Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Expression des mitogenaktivierten Proteins auf Einzelzellniveau zu quantifizieren. Zu diesem Zweck wurde ein Hefestamm erzeugt, der den fluoreszenten Expressionsreporter quadruple Venus trägt, der durch den STL-one-Promotor gesteuert wird und spezifisch für die Aktivierung der hog-one-MAP-Kinase ist. Die Expression des fluoreszierenden Proteins kann entweder mittels eines Live-Cell-Mikroskopie-Assays quantifiziert werden, bei dem die Zellen direkt am Mikroskop belastet werden, um das Erscheinen der Fluoreszenz in Echtzeit zu ermöglichen, oder mittels Durchflusszytometrie, wobei die Zellen in einem Mikroröhrchen belastet werden und die Proteinsynthese zu einem bestimmten Zeitpunkt blockiert wird.

Durch die Zugabe von Cyclohecid können jeweils nur wenige Zellen gleichzeitig mittels Live-Cell-Mikroskopie analysiert werden, jedoch kann das Schicksal einzelner Zellen direkt beobachtet und mit anderen zellulären Eigenschaften korreliert werden. Die Durchflusszytometrie hingegen ermöglicht auch die Untersuchung der Expression von mitogenaktivierten Proteinen in einer großen Anzahl von Zellen gleichzeitig. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Signaltransduktion zu beantworten, beispielsweise, welche Proteine an der Regulation der Genexpression beteiligt sind. Obwohl diese Methode Einblicke in den Hefe-Signalweg ermöglicht, kann sie ebenfalls auf andere Signaltransduktionskaskaden angewendet werden, abhängig von der Verfügbarkeit des geeigneten Expressions-Reporters.

Um die Zellen für die Live-Cell-Mikroskopie vorzubereiten, impfen Sie zunächst fünf Milliliter synthetisches Medium mit Hefe an und kultivieren die Zellen über Nacht bei 30 Grad Celsius. Am nächsten Morgen messen Sie den OD 600 der Übernachtkultur und verdünnen diese anschließend in fünf Milliliter synthetischem Medium auf einen OD 600 von 0,05. Kultivieren Sie die verdünnte Kultur mindestens vier weitere Stunden bei 30 Grad Celsius.

Als Nächstes filtern Sie etwa 200 Mikroliter frisch zubereitete Con-A-Lösung in die Objektträgermulde. Nach 30 Minuten entfernen Sie die Con-A-Lösung und geben 150 Mikroliter Wasser in die Mulde. Entfernen Sie nun das Wasser und lassen Sie die Mulde trocknen, während die Zellen vorbereitet werden.

Messen Sie erneut den OD 600 der Zellkultur und verdünnen Sie die Zellen anschließend, um 300 Mikroliter Zellkultur mit einem OD 600 von 0,02 in einem 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen zu erhalten. Sonizieren Sie die Zellen 45 Sekunden lang im Wasserbad. Vortexen Sie die Mikroröhrchen kurz und sonizieren und vortexen Sie die Zellen danach erneut.

Geben Sie nun 200 Mikroliter der Zellen in die Vertiefung der Objektträgerkammer und lassen Sie die Zellen etwa 30 Minuten lang auf den Boden der Vertiefung sedimentieren, bevor Sie den Objektträger auf das Mikroskop setzen. Wählen Sie anschließend die Beleuchtungseinstellungen für den zu erfassenden fluoreszierenden Kanal sowie für zwei Hellfeldbilder aus, wobei eine der Hellfeldeinstellungen etwa drei Mikrometer unterhalb der Fokusebene angepasst wird, um eine korrekte Zellsegmentierung zu ermöglichen. Danach legen Sie die Zeitintervalle für die Zeitrafferaufnahmen fest und wählen die Bildfelder für die Aufnahme aus.

Starten Sie nun die Aufnahme für einige Einzelbilder und pausieren Sie anschließend die Aufnahme, um 100 Mikroliter frisch zubereitetes 0,6-molares Natriumchlorid-Medium hinzuzufügen, und setzen Sie die Bildaufnahme fort, um die Zellen für die Messung per Durchflusszytometrie vorzubereiten. Inokulieren Sie zunächst die Hefe in fünf Milliliter synthetischem Medium und kultivieren Sie die Zellen über Nacht bei 30 Grad Celsius. Messen Sie am nächsten Morgen den OD 600 der Übernachtkultur und verdünnen Sie die Zellsuspension in fünf Milliliter synthetischem Medium auf einen OD 600 von 0,1.

Züchten Sie die Kultur mindestens vier Stunden bei 30 Grad Celsius, um einen OD 600 von 0,2 bis 0,4 zu erreichen. Geben Sie dann für jeden Zeitpunkt, der zum Zeitpunkt null gemessen werden soll, 100 Mikroliter frisch zubereitete 0,6 molare Natriumchloridlösung in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen. Fügen Sie 200 Mikroliter Zellen zu jedem Mikroröhrchen hinzu und inkubieren Sie die Kulturen unter Schütteln bei 30 Grad Celsius.

Dann zu jedem der experimentellen Zeitpunkte 30 Mikroliter frisch zubereiteten Cycloheids zu einem der Mikroröhrchen hinzufügen. Während die Mikroröhrchen inkubiert werden, 400 Mikroliter PBS in ein entsprechendes FAX-Röhrchen für jedes Mikroröhrchen geben. Nach der Inkubation die Mikroröhrchen kurz verwirbeln, anschließend die Zellen sonifizieren und wie eben gezeigt für eine Minute im Wasserbad behandeln.

Fügen Sie dann 100 Mikroliter Zellkultur aus jedem Mikroröhrchen in das entsprechende FACS-Röhrchen am Durchflusszytometer hinzu. Laden Sie die geeigneten Anregungs- und Detektionseinstellungen und testen Sie die nicht exprimierenden und vollständig exprimierenden Proben, um sicherzustellen, dass sie im Empfindlichkeitsbereich des Detektors liegen. Messen Sie abschließend 10.000 Zellen für jede Probe in diesen Bildern, wobei Hefezellen, die den Expressionsreporter Quadruple Venous Protein unter Kontrolle des TL1-Promotors tragen und an der Unterseite eines Objektträgers befestigt sind, durch direkte Zugabe von Stressmedium stimuliert wurden.

Wie soeben gezeigt, wurden die Zellen etwa zwei Stunden lang in Zehn-Minuten-Abständen überwacht, und Bilder wurden sowohl vor als auch nach der Applikation des Stimulus aufgenommen. Achten Sie auf die fluoreszierende Expression des Reporters in den aktivierten Zellen. Um die in diesen Bildern enthaltenen quantitativen Informationen zu extrahieren, muss hier ein komplexer Bildanalyseprozess durchgeführt werden.

Die mit der Hefe-Quant-Analyseplattform erhaltenen Ergebnisse werden gezeigt. Jede rote Spur stellt die zeitliche Entwicklung der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität einer einzelnen Zelle dar. Die blaue Linie veranschaulicht den Median von mehr als 500 Zellen, die über 20 Bilder hinweg in fünf Zeitrafferaufnahmen aus fünf verschiedenen Blickfeldern derselben Vertiefung segmentiert und verfolgt wurden; der hellblaue Bereich repräsentiert das 25. und 75. Perzentil aller zu einem bestimmten Zeitpunkt gemessenen Intensitäten. Um die Dynamik der Expression desselben Reporters mittels Durchflusszytometrie zu untersuchen, wurde Cycloheximid den Hefezellkulturen zu verschiedenen Zeitpunkten im Abstand von fünf bis zehn Minuten hinzugefügt.

Das Medikament blockiert die Synthese neuer Proteine, doch die Reifung des bereits exprimierten fluoreszierenden Proteins wird nicht beeinträchtigt. Daher kann die durch die Verschiebung des Histogramms nach rechts sichtbare Proteinexpression zum Zeitpunkt der Cycl-H-Behandlung quantifiziert werden, wodurch die mit der Reifung fluoreszierender Proteine verbundenen Probleme umgangen werden. In dieser Grafik werden die Dynamiken des Expressionsreporters, gemessen mittels Mikroskopie oder Durchflusszytometrie, miteinander verglichen: Während das fluoreszierende Signal nach Mikroskopie-Analyse erst 30 bis 40 Minuten nach Zugabe des Stressmediums ansteigt, zeigen die Messungen der Durchflusszytometrie deutlich, dass die Proteine bereits 10 bis 15 Minuten nach der Stimulusgabe produziert werden, was auf die langsame Reifung der fluoreszierenden Proteine hinweist.

Beide Techniken ermöglichen den Zugriff auf Einzelzellinformationen für diese einfachen Experimente; die Variabilität zwischen drei biologischen Wiederholungen ist gering im Vergleich zur großen Variabilität, die in den Einzelzellantworten mittels Mikroskopie oder Durchflusszytometrie beobachtet wird. Nach Durchführung dieser Verfahren können andere Methoden wie solche Antwortmessungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, welches der Schwellenwert für die Genexpression ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Proteinausprägung auf Einzelzellebene mit dem Mikroskop oder der Durchflusszytometrie gemessen werden kann.