Beobachtung Peptide (zB 80 ns). Wählen Sie den entsprechenden m / z-Bereich erwerben, die Spektren of das Kalibrierungs, und das Instrument kalibriert. Wenn Sie die Spektren von Ihren Proben zu erwerben, verwenden Sie die entsprechende Laserintensität (siehe Diskussion).

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir präsentierten ein Detail-Protokoll, um qualitativ hochwertige Massenspektren von großen intakten Proteine ​​mit Molekulargewichten von mehr als 100 kDa zu erwerben, mit einem MALDI-TOF-Instrument. Eine Reihe von kritischen Aspekten der Probenvorbereitung sollten sorgfältig, um die Qualität der Massenspektren zu verbessern berücksichtigt werden. Matrizen und Lösungsmittel von hoher Reinheit von entscheidender Bedeutung, weil alle in den Matrizen und Lösungsmitteln vorhandene Verunreinigungen auf der MALDI-Target konzentriert sind nach der Lösungsmittelverdampfung. Um die Reinheit der MALDI-Matrix zu verbessern, ist es möglich, sie zu reinigen, unter Verwendung klassischer Methoden, Umkristallisation (siehe oben). Wir empfehlen auch frisch Herstellung der Matrizen-Lösungen (mindestens einmal pro Woche), um die Matrix zu verbessern Kristallisation und Matrixabbau zu vermeiden. Die Matrixabscheidung Ansatz ist sehr entscheidend für die endgültige Qualität der Spektren. Wie oben beschrieben, ist die Dünnschichtverfahren unserer Methode of Wahl 12. Außerdem optimiert man den Ansatz für die Abscheidung der ersten Schicht. Wenn die Matrix in Aceton gelöst, um eine gesättigte Lösung zu erhalten, kann das Propanon schnelle Verdampfung des Lösungsmittels, sondern macht auch die Größe der ersten Schicht sehr schwierig zu steuern. Wir schlagen vor, mit einem GELoader Spitze so wenig Bürste, die Sie im matrix_acetone Lösung zu tauchen, um ein Mindestvolumen, der Sie schnell auf der Ziel Einzahlung. Die Größe der ersten Schicht irgendwie steuert die endgültige Größe des MALDI Punkt: Ein kleiner Fleck (dh 0,5-0,75 mm Durchmesser) ist bevorzugt, da in diesem Fall die Probenkonzentration höher ist als im Falle eines großen Fleck. Die Erteilung einer kleinen Stelle unterscheidet sich von der ultra-dünnen Schicht Ansatz zuvor in einem Video JOVE 15 vorgeschlagen. In Fenyo et al. Die dünne Schicht Lösung ist in der ganzen MALDI-Target mit der Seite einer Pipettenspitze verteilt. Dieser Ansatz erfordert die Prüfung der dünnen Schicht, die bestimmte Kriterien erfüllen sollte(Z. B. Geschwindigkeit der Lösungsmittelverdampfung). Wenn das Kriterium nicht erfüllt ist, sollte das MALDI-Target gewaschen werden und eine neue dünne Schicht hergestellt werden soll. Das macht die Vorbereitung recht mühsam für einen Anfänger. Darüber hinaus die Abscheidung von Probe / Matrix-Mischung auf der Platte erfordert die Absaugung des überschüssigen Lösungsmittels mit einer Vakuumleitung und einen Waschschritt mit TFA 15 ist erforderlich, so dass die Fenyo et al. Vorbereitung ein bisschen schwieriger als unser Ansatz. Das Volumenverhältnis zwischen der Matrix und der Probe ist sehr wichtig für eine erfolgreiche Analyse von intakten Proteinen durch MALDI-TOF. Nach der Prüfung verschiedener Verhältnisse schlagen wir vor, ein Verhältnis von 1:1 zu verwenden. Eine andere Matrix: Stichprobenanteil könnte die Qualität der Spektren gefährden, wahrscheinlich aufgrund der inhomogenen Kristallisation. Die Reihenfolge, in der Matrix und der Probe abgeschieden ist ebenfalls kritisch. Nach dem Aufbringen der Matrix dünne Schicht wird die Probe aufgebracht und unmittelbar nach (vor dem sample Stelle wird trocken) die CHCA_DHB Mischung zugesetzt. Dieses Verfahren ist als &quot;Sandwich-Verfahren&quot; 27, wobei die Probe allein zwischen zwei Matrixschichten abgelagert definiert. Als Alternative kann die CHCA_DHB Lösung und die Probe in 0,5 ml-Röhrchen gemischt und dann auf der dünnen Schicht 12 CHCA gesichtet. Dies ergibt einen Spot mit einer homogenen Schicht der Kristalle, was zu hohen Qualität Spektren. Bei der Analyse von Proteinen mit einer Masse von weniger als 100 kDa, der Konzentration des DHB kann erhöht werden (zB 60:40 DHB: CHCA), dies kann schärfer Spitzen produzieren, konnte aber die Messempfindlichkeit (dh weniger intensiven Peaks) zu gefährden. Für eine korrekte Gerätekalibrierung, ist es wichtig, die Kalibrierungsstandards sehr nahe an den Probenstellen zu hinterlegen, so dass man eine bessere Massengenauigkeit zu erhalten. Eine &quot;Pseudo-internen Kalibrierungsverfahren&quot; wurde zuvor vorgeschlagen 15: nach dem Erwerb eines Probenspektrum, das Kalibrierungs Stelle is Laserschuss und Signal des Eich werden dem Probenspektrum aufgenommen. Dies ermöglicht Ihnen, intern kalibrieren Probenspektrum mit den Eichspitzen. Die Laserenergie sollte auch sorgfältig während der Spektrenaufnahme gesteuert werden. In den meisten Fällen erhöht die Empfindlichkeit höhere Energie, senkt aber die Auflösung. Wir schlagen vor, mit dem minimal möglichen Laserenergie, ohne die Empfindlichkeit des Erwerbs. Darüber hinaus, um spektrale Qualität zu verbessern, kann man mehr Schüsse auf jede Probe vor Ort zu erwerben. Normalerweise werden die mehr Schüsse, die Sie erwerben (1000-2000 Aufnahmen), desto höher die Intensität des Signals. Beim Auftreffen auf die Stelle mit dem Laser, muss man die richtige Position (dh &quot;sweet spot&quot;) zu finden, da die Probe nicht homogen verteilt. Sie können auf der gleichen Fläche zu schießen, bis das Signal zu, und dann versuchen, einen anderen Bereich mit der Probe zu finden. Abschließend hohen Reinheit von Matrizen und solvEltern, die für die Probe und Matrizen Abscheidung auf der Ziel verwendeten Methoden, die Position der für die Kalibrierung, die Intensität der Laserenergie, die zum Erwerbszeitpunkt (Anzahl der Aufnahmen / Ort) verwendeten Standards sind entscheidende Faktoren, die man berücksichtigen sollte, wenn Analyse von intakten Proteinen durch MALDI-TOF MS. Autor Beiträge LS und EBE entwarf die Experimente durchgeführt, die massenspektrometrische Experimente, die Daten analysiert und schrieb das Manuskript.

Strukturbiologie stützt sich auf die Produktion von qualitativ hochwertigen Proteinen ein und muss daher mit effizienten und zuverlässigen Techniken zur Proteinanalyse 2,3 gekoppelt werden. In unserem Massenspektrometrie (MS) in einem Labor Institut für Strukturbiologie müssen wir Primärsequenz von Proteinen bestätigen, bewerten die Anwesenheit von Mutationen und posttranslationale Modifikationen der Abbau von Proteinen, die Probenhomogenität, und die Qualität der Isotopenmarkierung (zB deuterierte Proteine, die für magnetische Kernresonanzuntersuchungen 4). Da Strukturbiologen verwenden limitierte Proteolyse strukturell starren Domänen aus flexiblen Teilen zu unterscheiden, müssen wir zuverlässig charakterisieren solchen verkürzten Proteinen unter Verwendung von MS. Wenn Biomoleküle durch MS analysiert werden zwei mögliche Ansätze genutzt werden, um so schwere und labile Moleküle ionisieren leise. Elektrospray-Ionisation (ESI) ionisiert Moleküle direkt aus demFlüssigphase 5; Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisierung (MALDI) erfordert, dass die Biomoleküle mit UV-absorbierenden organischen Molekülen (dh Matrixmolekülen) 6 co-kristallisiert. ESI Time-of-Flight (TOF) MS Flüssigchromatographie gekoppelt hat sich zu einem Routineverfahren für die Analyse von intakten Proteinen, weil es Massenbestimmung mit hoher Genauigkeit (≤ 50 ppm). Es ist jedoch ziemlich anfällig für die Zusammensetzung des Probenpuffers (insbesondere Salze und Detergenzien) und Verunreinigungen (z. B. Polymere), die manchmal schwer zu beseitigen, wodurch die Unterdrückung des Analyten Signal. MALDI-TOF-MS stellt eine Alternative zu ESI-MS, da die Leistung weniger von Pufferkomponenten, Waschmittel und Verunreinigungen beeinflußt und können intakte Protein Massenbestimmung mit ausreichender Genauigkeit (≤ 500 ppm) zur Sequenzvalidierung. Nach protein Verdauung kann MALDI-TOF-MS auch verwendet werden, um die erhaltenen Peptide zur weiteren Primärsequenzbestätigung durch das sogenannte &quot;Peptid-Massenfingerprinting&quot; analysieren. In unseren Händen, die Massenbestimmung intakter Proteine, die größer als 100 kDa und heterogene (wegen Änderungen oder Verkürzungen) sind, ist durch MALDI-MS einfacher als durch ESI-MS. Dies ist auf das Fehlen von überlappenden Ladezustand in ESI-Spektren vorhanden Distributionen. Da darüber hinaus die MALDI-Prozess ist nicht abhängig von der Analyt-Größe 7, ein solches Verfahren ergibt eine hohe Empfindlichkeit, wenn ein Biomolekül Masse über 100 kDa. Bemerkenswert Analysen intakter Proteine ​​wurden mit selbstgemachten Instrumenten zwischen dem Ende der 1980er und Anfang der 1990 von 8-11 durchgeführt. MALDI-TOF kann auch als Screening-Werkzeug, um die Qualität der Proteinproben beurteilen verwendet werden, da es weniger Zeit für die Probenvorbereitung und ist weniger anfällig für interferences aufgrund gemeinsamer Verunreinigungen (z. B. Salze). Nach einer ersten, schnellen Auswertung durch MALDI-MS kann eine Probe durch ESI-TOF analysiert, um seine Masse mit höherer Genauigkeit zu bestimmen. Darüber hinaus erzeugt MALDI-Ionen, die weniger Gebühren als ESI und damit den Erwerb und die Interpretation der MALDI-Daten einfacher. Dies ermöglicht es den Studierenden, die in der Strukturbiologie ihre rekombinante Proteine ​​nur nach einem kurzen Training zu analysieren. Zwei wesentliche Faktoren beeinflussen die Qualität der MALDI-Spektren: die Matrix und die Technik für die Abscheidung der Matrix (zB Tröpfchen getrocknet und 8 dünne Schicht 12-16,17,18) verwendet. Eine einzelne organische Matrix [zB Sinapinsäure (SA) 19-21 oder α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure (α-CHCA) 14,22,23] wird oft für die MS Untersuchung von intakten Proteinen und vernetzte Proteinkomplexen . Mit α-CHCA, Chait Gruppe zuvor einen detaillierten Protokoll für preparing eine ultradünne Schicht vor der MALDI-Analyse von löslichen und Membranproteine ​​14,15. Kürzlich Gorka et al. Illustriert die Graphitbasis Zielbeschichtungs die MALDI-Analyse von Peptiden und Proteinen unter Verwendung von α-CHCA als Matrix 24 zu verbessern. Hier stellen wir ein einfaches Protokoll für die Analyse von intakten Proteinen durch MALDI-TOF-MS unter Verwendung einer Mischung von zwei Matrizen: 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) und α-CHCA 25. Wir systematisch bewertet die Leistung des DHB-CHCA Mischung im Vergleich zu den SA-und α-CHCA Matrizen für die Steuerung von intakten Proteinen. Die Matrix-Gemisch ermöglicht eine bessere Auflösung (dh die Protein-Gipfel sind viel schärfer). Darüber hinaus ist die Präsenz der intensiven mehrere Ladungen Ionen (dh M +2 H 2 +, M 3 H 3 +, etc.) ermöglicht eine genaue Massenbestimmung, weil die Auflösung von axialen MALDI-TOF-Instrumente ist höher bei niedrigeren Massen über Gebühr (m / z) 26. Dies ist besonders nützlich für die Bestimmung des Molekulargewichts von Proteinen, die größer als 100 kDa. Höhere Empfindlichkeit wird auch mit dem DHB-CHCA Gemisch (0,5 pmol Protein auf einem MALDI-Target) erreicht. Wie oben erwähnt, ist ein wichtiger Faktor, der bei der Verwendung von MALDI-Instrument betrachtet werden, falls der Matrixablagerung. Laugesen et al. Vorgeschlagen, die Verwendung von DHB-CHCA Gemisch zum ersten Mal 25 unter Verwendung des getrockneten Niederschlag von Tröpfchen. Wir beobachteten jedoch bessere Ergebnisse (z. B. viel höhere Empfindlichkeit) verwendet, wenn wir das Dünnschichtverfahren, wo die erste Schicht von der α-CHCA in Aceton gelöst ist. Das Dünnschichtverfahren 12,27 impliziert die Bildung eines homogenen Substrat der Matrix-Kristalle auf das MALDI-Target, das in einem Video Jupiter zuvor 15 beschrieben wurde. Dann wird die Probe auf diesem Substrat abgeschieden wird, und schließlichzusätzliche Matrix abgeschieden (siehe unten). In diesem Artikel werden wir auch zeigen, wie die Probe auf das MALDI-Target hinterlegen, sondern auch, wie man das Ziel 15 zu reinigen, umzukristallisieren, und bereiten die Matrizen. Zum Schluss wollen wir alle notwendigen Informationen für die Analyse intakter Proteine ​​an Wissenschaftler (insbesondere Strukturbiologen), die die Qualität der produzierten Proteine ​​auf eine schnelle und einfache Art und Weise zu bewerten, die brauchen und bieten nicht so vertraut mit MALDI-TOF-MS. Wie in Mitte der 1990er Jahre 28 vorhergesagt hat MS eine erhöhte Auswirkungen auf die biologische Forschung hatte, wie die Erreichbarkeit für Biologen hat sich erhöht. Wir hoffen, dass die Informationen, die wir zur Verfügung gestellt wird nützlich MALDI-TOF zugänglich Biologen und Wissenschaftler, die gerne starten mit Hilfe der Massenspektrometrie zu machen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Trizma Hydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Trizima</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin 6 Chromatographie-Säulen</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6221</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 500</td><td>Sartorius</td><td>VS0122</td><td>verschiedene Molekulargewichte abgeschnitten</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fluka</td><td>14262</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fluka</td><td>02860</td><td></td></tr><tr><td>KIMTECH SCIENCE Präzisionstücher Tissuewischer</td><td>Kimberly Clark</td><td>05511</td><td></td></tr><tr><td>&#945;-Cyano-4-hydroxyzimtsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>2,5-Dihydroxybenzoesäure</td><td>Fluka</td><td>39319</td><td></td></tr><tr><td>GELoader Tips</td><td>Eppendorf</td><td>0030 001.222</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Fluka</td><td>09676</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Protein Standard II</td><td>Bruker Daltonics</td><td>207234</td><td>Es enthält Trypsinogen, Protein A, Serum Albumin-Rinder-Immunglobulin </td></tr><tr><td>G</td><td>ABSciex</td><td>GEN602151</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT </td></tr><tr><td>Wasseraufbereiter PURELAB Ultra Analytic</td><td>ELGA LabWater</td><td>89204-052</td><td></td></tr><tr><td>Autoflex MALDI-TOF Instrument</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF Ziel</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

matrix-assistierte laser desorptions / ionisations-flugzeit (maldi-tof)-massenspektrometrie-analyse von intakten proteinen mit mehr als 100 kda

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Effektiv Bestimmung Massen von Proteinen ist entscheidend für viele biologische Studien (zB für Strukturbiologie Untersuchungen). Genaue Massenbestimmung erlaubt, die Richtigkeit der Proteinprimärsequenzen zu bewerten, die Anwesenheit von Mutationen und / oder post-translationale Modifikationen, die mögliche Proteinabbau, die Probenhomogenität, und das Ausmaß der Isotopen Einbau in Falle der Markierung (z. B. 13 C-Markierung ). Elektrospray-Ionisations (ESI)-Massenspektrometrie (MS) ist weit verbreitet für die Massenbestimmung von denaturierten Proteinen verwendet, aber ihre Wirksamkeit ist von der Zusammensetzung des Probenpuffers beeinflusst. Insbesondere untergräbt die Anwesenheit von Salzen, Detergenzien und Verunreinigungen die Wirksamkeit der Proteinanalyse durch ESI-MS. Matrix-unterstützte Laserdesorption / Ionisation (MALDI) MS ist eine attraktive Alternative, aufgrund seiner Salztoleranz und der Einfachheit der Erfassung und Interpretationtion. Darüber hinaus ist der Massenbestimmung von großen heterogenen Proteinen (größer als 100 kDa) einfacher durch MALDI-MS aufgrund der Abwesenheit von überlappenden hohen Ladezustand Verteilungen in ESI-Spektren vorhanden sind. Hier präsentieren wir Ihnen eine zugängliche Ansatz für die Analyse von Proteinen, die größer als 100 kDa durch MALDI-Flugzeit-(TOF). Wir veranschaulichen die Vorteile der Verwendung einer Mischung von zwei Matrizen (dh 2,5-Dihydroxybenzoesäure und α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure) und die Nützlichkeit der Dünnschicht Verfahren Ansatz zur Probenablagerung. Wir diskutieren auch die kritische Rolle der Matrix und Lösungsmittelreinheit, die für die Kalibrierung verwendeten Standards, der Laserenergie und der Erfassungszeit. Insgesamt bieten wir Ihnen notwendigen Informationen, um einen Neuling für die Analyse intakter Proteine ​​größer als 100 kDa durch MALDI-MS.

Wir untersuchten eine intakte Protein (Chromosomenregion Wartungs 1-Protein, Crm1, Molekulargewicht: 123386 Da) mit zwei unterschiedlichen Matrizen zwei Abscheidungsverfahren, und die gleiche Laserintensität (Abbildung 1). SA und CHCA_DHB Mischung wurden als Matrizen verwendet. Die Mischung ergab Massenspektren von hoher Qualität in Bezug auf Signal-Rausch-Verhältnis und die Empfindlichkeit (Fig. 1A und B). Insbesondere könnte man 0,5 pMol Protein auf das MALDI-Target (Fig. 1C) abgeschieden erfassen. Die gleiche Menge an Protein wurde unter Verwendung von SA kaum nachweisbar (Fig. 1D). Darüber hinaus mit der Matrizen-Mischung, war die Methode der Wahl für die Matrixablagerung der &quot;dünne Schicht&quot;-Ansatz (Abbildung 1A). Mit Hilfe der &quot;Dried Droplet&quot;-Methode, haben wir nicht jedes Protein mit einer Masse von mehr als 100 kDa (Daten nicht gezeigt) zu erkennen. Verwendung der Mischung CHCA_DHB (1A und 1C), mehrfach geladene Ionen des Protein beobachtet, so dass die Massenbestimmung mit höherer Genauigkeit, da die Peak-Auflösung in axialer MALDI-TOF-Instrumenten ist umgekehrt proportional zum m / z 26. Wir analysierten auch monomeren beta-Galactosidase (116.300 Da) (Abbildung 2). Die CHCA_DHB Spektren waren besser als die SA-Spektren in Bezug auf Empfindlichkeit und Auflösung. Darüber hinaus erlaubt das Vorhandensein von mehrfach geladenen Ionen (M 2 +, M 3 + und M 4 +) uns die Masse des Proteins mit einer höheren Genauigkeit (2A und 2C) zu bestätigen. Mit der dünnen Schicht Ansatz, verglichen wir die Performance des CHCA_DHB Mischung, SA und allein α-CHCA für die Analyse von einem Immunglobulin IgG (148.500 Da) (Abbildung 3). Wenn wir die verschiedenen Daten korrelieren, waren Proteinsignale höher und mit besserer Auflösung in der CHCA_DHB Spektren. Abschließend ist die Verwendung der Mischung CHCA_DHB und der Dünnschicht-Abscheidungsverfahren<html> zeigte signifikante Verbesserungen in der Qualität der großen mit einem MALDI-TOF-Instrument erworben intakte Protein-Massenspektren. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. MALDI-TOF-Analyse des intakten Chromosomenregion Wartungs 1 Protein (Crm1), Molekulargewicht: 123386 Da. . A) 1 pmol Crm1 wurde mit der DHB_CHCA Mix als Matrix B) analysiert Menge: 1 pmol; Matrix:. SA C) Höhe: 0,5 pmol; Matrix:. DHB_CHCA D) Höhe: 0,5 pmol; Matrix: SA. Das Signal der Peaks, ausgedrückt in einer beliebigen Einheit Intensität Skala ist normiert auf die in jedem Spektrum maximalen Barwert. pg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50635/50635fig2.jpg &quot;/&gt; 2. MALDI-TOF-Analyse von intakten beta-Galactosidase (116.300 Da). A) Betrag: 20 pmol; Matrix DHB_CHCA B) Betrag:. Pmol 20; Matrix:. SA C) Betrag: 5 pmol; Matrix:. DHB_CHCA D) Betrag: 5 pmol; Matrix: SA. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3.jpg" /> 3. MALDI-TOF-Analyse einer intakten Immunglobulin IgG (148.500 Da), Menge:. 1,7 pmol mit der Mischung CHCA_DHB Die Spektren erhalten wurden, waren viel intensiver (maximal: 8200 willkürliche Einheit, au) als die SA-Spektren (maximal 1.200 au) und α-CHCA Spektren (maximal: 4500 au)

Genaue Massenmessung stellt einen wichtigen Schritt bei der Untersuchung von Proteinen. Matrix-unterstützte Laserdesorption / Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie (MS) für eine solche Bestimmung verwendet werden, und deren wesentliche Vorteil ist die Toleranz zu Salzen, Detergenzien und Verunreinigungen. Hier veranschaulichen wir eine zugängliche Ansatz für die Analyse von Proteinen, die größer als 100 kDa durch MALDI-MS.

Matrix-assistierte Laser Desorptions / Ionisations-Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie-Analyse von intakten Proteinen mit mehr als 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, intakte Proteine, die größer als 100 Kilodalton sind, empfindlich mittels MALDI-Massenspektrometrie zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Matrixlösungen vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Dünnschichtlösung auf das Target aufzutragen. Anschließend werden die Probe und das Matrixgemisch auf das Target aufgetragen. Im letzten Schritt werden die Probenflecken unter dem Mikroskop betrachtet. Abschließend erfolgt die Analyse intakter Proteine und die Aufnahme von Massenspektren mithilfe eines Massenspektrometers.Der Hauptvorteil der MALDI-Massenspektrometrie gegenüber anderen analytischen Verfahren wie der Elektrospray-Ionisation besteht darin, dass sie toleranter gegenüber Salzen, Verunreinigungen und Detergenzien ist. Ein weiterer Vorteil der MALDI-Methode ist, dass sie Ionen mit geringerer Ladungszahl im Vergleich zur Elektrospray-Ionisation erzeugt. Daher ist das Erfassen und Interpretieren von MALDI-Daten äußerst unkompliziert.Um die Umkristallisation zu beginnen, geben Sie 10 Milliliter 40%iges Ethanol in eine Pyrex-Schale. Dann geben Sie 600 Milligramm einer Matrix unter Verwendung eines Wasserbades und einer Heizpatrone hinzu. Erwärmen Sie die Matrixlösung und rühren Sie, bis die Matrix vollständig gelöst ist.Wiederholen Sie die vorherigen Schritte, bis die Lösung gesättigt ist. Lassen Sie die Lösung mehrere Stunden lang langsam bei Raumtemperatur abkühlen und lagern Sie sie anschließend über Nacht bei vier Grad Celsius. Wenn sich keine Kristalle bilden, kratzen Sie die Innenwand des Bechers knapp unterhalb der Lösungsoberfläche mit einem Glasstab an, um die Kristallisation einzuleiten.Entnehmen Sie abschließend die Matrixkristalle durch Filtration. Spülen Sie die restlichen Kristalle im Kolben mit einer minimalen Menge eiskaltem Lösungsmittel nach und filtrieren Sie sie. Sobald die Filtration abgeschlossen ist, lassen Sie die Kristalle trocknen, um die MALDI-Trägerplatte zu reinigen.Spülen Sie es mit Methanol und wischen Sie es vorsichtig mit einem Kim-Tuch ab. Anschließend spülen Sie es mit Wasser und wischen es erneut mit einem Kim-Tuch ab. Setzen Sie das MALDI-Target in einen 600-Milliliter-Becher ein und bedecken Sie es mit 50 % Ethanol.Als Nächstes wird das Target 10 Minuten lang in einer Ultraschallbadlösung aus Ethanol sonifiziert. Falls Rückstände auf der Platte verbleiben, wiederholen Sie die vorherigen Schritte. Spülen Sie das Target mit Methanol oder Wasser ab; das verwendete Lösungsmittel bestimmt, inwieweit sich die Probe ausbreitet.Neigen Sie danach das Target, sodass die gesamte Flüssigkeit auf einem Kim-Tuch gesammelt wird. Trocknen Sie das Target mit einem Stickstoffgasstrom. Lösen Sie im nächsten Schritt alpha-CHCA in Aceton auf.Um eine gesättigte Lösung herzustellen, tauchen Sie die Spitze einer 10-Mikroliter-Pipette in die gesättigte alpha-CHCA-Lösung, sodass eine kleine Menge der Lösung in die Spitze eindringt. Berühren Sie das MALDI-Target schnell mit der Pipettenspitze, um die alpha-CHCA-Lösung auf dem MALDI-Target abzugeben, wobei ein 1,5-Milliliter-Kunststoffröhrchen verwendet wird. Bereiten Sie eine 20-Milligramm-pro-Milliliter-alpha-CHCA-Lösung zu, indem Sie alpha-CHCA in einem Volumenverhältnis von sieben zu drei aus Acetonitril zu 5 %iger Ameisensäure auflösen, und kennzeichnen Sie die Lösung als alpha-CHCA-Lösung.Bereiten Sie anschließend eine 20 Milligramm pro Milliliter DHB-Lösung vor, indem Sie DHB in einem Volumenverhältnis von sieben zu drei aus Acetonitril zu 0,1 % Trifluoressigsäure auflösen und die Lösung als DHB-Lösung kennzeichnen. Mischen Sie die alpha-CHCA-Lösung und die DHB-Lösung im Volumenverhältnis eins zu eins. Um die C-H-C-A-D-H-B-Lösung zu erhalten, kann vor Beginn dieses Verfahrens optional ein Reinigungsschritt der Proteinproben mittels Pufferaustausch gemäß der angegebenen Referenz durchgeführt werden.Alternativ eine nicht gereinigte Proteinprobe auf dem MALDI-Target abgeben. Danach 0,5 Mikroliter der Proteinprobe auf die vorbereitete dünne Schicht aus Alpha-CHCA abgeben. Unmittelbar danach 0,5 Mikroliter der C-H-C-A-D-H-B-Lösung hinzufügen.Tragen Sie 0,5 Mikroliter der Cain-Standardlösung auf die MALDI-Platte auf und geben Sie anschließend 0,5 Mikroliter der Matrixlösung hinzu. Nach dem Trocknen der Proben und des Cains können Sie die Flecken unter dem Mikroskop beobachten, das Target in das Instrument einsetzen und die geeignete Instrumenteneinstellung auswählen. Danach wählen Sie den geeigneten Massen-zu-Ladung-Verhältnis-Bereich aus.Erwerben Sie die Spektren des Ca und kalibrieren Sie das Instrument mit der geeigneten Laserintensität. Erwerben Sie die Spektren der Proteinproben. Die MALDI-TOFF-Analyse des intakten Chromosomenbereichs zur Wartung eines Proteins wird hier gezeigt.Die C-H-C-A-D-H-B-Mischung ergab Massenspektren von höherer Qualität hinsichtlich Signal-Rausch-Verhältnis und Empfindlichkeit. Insbesondere konnten 0,5 Pikomol Protein, die auf das MALDI-Target aufgetragen wurden, detektiert werden, während dieselbe Menge Protein mit SINO NIC-Säure kaum nachweisbar war. Unter Verwendung der C-H-C-A-D-H-B-Mischung wurden mehrfach geladene Ionen des Proteins beobachtet, wodurch die Massenbestimmung mit höherer Genauigkeit ermöglicht wurde, da die Peakauflösung umgekehrt proportional zum Ladungs-Masse-Verhältnis im Fall eines axialen Multi-Tof-Instruments ist. Darüber hinaus war unsere Methode der Wahl zur Matrixauftragung bei Verwendung der C-H-C-A-D-H-B-Mischung die Dünnschichtmethode.Mithilfe der Trockentropfen-Methode wurden Proteine mit einer Masse über 100 Kilodalton nicht nachgewiesen. Das monomere Beta-Collectaase-Protein wurde ebenfalls mittels Multi-TOF analysiert. Die C-H-C-A-D-H-B-Spektren waren hinsichtlich Empfindlichkeit und Auflösung besser als die SINO-NIC-Säure-Spektren.Außerdem ermöglichte das Vorhandensein mehrfach geladener Ionen die Bestätigung der Proteinmasse mit höherer Genauigkeit. Hier wird die MALDI-Analyse eines intakten Immunglobulins gezeigt. Die mit der C-H-C-A-D-H-B-Mischung erhaltenen Spektren waren deutlich intensiver als die SA- und alpha-CHCA-Spektren.Genauer gesagt waren die Proteinsignale in den C-H-C-A-D-H-B-Spektren intensiver und wiesen eine bessere Auflösung auf. Die Verwendung der C-H-C-A-D-H-B-Mischung und die Methode der dünnen Schichtabscheidung zeigten deutliche Verbesserungen in der Qualität großer intakter Proteine. Massenspektren wurden mittels eines MALDI-Instruments aufgenommen.Das vorgestellte Protokoll erläutert, wie hochwertige Massenspektren von Proteinen mit hohem Molekulargewicht mithilfe einer Vielzahl von Instrumenten erworben werden. Bei der Durchführung dieser Art von Analyse sind drei Dinge wichtig. Erstens, eine frisch zubereitete Matrixlösung verwenden.Zweitens, um Ihre Probe korrekt auf dem Mali-Target abzulegen. Und drittens, um die geeigneten instrumentellen Einstellungen wie die Laserintensität zu verwenden.

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Forschung

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Matrix-assistierte Laser Desorptions / Ionisations-Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie-Analyse von intakten Proteinen mit mehr als 100 kDa

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