Name: Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie MAPK-induzierte Genexpression in einzelnen Hefezellen quantifizieren. Diese Methode kombiniert Live-Zell-Mikroskopie und Durchflusszytometrie für präzise Einzelzellanalysen.

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Die Autoren danken Matthias Peter und seine Gruppe am Institut für Biochemie an der ETH in Zürich, wo diese Verfahren entwickelt worden. Diese Arbeit wurde durch den Schweizerischen Nationalfonds unterstützt.

1. Mikroskopie-Messungen <ol><li> Impfen 5 ml synthetisches Medium mit Hefe. </li><li> Zellen wachsen bei 30 ° C über Nacht. </li><li> Messen Sie die OD 600 der Übernachtkultur am nächsten Morgen. </li><li> Verdünnen Nacht-Kultur in 5 ml synthetisches Medium bis DA 600 0,05. </li><li> Wachsen die verdünnte Kultur bei 30 ° C für mindestens 4 Stunden. </li><li> Bereiten Sie 3-fach konzentriert (0,6 M) NaCl-Lösung in synthetischem Medium. </li><li> Vorbereitung einer 1 mg / ml Lösung von Concanavalin A (ConA) in PBS. </li><li> Filtrat ~ 200 ul ConA-Lösung in die gut Rutsche. </li><li> Lassen Sie stehen für 30 min. </li><li> ConA-Lösung entfernen. </li><li> In 150 ul H 2 O zum Brunnen. </li><li> Entfernen H 2 O </li><li> OD 600-Messung der Zellkultur. </li><li> Planen 300 ul Zellkultur bei einer OD 600 = 0,02 in einem 1,5 ml Mikroröhrchen. </li><li> Beschallen der Zellen in einem Wasserbad für 45 Sekunden. </li><li> Vortex kurz die microtube. </li><li> Beschallen der Zellen in einem Wasserbad für 45 Sekunden. </li><li> Vortex kurz den Mikroröhrchen. </li><li> Geben Sie 200 ul der Zellkultur zum Brunnen. </li><li> Warten Sie 30 min die Zellen auf dem Boden der gut absetzen zu lassen. </li><li> Legen Sie die Folie auch auf dem Mikroskop. </li><li> Wählen Sie die Beleuchtungseinstellungen für die Leuchtstoff Kanal aufgezeichnet werden. </li><li> Wählen Sie die Beleuchtungseinstellungen für zwei Hellfeld-Bilder (ein etwas unscharf: 3 um unterhalb der Fokusebene, für eine angemessene Segmentierung der Zellen zu ermöglichen). </li><li> Wählen Sie die Zeitintervalle für die Zeitraffer-Messung </li><li> Wählen Sie die Felder der Ansicht zu Bild. </li><li> Starten Sie die Aufnahme von ein paar Frames. </li><li> Pause den Erwerb, die 100 ul von 0,6 M NaCl Medium hinzufügen. </li><li> Resume-Bildgebung. </li></ol> 2. Durchflusszytometrie Messungen <ol><li> Impfen 5 ml synthetisches Medium mit Hefe. </li><li> Wachsen bei 30 ° C über Nacht. </li><li> Messendie OD 600 der Übernacht-Kultur am nächsten Morgen. </li><li> Verdünnen Nacht-Kultur in 5 ml synthetisches Medium bis DA 600 0.1. </li><li> Wachsen bei 30 ° C für mindestens 4 Stunden bis zu einer OD 600 von 0,2-0,4 zu erreichen. </li><li> Vorbereitung Cycloheximid-Lösung 1 mg / ml in H 2 O. </li><li> Bereiten Sie 3-fach konzentriert (0,6 M) NaCl-Lösung in synthetischem Medium. </li><li> Vorbereitung einer 1,5 ml-Mikroröhrchen mit 100 &amp;mgr; l 0,6 M NaCl Medium für jeden Zeitpunkt gemessen werden. </li><li> Zum Zeitpunkt 0, 200 &amp;mgr; l Zellkultur jedem Mikroröhrchen. </li><li> Inkubation mit bei 30 ° C schüttelnd </li><li> Zum Zeitpunkt T, fügen Sie 30 ul Cycloheximid zu einem Mikroröhrchen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.11 für alle gewünschten Zeitpunkten. </li><li> Alle Röhrchen Inkubation für mindestens 45 min und bis zu 3 h bei 30 ° C unter Schütteln. </li><li> Bereiten FACS-Röhrchen mit 400 ul PBS. </li><li> Beschallen die Zellen im Wasserbad für 1 min. </li><li> Vortex kurz die Mikroröhrchen. </li><li> Sohnfindliche die Zellen im Wasserbad für 1 min. </li><li> Vortex kurz die Mikroröhrchen. </li><li> 100 ul Zellkultur von jedem Mikroröhrchen in das entsprechende FACS-Röhrchen. </li><li> Wählen Sie die 488 nm Anregungslaser und 530/30 nm Bandpassfilter für die Erkennung. </li><li> Test-nicht-exprimierenden und Proben voll zum Ausdruck, um zu überprüfen, ob sie in der Detektor-Empfindlichkeitsbereich fallen. </li><li> Messen 10.000 Zellen für jede erworbene Probe. </li></ol>

<ol><li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).</li>
<li>de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAPK+Hog1+recruits+Rpd3+histone+deacetylase+to+activate+osmoresponsive+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes.</a> Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).</li>
<li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li>
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<li>Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Single+Cell+Segmentation+in+a+Variety+of+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images.</a> Current protocols in molecular biology. , (2012).</li>
<li>Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+fluorophore+formation+and+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).</li>
<li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).</li>
<li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Mikroskopie Die Behandlung der mit ConA und ist ein wesentlicher Schritt, um eine richtige Abbildung der Zellen sicherzustellen. Da ConA eine geringe Löslichkeit in PBS (5 mg / ml), kann die Filtration der Entfernung von großen Aggregaten, die in der ungefilterten Lösung vorliegen und stören die Bildgebung. Zellen befestigen relativ stark auf die behandelte Oberfläche und die Zugabe der Lösung zu induzieren nicht die Lokalisierung der Zellen stören, was eine kontinuierliche Verfolgung vor und n...

Signalisierung über transduktionskaskaden oft gipfelt in der Expression von Proteinen. Die Charakterisierung des Expressionsprofils ist ein Schlüsselelement für das Verständnis der Funktion der biologischen Wege. Die Identifizierung des Spektrums hochreguliert Proteine ​​und die Dynamik ihrer Aktivierung kann durch verschiedene Techniken wie Mikroarrays, Northern-Blots und Western Blots 1-3 erreicht werden. , Im Durchschnitt jedoch diese Techniken die Antwort einer ganzen Population von Zellen. Um die Feinregulierung der Expression von Proteinen zu verstehen, ist es wünschenswert, Messungen auf Einzelzellebene zu sammeln. Idealerweise sollten diese Messungen auch quantitative Daten zugänglich mathematische Modelle des Basiswegs zu entwickeln. Mikroskopie und Durchflusszytometrie sind zwei Techniken, die ideal geeignet sind, wie quantitative Einzelzellmessungen liefern. Die endogenen Markierung von Proteinen mit einem fluoreszierenden Protein kann bE verwendet werden, um ihre Expression Level 4 zu quantifizieren. Da die Zugabe einer großen fluoreszierenden Gruppe am Terminus des Proteins kann es machen nicht-funktionellen, ist es jedoch oft wünschenswert, spezifische Expression Reporter basierend auf einem Promotor, der die Expression eines Fluoreszenz Konstrukt zu erzeugen. Dieses Reporter-Protein exogen zu dem zellularen System und daher nicht die Signalisierungsereignisse, die in der Zelle stattfinden, beeinflussen. Sowohl Mikroskopie und Durchflusszytometrie wurden weitgehend im Signalisierungsfeld Hefe verwendet. Als Beispiele; Colman-Lerner und Mitarbeiter korreliert sind, in einzelnen Zellen die Expression von spezifischen Paarung und konstitutiv exprimiert Reportern durch Mikroskopie, um den Lärm in Hefe Paarung Signalübertragungskaskade 5 quantifizieren, Acar und Kollegen verwendeten Durchflusszytometrie, um die regulatorische Netzwerk studieren Steuern der Expression der GAL-Gene 6. In einer früheren Studie 7 haben wir eine Kombina verwendetauf dieser zwei Techniken, um die Expressionsleistung aus der Hoch Osmolarität Glycerin (HOG) Weg in Hefezellen zu studieren. Diese Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-Weg wird durch Hyper osmotischen Stress ausgelöst. Es führt zu der Aktivierung der MAPK Hog1, die in den Kern der Zelle transloziert, ein Transkriptionsprogramm, was zur Expression von etwa 300 Gene zu induzieren. Um diesen Prozess zu untersuchen, haben wir einen Ausdruck Reporter bezogen auf das STL1 Promotor (ein Gen, das unter den Hog1 Aktivität 8 induziert), die Expression von einem Vierfach-Venus fluoreszierendes Protein (p-STL1 qV) entwickelt hatten. Durchflusszytometrie Messungen entdeckt die Anwesenheit von zwei Populationen von Zellen bei mittleren Belastungsniveau (0,1 M NaCl) nur mit einem Bruchteil der Bevölkerung die fluoreszierenden Reporter exprimieren. Wir verwendeten Mikroskopie dieses Verhalten weiter zu untersuchen und entdeckt, dass dieses Geräusch in der Proteinexpression wurde durch intrinsische Faktoren 9 geregelt. Wir could beobachten weiter, dass Zellen, die mit einem ähnlichen Niveau von Hog1 Aktivität könnte auffallend unterschiedliche Expressionsergebnisse anzuzeigen. Die Kombination dieser beiden Techniken konnten wir zeigen, wie die langsamen Umbau der Stressantwortgene beeinflusst die Expression Ergebnis auf Einzelzellebene 7. In diesem Papier verwenden wir die Expression des p-STL1 qV Reporter durch hyper-osmotischen Schock als ein Beispiel für die Quantifizierung der Proteinexpression induziert durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie. Der gleiche Stamm bis 0,2 M NaCl beansprucht wurde mit beiden Methoden untersucht. Dies wird es uns ermöglichen, einige der wichtigsten Unterschiede in diesen beiden Techniken ergänzen sich zu markieren.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenz</td></tr><tr><td>Hefe-Stickstoff-Base</td><td>FürMedium</td><td>CYN6202</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Aminosäuremischung</td><td>ForMedium</td><td>DCS0011</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0450-01</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximid</td><td>Fluka Aldrich Sigma</td><td>C7698</td><td>Toxisch</td></tr><tr><td>ySP9</td><td></td><td></td><td>W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus</td></tr><tr><td>pSP34</td><td></td><td></td><td>pRS305 pSTL1 (-800 -0) - vierfaches V enus</td></tr><tr><td colspan="4">Material</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Ti-Eclipse</td><td></td></tr><tr><td>Steuerungssoftware für Mikroskope</td><td>Mikromanager</td><td>Ver 1.4.11</td><td></td></tr><tr><td>Inkubationskammer</td><td>LIS</td><td>The Box</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzlicht Quelle</td><td>Lumencor</td><td>SpectraX</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>Flash 4.0</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD</td><td>FACS calibur</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator Bad</td><td>Telesonic</td><td>TUC-150</td><td></td></tr><tr><td>8-Well-Objektträger </td><td>Thermo Lab-tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>Matrical bioscience</td><td>MGB096-1-2-LG</td><td></td></tr><tr><td>FACS Rohr</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr></tbody></table>

zeitliche quantifizierung der mapk induzierte expression in einzel-hefezellen

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

Die Quantifizierung der Genexpression auf Einzelzellebene deckt neuen Regulationsmechanismen bei Messungen auf Bevölkerungsebene durchgeführt verdeckt. Zwei Methoden, die auf Mikroskopie und Durchflusszytometrie werden dargestellt, um zu demonstrieren, wie solche Daten erfasst werden. Die Expression eines fluoreszierenden Reporter bei Aktivierung der hohe Osmolarität Glycerin MAPK in Hefe induziert wird als Beispiel verwendet. Die spezifischen Vorteile der einzelnen Verfahren werden hervorgehoben. Durchflusscytometrie misst eine Vielzahl von Zellen (10.000) und liefert ein direktes Maß für die Dynamik der Protein-Expression unabhängig von der langsamen Reifung Kinetik des fluoreszierenden Proteins. Abbildung von lebenden Zellen durch Mikroskopie ist im Gegensatz zu der Messung der gereiften Form der Reporter in weniger Zellen beschränkt. Jedoch können die Datensätze durch diese Technik erzeugt extrem reich durch die Kombinationen von mehreren Reportern und um die räumliche und zeitliche Informationen seinaus Einzelzellen erhalten. Die Kombination dieser beiden Messmethoden können neue Erkenntnisse über die Regulation der Proteinexpression durch Signalwege zu liefern.

Mikroskopie Hefe-Zellen, die das Reportergen Expression STL1 p-qV (ySP9 7) zu dem Boden des Bohrlochs-Schlitten angebracht ist und unter das Mikroskop gelegt. Die Zellen wurden während des Verlaufs der Bildgebungssitzung durch Zugabe von Stress Medium direkt in das Bohrloch gefördert. Dies ermöglicht es uns, ein paar Bilder von den Zellen vor Induktion Weg erwerben und folgen Sie ihr Schicksal nach der Stimulation. Im vorliegenden Fall wurden die Zellen für ca. 2 h mit einem...

Zwei komplementäre Verfahren basierend auf Durchflusszytometrie und Mikroskopie vorgestellt, die die Quantifizierung auf der Ebene einer einzelnen Zelle, die Dynamik der Genexpression durch die Aktivierung eines MAPK-Weg in Hefe induziert ermöglichen.

Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Expression des mitogenaktivierten Proteins auf Einzelzellniveau zu quantifizieren. Zu diesem Zweck wurde ein Hefestamm erzeugt, der den fluoreszenten Expressionsreporter quadruple Venus trägt, der durch den STL-one-Promotor gesteuert wird und spezifisch für die Aktivierung der hog-one-MAP-Kinase ist. Die Expression des fluoreszierenden Proteins kann entweder mittels eines Live-Cell-Mikroskopie-Assays quantifiziert werden, bei dem die Zellen direkt am Mikroskop belastet werden, um das Erscheinen der Fluoreszenz in Echtzeit zu ermöglichen, oder mittels Durchflusszytometrie, wobei die Zellen in einem Mikroröhrchen belastet werden und die Proteinsynthese zu einem bestimmten Zeitpunkt blockiert wird. Durch die Zugabe von Cyclohecid können jeweils nur wenige Zellen gleichzeitig mittels Live-Cell-Mikroskopie analysiert werden, jedoch kann das Schicksal einzelner Zellen direkt beobachtet und mit anderen zellulären Eigenschaften korreliert werden. Die Durchflusszytometrie hingegen ermöglicht auch die Untersuchung der Expression von mitogenaktivierten Proteinen in einer großen Anzahl von Zellen gleichzeitig. Diese Methode ka

temporal-quantification-mapk-induced-expression-single-yeast

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine schnelle Methode zur Visualisierung von wachsenden immobilisierten Hefezellen, hier zu fluoreszierenden Reporter bei der stillen Paarung loci HML und HMR...

Ein schnelles Verfahren für die Visualisierung von Live-immobilisierten Hefezellen

Chronologischer Alterung in Hefe bezieht sich auf den Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen mit der Zeit in der stationären Phase assoziiert. Hier beschreiben wir eine High-Throughput-Verfahren zur quantitativen Bestimmung Hefe chronologische Lebensspanne.

Die Quantifizierung der Hefe Chronologisches Life Span durch Auswachsen von gealterten Zellen

FRET-basierten Reporter werden immer häufiger eingesetzt, um Kinase-und Phosphatase-Aktivitäten in lebenden Zellen zu überwachen. Hier beschreiben wir eine Methode auf, wie FRET-basierten Reporter nutzen, um den Zellzyklus-abhängige Veränderungen in Ziel-Phosphorylierung zu beurteilen.

Überwachung Kinase und Phosphatase-Aktivitäten durch den Zellzyklus durch Ratiometric FRET

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Verfahren für die Durchführung...

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Wir präsentieren ein einfaches Protokoll zur Fluoreszenzmikroskopie Filme von wachsenden Hefezellen und eine GUI-basierte Software-Paket, um Single-Cell-Zeitreihen extrahieren zu erhalten. Die Analyse umfasst automatisierte Linie und Teilung Zeitzuweisung mit Sichtprüfung und manuelle curation der verfolgten Daten integriert.

Acquiring Fluoreszenz Zeitraffer-Filme von Bäckerhefe und Analysieren von Einzel-Zell-Dynamics mit Transplantaten

Die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe ist ein ausgezeichnetes Modellsystem cytokinesis studieren, die letzte Stufe in der Zellteilung. Hier haben wir einen Mikroskopie-Ansatz beschreiben verschiedene zytokinetischen Ereignisse in Live-Spalthefezellen analysieren.

Räumlich-zeitliche Analyse von zytokinetischen Events in Spalthefe

Hier präsentieren wir ein Protokoll mit RNA-Seq, um mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der hypoxischen Antwort von S. Cerevisiae Zellen zu überwachen. Diese Methode kann zu analysieren, gen-Expression in eine zelluläre Reaktion angepasst werden.

Messung der mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der Hefe S. Cerevisiae hypoxischen Antwort

Das hier beschriebene Protokoll basiert auf der genomweiten Quantifizierung der neugebildete mRNA von Hefezellen mit 4-Thiouracil beschriftet gereinigt. Diese Methode ermöglicht die Messung der mRNA-Synthese von mRNA Decay abgekoppelt und schafft somit eine genaue Messung der RNA-Polymerase II Transkription.

Saccharomyces cerevisiae Beschriftung mit 4-Thiouracil und Quantifizierung der metabolischen synthetisiert neu mRNA als Proxy für RNA-Polymerase II Aktivität

Die Zeitraffer-Mikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Meiose in knospender Hefe. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die Zellzyklus-Synchronisation, Zeitraffer-Mikroskopie und bedingte Depletion eines Zielproteins kombiniert, um zu zeigen, wie die Funktion eines bestimmten Proteins während der meiotischen Chromosomentrennung untersucht werden kann.

Einsatz von Zeitraffer-Mikroskopie und stadienspezifischer Kerndepletion von Proteinen zur Untersuchung der Meiose bei S. cerevisiae

Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden des Hefezellzyklus-Arrests und der optionalen Freisetzung und erläutert den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung von zellzyklusabhängigen Prozessen in S. cerevisiae.

Manipulation und Analyse von zellzyklusabhängigen Prozessen in knospenden Hefen

Erfahren Sie, wie Sie MAPK-induzierte Genexpression in einzelnen Hefezellen quantifizieren. Diese Methode kombiniert Live-Zell-Mikroskopie und Durchflusszytometrie für präzise Einzelzellanalysen.

Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

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