Matrix-assistierte Laser Desorptions / Ionisations-Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie-Analyse von intakten Proteinen mit mehr als 100 kDa

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, intakte Proteine mit einem Gewicht von mehr als 100 Kilodalton mittels maldi-Massenspektrometrie empfindlich zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Matrixlösungen vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Dünnschichtlösung auf das Ziel aufzutragen.

Als nächstes werden die Probe und die Mischung der Matrizen auf dem Target abgeschieden. Der letzte Schritt besteht darin, die Probenflecken unter dem Mikroskop zu beobachten. Letztlich wird ein Multi- bis Massenspektrometer eingesetzt, um intakte Proteine zu analysieren und Massenspektren aufzuzeichnen.

Der Hauptvorteil der maldi-Massenspektrometrie gegenüber anderen analytischen Ansätzen, wie z. B. der Elektrospray-Ionisation, besteht darin, dass sie toleranter gegenüber Salz, Verunreinigungen und Reinigungsmitteln ist. Ein weiterer Vorteil von Maldi ist, dass es im Vergleich zu Elektrospray Ionen erzeugt, die weniger Ladungen tragen. Daher ist das Erfassen und Interpretieren von MDI-Daten recht einfach.

Um die Rech-Kristallisation zu starten, gießen Sie 10 Milliliter 40%iges Ethanol in ein Pyrex que. Dann bei 600 Milligramm einer Matrix mit einem Wasserbad und einer Widerstandsheizung. Erwärmen Sie die Matrizenlösung und rühren Sie sie, bis sich die Matrize vollständig aufgelöst hat.

Wiederholen Sie die vorherigen Schritte, bis die Lösung gesättigt ist. Lassen Sie die Lösung mehrere Stunden lang langsam bei Raumtemperatur abkühlen und lagern Sie sie dann über Nacht bei vier Grad Celsius. Wenn sich keine Kristalle bilden, zerkratzen Sie das Innere des Becherglases direkt unter der Lösungsoberfläche mit einem Glasstab, um die Kristallisation zu induzieren.

Zum Schluss werden die Matrixkristalle durch Filtration gesammelt. Die Restkristalle werden im Kolben mit einer minimalen Menge eiskaltem Lösungsmittel gespült und filtriert. Sobald die Filtration abgeschlossen ist, lassen Sie die Kristalle trocknen, um die maldi Zielplatte zu reinigen.

Spülen Sie es mit Methanol ab und wischen Sie es vorsichtig mit einem Kim-Tuch ab. Spülen Sie es dann mit Wasser ab und wischen Sie es mit einem Kim-Tuch ab. Geben Sie das Maldi-Target in ein 600-Milliliter-Becherglas und bedecken Sie es mit 50 % Ethanol.

Als nächstes beschallen Sie das Target in der Ethanollösung 10 Minuten lang in einem Ultraschallbad. Wenn noch Rückstände auf der Platte vorhanden sind, wiederholen Sie die vorherigen Schritte. Spülen Sie das Ziel mit Methanol oder Wasser, das verwendete Lösungsmittel bestimmt, wie stark sich die Probe ausbreitet.

Kippen Sie dann das Ziel, so dass die gesamte Flüssigkeit auf einem Kim-Tuch gesammelt wird. Trocknen Sie das Ziel mit einem Stickstoffgasstrom. Im nächsten Schritt lösen Sie alpha CHCA in Aceton auf.

Um eine gesättigte Lösung herzustellen, tauchen Sie eine 10-Mikroliter-Pipettenspitze in die gesättigte Alpha-CHCA-Lösung, so dass eine kleine Menge der Lösung in die Spitze fließt. Berühren Sie das maldi-Ziel schnell mit der Pipettenspitze, um die alpha-CHCA-Lösung mit einem 1,5-Milliliter-Kunststoffröhrchen auf das maldi-Ziel aufzutragen. Bereiten Sie eine Alpha-CHCA-Lösung von 20 Milligramm pro Milliliter her, indem Sie Alpha-CHCA in einem Verhältnis von sieben zu drei Volumen von Acetonitril zu 5 % Ameisensäure auflösen, wobei die Lösung als Alpha-CHCA-Lösung gekennzeichnet ist.

Bereiten Sie anschließend eine DHB-Lösung von 20 Milligramm pro Milliliter her, indem Sie DHB in einem Verhältnis von sieben bis drei Volumen von Acetylnitril zu 0,1 % Trifluoressigsäure auflösen, die als DHB-Lösung gekennzeichnet ist. Mischen Sie die alpha CHCA-Lösung und die DHB-Lösung in einem Volumenverhältnis von eins zu eins. Um die C-H-C-A-D-H-B-Lösung vor Beginn dieses Verfahrens zu erhalten, besteht ein optionaler Schritt darin, die Proteinproben durch Pufferaustausch zu reinigen, wie in der aufgeführten Referenz gezeigt.

Andernfalls wird eine ungereinigte Proteinprobe auf dem MALDI-Target abgelegt. Als nächstes scheiden 0,5 Mikroliter der Proteinprobe auf die vorbereitete alpha CHCA Dünnschicht ab. Unmittelbar danach fügen Sie 0,5 Mikroliter der C-H-C-A-D-H-B-Lösung hinzu.

Scheiden Sie 0,5 Mikroliter des Cain-Standards auf die MALDI-Platte und fügen Sie dann 0,5 Mikroliter der Matrixlösung hinzu. Sobald die Proben und das Kain getrocknet sind, können Sie die Flecken unter einem Mikroskop beobachten, das Ziel in das Instrument einsetzen und das geeignete Instrumentensetup auswählen. Wählen Sie dann den geeigneten Bereich des Masse-Ladungs-Verhältnisses.

Erfassen Sie die Spektren der ca und kalibrieren Sie das Instrument mit der entsprechenden Laserintensität. Erfassen Sie die Spektren der Proteinproben. MALDI toff-Analyse der intakten Chromosomenregion Erhaltung eines Proteins ist hier zu sehen.

Das C-H-C-A-D-H-B-Gemisch ergab Massenspektren von höherer Qualität in Bezug auf Signal-Rausch-Verhältnis und Empfindlichkeit. Insbesondere konnten 0,5 Pikosolen Protein, die auf dem MALDI-Ziel abgelagert waren, nachgewiesen werden, während die gleiche Menge an Protein kaum nachweisbar war. Unter Verwendung von SINO-NIC-Säure unter Verwendung des C-H-C-A-D-H-B-Gemisches wurden mehrfach geladene Ionen des Proteins beobachtet, was die Massenbestimmung mit höherer Genauigkeit ermöglicht, da die Peakauflösung im Falle eines axialen Multi-Toff-Instruments umgekehrt proportional zum Hauptladungsverhältnis ist. Darüber hinaus war die Methode der Wahl für die Matrixabscheidung unter Verwendung des C-H-C-A-D-H-B-Gemisches der Dünnschichtansatz.

Mit der Methode der getrockneten Tröpfchen wurden Proteine mit einer Masse von mehr als 100 Kilodalton nicht nachgewiesen. Das monomere beta collect aase Protein wurde ebenfalls mit multi TOF analysiert. Die C-H-C-A-D-H-B-Spektren waren in Bezug auf Empfindlichkeit und Auflösung besser als die SINO NIC-Säurespektren.

Darüber hinaus ermöglichte das Vorhandensein von mehrfach geladenen Ionen die Bestätigung der Masse des Proteins mit höherer Genauigkeit. Hier ist MALDI zur Analyse eines intakten Immunglobulins dargestellt. Die Spektren, die mit dem C-H-C-A-D-H-B-Gemisch erhalten wurden, waren viel intensiver als die SA- und alpha-CHCA-Spektren.

Genauer gesagt waren die Proteinsignale höher und hatten eine bessere Auflösung in den C-H-C-A-D-H-B-Spektren. Die Verwendung des C-H-C-A-D-H-B-Gemisches und der Dünnschichtabscheidungsmethode zeigten signifikante Verbesserungen in der Qualität großer intakter Proteine. Massenspektren, die mit einem MALDI-Instrument erfasst wurden.

Das vorgestellte Protokoll zeigt, wie hochwertige Massenspektren von Proteinen mit hohem Molekulargewicht mit Hilfe eines Multi-Instruments erfasst werden können. Bei der Durchführung dieser Art von Analyse sind drei Dinge wichtig. Erstens, um eine frisch vorbereitete Metriklösung zu verwenden.

Zweitens, um Ihre Probe ordnungsgemäß auf dem Ziel Mali zu deponieren. Und drittens, die geeignete instrumentelle Einstellung wie die Laserintensität zu verwenden.