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Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine genetische Analyse von Chlamydia trachomatis durchzuführen, indem eine chemische Mutagenese durchgeführt und Genotyp-Phänotyp-Assoziationen bestimmt werden. Dies wird erreicht, indem zunächst mittels chemischer Mutagenese Chlamydia trachomatis-Mutantenstämme erzeugt werden. Anschließend werden alle durch die Chemikalie erzeugten Mutationen mittels Ganzgenom-Sequenzierung identifiziert, gefolgt von einer referenzgeführten Genom-Assembly.

Dann werden Phänotyp-Genotyp-Assoziationen in den Mutantenstämmen identifiziert. Abschließend werden die Phänotyp-Genotyp-Assoziationen durch die Erzeugung rekombinanter Stämme und deren Analyse bestätigt. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass eine Mutation in einem bestimmten Chlamydia-Gen zu einem Phänotyp von Interesse führt, und zwar durch eine Kombination klassischer chemischer Mutagenese-Methoden und der Next-Generation-Singh.

Derzeit stehen keine Methoden für den Genaustausch bei Chlamydia zur Verfügung, und die molekulargenetischen Werkzeuge zu deren Untersuchung befinden sich noch in einem frühen Entwicklungsstadium. Diese Methode erfordert weder die Transformation mit rekombinanter DNA noch die Entwicklung molekulargenetischer Werkzeuge, erreicht aber dennoch dasselbe Ziel, nämlich die Zuweisung von Funktionen zu einzelnen Genprodukten.

Um kultivierte Zellen vorzubereiten, säen Sie etwa 1 × 10⁶ Zellen pro 25 cm² in drei Milliliter DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, und inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid. Wenn die Zellen etwa 24 Stunden später konfluent sind, saugen Sie das Medium ab und infizieren die Zellen mit Chlamydia bei einer Multiplizität der Infektion von fünf. In einem Gesamtvolumen von drei Milliliter DMEM-FBS, das 200 Nanogramm pro Milliliter Cycloheximid enthält, beginnen Sie die Mutagenese 18 Stunden nach der Infektion. Unter einer chemischen Absaughaube bereiten Sie 20 Milligramm pro Milliliter Ethylmethansulfonat (EMS) in PBS mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid vor.

EMS ist ein starkes Mutagen und Karzinogen. Daher ist die Entsorgung gemäß dem schriftlichen Protokoll durchzuführen. Das Medium von den Vero-Zellen abpipettieren und die Zellen einmal mit drei Milliliter PBS mit Magnesiumchlorid und Calciumchlorid waschen.

Danach 3 mL EMS-Lösung zugeben und eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Abzug inkubieren. Nach der Inkubation die EMS-Lösung entfernen und in einen Behälter mit einer molaren Natriumhydroxidlösung geben, um das Mutagen zu inaktivieren, bevor die Zellen dreimal gewaschen werden, um restliche EMS-Rückstände zu entfernen. Danach 6 mL DMEM mit 10 % FBS, 200 Nanogramm pro Milliliter Cycloheximid und 25 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin zugeben und 48 bis 72 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren.

Inklusionen erscheinen etwa 36 Stunden nach der Mutagenese bei 72 Stunden frei von Bakterien. Etwa 10 % der Inklusionen sind mit Bakterien gefüllt, während der Rest leer bleibt, um elementare Körper oder EBS durch hypotone Lyse zu gewinnen. Saugen Sie das Medium vollständig ab. Geben Sie ein Milliliter Wasser hinzu und schwenken Sie 10 Minuten lang, um die Zellen zu lösen. Lyse die Zellen, indem Sie mindestens 10-mal auf- und abpipettieren.

Nachdem das Lysat in einem Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt wurde, 0,25 Milliliter Fünf-mal-Sucrose-Phosphat-Glutamat-Puffer oder SPG hinzufügen, um eine Endkonzentration von ein mal zu erreichen, und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Stellen Sie konfluente Monolagen von Ves-Zellen in Sechswell-Platten her, indem Sie etwa 0,4 mal 10 der sechs Zellen pro Vertiefung in drei Milliliter DMEM mit 10 % FBS ansäen, und lassen Sie die Zellen innerhalb der nächsten 24 Stunden eine homogene Monolage bilden. Danach auf Eis legen, eine Stammlösung des Mutagens Chlamydia.

Danach sechs Reihenverdünnungsansätze in Zehnerschritten vorbereiten, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern pro Verdünnung in DMEM mit 10 % FBS, und auf Eis stellen. Die Vero-Zellen zweimal mit je drei Milliliter PBS pro Loch waschen. Danach je drei Milliliter DMEM pro Loch in sechs-Loch-Platten sowie 100 Mikroliter der bakteriellen Verdünnung im Duplikat hinzufügen.

Die Platte vorsichtig schwenken, um eine gleichmäßige Mischung zu gewährleisten. Die infizierten Platten bei 2.700 ×g 30 Minuten lang bei 15 °C zentrifugieren. Anschließend in einem feuchten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 °C eine bis zwei Stunden inkubieren.

Bereiten Sie in der Zwischenzeit 0,54 % AROS in DMEM vor, indem Sie zunächst die folgenden Zutaten kombinieren und vermischen. Mischen Sie anschließend 18,9 Milliliter heißen sterilen 1,2 % AROS in Wasser unter Rühren ein, um Klumpen zu vermeiden. Halten Sie die Mischung in einem Wasserbad bei 55 Grad Celsius warm.

Die bakterielle Suspension von den Petrischalen abpipettieren und sechs Milliliter der warmen Aro-Lösung hinzufügen. Vollständiges Erstarren bei Raumtemperatur außerhalb des Sicherheitswerkschranks abwarten. Danach im Biosicherheitswerkschrank bei entfernten Deckeln die Platten weitere 15 Minuten trocknen lassen. Sobald die Platten getrocknet sind, sie sieben bis zehn Tage lang bei 37 °C in einem Kohlendioxid-Inkubator inkubieren.

Plaques sollten mithilfe eines Stereomikroskops einen Tag vor der Isolierung von Mutanten sichtbar sein. Geben Sie zehn hoch vier Nullzellen in 100 Mikrolitern pro Vertiefung. In einer 96-Loch-Platte werden die Zellen innerhalb von 24 Stunden konfluent sein.

Markieren Sie unter einem Stereomikroskop die auszuwählenden Plaques und verwenden Sie dann eine sterile Ein-Milliliter-Barrierenpipette, um Plugs der Plaques zu entnehmen. Resuspendieren Sie die Plaques in 100 Mikrolitern DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, 400 Nanogramm pro Milliliter Cycloheximid und 50 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin, um die Mutantenstämme zu vermehren. Überlagern Sie die Suspension mit konfluenten Monolagen von Vero-Zellen.

Zentrifugieren Sie die Platten bei 2.700 GS und 15 Grad Celsius für 30 Minuten, bevor Sie die Ernte von dbs inkubieren, wenn mehr als 50 % der Zellen infiziert sind, was bereits 48 Stunden nach der Infektion oder bis zu 14 Tage später eintreten kann. Diese Menge infizierter Zellen ermöglicht es, ausreichend lebensfähige Bakterien zur Lagerung zu erhalten, um EVs durch hypotonische Lyse der infizierten Zellen zu extrahieren. Nach dem Absaugen des Mediums geben Sie 160 Mikroliter sterilem Wasser hinzu und inkubieren bei Raumtemperatur für 10 Minuten.

Verwenden Sie Barrierespitzen, um die Zellen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren zu lysieren, um eine vollständige Zellaufschließung sicherzustellen. Überführen Sie abschließend 160 Mikroliter jedes Lysats in Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 40 Mikroliter 5×SPG hinzu und lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis sie für die Assaydurchführung und die Untersuchung von Mutanten auf interessierende Phänotypen bereit sind.

Die Exposition gegenüber einem Mutagen führt zu Einschlüssen, die vermutlich aufgrund des Absterbens der Bakterienzellen frei von Bakterien erscheinen. Typischerweise wird der Serovar LGVL zwei innerhalb von 48 Stunden nach der Infektion infizierte Zellen vollständig lysieren, doch die Behandlung mit Mutagenen kann diesen Zyklus auf über 90 Stunden verlängern, wobei in unseren Experimenten etwa 10 % der Einschlüsse eine Erholung zeigen. Infizierte Vero-Zellen, die mit 20 Milligramm pro Milliliter EMS behandelt wurden, wiesen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen eine um 99 % verminderte Wiederfindungsrate infektiöser Nachkommen auf, wie in dieser Abbildung dargestellt.

Die Mutagenbehandlung führte ebenfalls zur Bildung von Plaques mit veränderten Morphologien, einschließlich kleiner Plaques. Zu anderen Morphologien gehören Plaques, die körnig, klumpig oder wabenförmig erscheinen, wie hier gezeigt. Die in diesen Studien verwendeten Dosen von EMS können experimentell durch NGS bewertet zu drei bis 30 Mutationen pro KCL-Genom führen.

Obwohl gradientenreinigte EBS weitgehend frei von Wirtszellmaterial sind, wird ebenfalls Wirts-DNA nachgewiesen, die nach dieser Prozedur etwa 10 bis 15 % der genomischen Präparationen ausmacht. Untersuchungen auf Phänotypen wie beeinträchtigte Replikation in Zellkulturzellen, Verlust biochemischer Aktivitäten oder veränderte bakterielle Morphologien können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise welche bakteriellen Faktoren für die Bildung und Aufrechterhaltung von Chlamydien, pathogenen Faktoren, erforderlich sind.