Vorwärts Genetische Ansätze in Chlamydia trachomatis

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine genetische Analyse von Chlamydia tritus durchzuführen, indem eine chemische Mutagenese durchgeführt und Genotyp-Phänotyp-Assoziationen bestimmt werden. Dies wird erreicht, indem zunächst Chlamydien-tracom-Mutantenstämme mittels chemischer Mutagenese erzeugt werden. Als nächstes werden alle chemisch erzeugten Mutationen durch Ganzgenomsequenzierung identifiziert, gefolgt von einer referenzgesteuerten Genomassemblierung.

Dann werden Phänotyp-Genotyp-Assoziationen in den mutierten Stämmen identifiziert. Schließlich werden die Phänotyp-Genotyp-Assoziationen bestätigt, indem rekombinante Stämme generiert und analysiert werden. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass eine Mutation in einem bestimmten Chlamydien-Gen durch eine Kombination aus klassischen chemischen Mutagenese-Ansätzen und Singh der nächsten Generation zu einem Phänotyp von Interesse führt.

Derzeit gibt es keine Methoden für den Genersatz bei Chlamydien, und molekulargenetische Werkzeuge für seine Untersuchung stecken noch in den Kinderschuhen. Diese Methode erfordert keine Transformation mit rekombinanter DNA oder die Entwicklung molekulargenetischer Werkzeuge, erreicht aber das gleiche Ziel. Das ist eine Zuweisung von Funktion an einzelne Genprodukte.

Zur Herstellung der kultivierten Zellen werden etwa einmal 10 der sechs vir-Zellen pro 25 Zentimeter im Quadrat in drei Milliliter DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubiert. Wenn die Zellen etwa 24 Stunden später die Konfluenz erreichen, aspirieren Sie das Medium und infizieren die Zellen mit Chlamydien bei einer Infektionsmehrheit von fünf. In einem Gesamtvolumen von drei Millilitern D-M-E-M-F-B-S, das 200 Nanogramm pro Milliliter Cycloheximid enthält, um die Mutagenese 18 Stunden nach der Infektion unter einer chemischen Haube zu beginnen, bereiten Sie 20 Milligramm pro Milliliter Ethylmethansulfonat oder EMS in PBS mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid vor.

EMS ist ein starkes Mutagen und krebserregend. Beziehen Sie sich daher zur Entsorgung auf das Textprotokoll. Saugen Sie das Medium aus den Vero-Zellen ab und waschen Sie sie einmal mit drei Millilitern PBS mit Magnesiumchlorid und Calciumchlorid.

Dann bei drei Millilitern EMS-Lösung eine Stunde lang im Abzug bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation das EMS und legen Sie es in einen Behälter mit einem molaren Natriumhydroxid, um das Mutagen zu inaktivieren, bevor Sie die Zellen dreimal waschen, um alle EMS-Reste zu entfernen. Dann bei sechs Millilitern DMEM 10%FBS mit 200 Nanogramm pro Milliliter Cycloheide und 25 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin inkubieren und bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 48 bis 72 Stunden inkubieren.

Einschlüsse erscheinen etwa 36 Stunden nach der Mutagenese nach 72 Stunden bakterienfrei. Etwa 10% der Einschlüsse sind mit Bakterien gefüllt, während der Rest leer bleibt, um Elementarkörper oder EBS durch hypotone Lyse zu extrahieren und das Medium vollständig zu aspirieren. Fügen Sie 10 Minuten lang einen Milliliter Wasser und Stein hinzu, um die Zellen zu entfernen, und lyzieren Sie die Zellen, indem Sie mindestens 10 Mal auf und ab pipettieren.

Nachdem Sie das Lysat in einem Mikrofuge-Röhrchen gesammelt haben, fügen Sie 0,25 Milliliter fünf x Saccharose, Phosphatglutamatpuffer oder SPG zu einer Endkonzentration von einem x hinzu und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius. Setzen Sie konfluente Monoschichten von ves-Zellen in sechs Well-Platten ein, indem Sie etwa 0,4 mal 10 der sechs Zellen in drei Milliliter DMEM 10 % FBS pro Well aussäen, damit die Zellen in den nächsten 24 Stunden eine homogene Monoschicht bilden können. Nächster Herbst auf Eis, eine Stammlösung von mutagenen Chlamydien.

Bereiten Sie dann sechs Röhrchen mit zehnfacher Serienverdünnung in einem Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern pro Verdünnung in DMEM 10%FBS vor und legen Sie sie auf Eis. Verwenden Sie drei Milliliter PBS pro Well, um die Vero-Zellen zweimal zu waschen. Geben Sie dann drei Milliliter DMEM in jede Vertiefung für sechs Vertiefungsplatten und 100 Mikroliter der bakteriellen Verdünnung in doppelter Ausführung.

Schwenken Sie die Platte, um eine gleichmäßige Mischung zu gewährleisten. Schleudern Sie die infizierten Platten bei 2.700 GS für 30 Minuten bei 15 Grad Celsius. Dann inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5%igen Kohlendioxid-Inkubator für ein bis zwei Stunden.

In der Zwischenzeit 0,54%AROS in DMEM zubereiten, indem zuerst die folgenden Zutaten kombiniert und gemischt werden. Nun, dann mischen Sie 18,9 Milliliter heiß steril, 1,2% Aroma in Wasser unter Rühren, um Klumpen zu vermeiden. Die Mischung in einem 55 Grad warmen Wasserbad warm halten.

Aspirieren Sie die Bakteriensuspension aus dem Geschirr und fügen Sie sechs Milliliter der warmen Aro-Lösung hinzu. Lassen Sie es bei Raumtemperatur außerhalb der Haube vollständig erstarren. Trocknen Sie die Platten dann in der Biosicherheitshaube mit abgenommenen Deckeln weitere 15 Minuten lang, wenn die Platten getrocknet sind, und inkubieren Sie sie sieben bis 10 Tage lang bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator.

Plaques sollten mit Hilfe eines Präpariermikroskops einen Tag vor der Isolierung der Mutanten sichtbar sein. Sehen Sie einmal 10 bis zu den vier Nullzellen in 100 Mikrolitern pro Well. In einer 96-Well-Platte sind die Zellen innerhalb von 24 Stunden konfluent.

Markieren Sie unter einem Präpariermikroskop die zu entnehmenden Plaques und verwenden Sie dann eine sterile Ein-Milliliter-Barrierepipette, um Plaquepfropfen zu sammeln. Resus suspendiert die Plaques in 100 Mikrolitern DMEM, ergänzt mit 10 % FBS 400 Nanogramm pro Milliliter, Cyclo, Heide und 50 Mikrogramm pro Milliliter. Gentamicin, um die mutierten Stämme zu erweitern, überlagern Sie die Suspension mit konfluenten Monoschichten von Vero-Zellen.

Drehen Sie die Platten 30 Minuten lang bei 2.700 GS und 15 Grad Celsius, bevor Sie die Ernte dbs inkubieren, wenn mehr als 50 % der Zellen infiziert sind, was bereits 48 Stunden nach der Infektion und erst nach 14 Tagen der Fall sein kann. Diese Menge an infizierten Zellen ermöglicht es, genügend lebensfähige Bakterien zu lagern, um EVs durch hypotone Lyse infizierter Zellen zu extrahieren. Nach dem Aspirieren des Mediums bei 160 Mikrolitern sterilem Wasser 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Verwenden Sie Barrierespitzen, um die Zellen aufzubrechen, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren, um eine vollständige Lyse zu gewährleisten. Zum Schluss werden 160 Mikroliter jedes Lysats in Mikrofugeröhrchen überführt. Fügen Sie 40 Mikroliter von fünf XSPG hinzu und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis sie bereit sind, Mutanten auf interessante Phänotypen zu untersuchen und zu untersuchen.

Die Exposition gegenüber Mutagen führt zu Einschlüssen, die frei von Bakterien zu sein scheinen, vermutlich aufgrund des bakteriellen Zelltods. In der Regel führt Serovar LGVL zwei dazu, dass infizierte Zellen innerhalb von 48 Stunden nach der Infektion vollständig läusen, aber die Behandlung mit Mutagenen kann diesen Zyklus auf mehr als 90 Stunden verlängern, und es wird erwartet, dass sich etwa 10 % der Einschlüsse in unseren Experimenten erholen. Infizierte Vero-Zellen, die mit 20 Milligramm pro Milliliter EMS behandelt wurden, führten zu einer 99%igen Verringerung der Genesung infektiöser Nachkommen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen, wie in dieser Abbildung zu sehen ist.

Die Mutagenbehandlung führte auch zur Entstehung von Plaques mit veränderten Morphologien, einschließlich kleiner Plaques. Andere Morphologien umfassen Plaques, die körnig, klumpig oder wabenförmig erscheinen, wie hier gezeigt. Die in diesen Studien verwendeten EMS-Dosen können zu drei bis 30 Mutationen pro KCL-Genom führen, die experimentell mit NGS bewertet werden.

Obwohl gradientengereinigte EBS weitgehend frei von Wirtszellmaterial sind, wird auch die Wirts-DNA nachgewiesen und macht etwa 10 bis 15 % der genomischen Präparate aus. Nach diesem Verfahren wird dies der Fall sein. Screenings auf Phänotypen wie gestörte Replikation in Gewebekulturzellen, Verlust biochemischer Aktivitäten oder veränderte bakterielle Morphologien können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche bakteriellen Faktoren für die Bildung und Aufrechterhaltung von Chlamydien, pathogenen Faktoren, erforderlich sind.