Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Mitogen-aktivierte Proteinexpression auf Einzelzellebene zu quantifizieren. Um dies zu erreichen, wurde ein Hefestamm mit dem fluoreszierenden Expressionsreporter quadruple Venus erzeugt, der durch den STL-One-Promotor gesteuert wird und spezifisch für die Aktivierung der hog-one-Map-Kinase ist. Die Expression fluoreszierender Proteine kann entweder durch einen Lebendzellmikroskopie-Assay quantifiziert werden, bei dem die Zellen direkt am Mikroskop gestresst werden, um die Echtzeit-Erscheinung der Fluoreszenz zu erleichtern, oder durch Durchflusszytometrie, wobei die Zellen in einem Mikroröhrchen gestresst werden und die Proteinsynthese zu einem bestimmten Zeitpunkt blockiert wird.

Durch die Zugabe von Cycloheide können jeweils nur wenige Zellen mit der Lebendzellmikroskopie analysiert werden, aber das Schicksal der einzelnen Zellen kann direkt beobachtet und mit anderen zellulären Eigenschaften korreliert werden. Auf der anderen Seite ermöglicht die Durchflusszytometrie auch die Beurteilung der Mitogen-aktivierten Proteinexpression auf einer großen Anzahl von Zellen auf einmal. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Signalfeld zu beantworten, z. B. welche Proteine an der Regulation der Genexpression beteiligt sind. Obwohl diese Methode einen Einblick in den Hefeweg geben kann, kann sie auch auf andere Signalkaskaden angewendet werden, abhängig von der Verfügbarkeit der richtigen Expression. Reporter.

Um die Zellen für die Lebendzellmikroskopie vorzubereiten, beimpft man zunächst fünf Milliliter synthetisches Medium mit Hefe und züchtet die Zellen dann über Nacht bei 30 Grad Celsius. Am nächsten Morgen wird der OD 600 der Übernachtkultur gemessen und dann die Übernachtkultur in fünf Millilitern synthetischem Medium auf einen OD 600 von 0,05 verdünnt. Lassen Sie die verdünnte Kultur mindestens vier weitere Stunden bei 30 Grad Celsius wachsen.

Anschließend werden etwa 200 Mikroliter frisch zubereitete conna valente Lösung in den Vertiefungsschieber filtriert. Entfernen Sie nach 30 Minuten die Lösung und geben Sie 150 Mikroliter Wasser in die Vertiefung. Entferne nun das Wasser und lass die Vertiefung trocknen, während die Zellen vorbereitet werden.

Messen Sie erneut den OD 600 der Zellkultur und verdünnen Sie dann die Zellen, um 300 Mikroliter Zellkultur bei einem OD 600 von 0,02 und einem 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen zu erhalten. Beschallen Sie die Zellen 45 Sekunden lang in einem Wasserbad. Die Mikroröhrchen kurz vortexen und dann die Zellen erneut beschallen und wirbeln.

Geben Sie nun 200 Mikroliter der Zellen in den Objektträger und legen Sie den Objektträger, nachdem Sie die Zelle etwa 30 Minuten lang auf dem Boden der Vertiefung abgesetzt haben, auf das Mikroskop. Wählen Sie als Nächstes die Beleuchtungseinstellungen für den aufzunehmenden Fluoreszenzkanal und für zwei Hellfeldbilder aus und passen Sie eine der Hellfeldeinstellungen etwa drei Mikrometer unterhalb der Fokusebene an, um eine korrekte Zellsegmentierung zu ermöglichen. Stellen Sie dann die Zeitintervalle für die Zeitraffermessungen ein und wählen Sie die Sichtfelder für die Bildgebung aus.

Starten Sie nun die Aufnahme für einige Frames und unterbrechen Sie dann die Aufnahme, um 100 Mikroliter frisch zubereitetes 0,6-molares Natriumchloridmedium hinzuzufügen, und setzen Sie die Bildgebung fort, um die Zellen für die Messung durch Durchflusszytometrie vorzubereiten. Beginnen Sie damit, die Hefe in fünf Millilitern synthetischem Medium zu impfen und züchten Sie die Zellen über Nacht bei 30 Grad Celsius. Am nächsten Morgen wird der OD 600 der Nachtkultur gemessen und dann die Zellsuspension in fünf Millilitern synthetischem Medium auf einen OD 600 von 0,1 verdünnt.

Lass die Kultur mindestens vier Stunden lang bei 30 Grad Celsius wachsen, um einen OD 600 von 0,2 bis 0,4 zu erreichen. Geben Sie dann 100 Mikroliter frisch zubereitetes 0,6 molares Natriumchlorid in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen für jeden Zeitpunkt, der zum Zeitpunkt Null gemessen werden soll. Geben Sie 200 Mikroliter Zellen in jedes Mikroröhrchen und inkubieren Sie die Kulturen unter Schütteln bei 30 Grad Celsius.

Geben Sie dann zu jedem der experimentellen Zeitpunkte 30 Mikroliter frisch zubereitetes Cycloheide in eines der Mikroröhrchen. Während die Mikroröhrchen inkubiert werden, fügen Sie 400 Mikroliter PBS zu einem entsprechenden Faxschlauch für jedes Mikroröhrchen hinzu. Nach der Inkubation die Mikroröhrchen kurz vortexen, dann die Zellen beschallen und ein Wasserbad für eine Minute hinzufügen, wie gerade gezeigt.

Geben Sie dann 100 Mikroliter Zellkultur aus jedem Mikroröhrchen in das entsprechende Faxrohr beim Durchfluss des Zytometers. Laden Sie die richtigen Anregungs- und Detektionseinstellungen und testen Sie die nicht exprimierenden und vollständig exprimierenden Proben, um sicherzustellen, dass sie in den Empfindlichkeitsbereich des Detektors fallen. Messen Sie schließlich 10.000 Zellen für jede Probe in diesen Bildern, Hefezellen, die den Expressionsreporter vierfach venöses Protein unter der Kontrolle des TL-1-Promotors trugen und an den Boden eines Well-Objektträgers gebunden waren, wurden durch direkte Ausgabe von Stressmedium stimuliert.

Wie gerade gezeigt, wurden die Zellen etwa zwei Stunden lang im Abstand von 10 Minuten überwacht, und die Bilder wurden sowohl vor als auch nach der Ausgabe des Stimulus aufgenommen. Beachten Sie die Fluoreszenzexpression des Berichts während der aktivierten Zellen. Um die in diesen Bildern enthaltenen quantitativen Informationen zu extrahieren, muss hier ein komplexer Bildanalyseprozess durchgeführt werden.

Die mit der Hefe-Quant-Analyseplattform erzielten Ergebnisse werden gezeigt. Jede rote Spur stellt die zeitliche Entwicklung der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität einer einzelnen Zelle dar. Die blaue Linie zeigt den Median von mehr als 500 Zellen, die segmentiert und über 20 Bilder von fünf Zeitrafferfilmen verfolgt wurden, die aus fünf verschiedenen Sichtfeldern aus derselben Vertiefung aufgenommen wurden. Der hellblaue Bereich stellt das 25. und 75. Perzentil aller Intensitäten dar, die zu einem bestimmten Zeitpunkt gemessen wurden, um die Dynamik der Expression desselben Reporters durch Durchflusszytometrie zu untersuchen. Cycloheximid wurde der Hefe zugesetzt. Zellkulturen zu verschiedenen Zeitpunkten im Abstand von fünf bis 10 Minuten.

Das Medikament blockiert die Synthese neuer Proteine, aber die Reifung des bereits exprimierten fluoreszierenden Proteins wird nicht gestört. Daher kann die Proteinexpression, die durch die Verschiebung des Histogramms nach rechts visualisiert wird, zum Zeitpunkt der Cycl H-Edition quantifiziert werden, wodurch die mit der Fluoreszenzproteinreifung verbundenen Probleme umgangen werden. In dieser Grafik wird die Dynamik des Expressionsreporters, gemessen durch Mikroskopie oder Durchflusszytometrie, verglichen, während das Fluoreszenzsignal 30 bis 40 Minuten nach der Ausgabe des Stressmediums ansteigt, wie durch die Mikroskopie gemessen, zeigen die durchflusszytometrischen Messungen deutlich, dass die Proteine bereits zwischen 10 und 15 Minuten nach dem Stimulus produziert werden, was die langsame Reifung der fluoreszierenden Proteine zeigt.

Beide Techniken ermöglichen den Zugang zu Einzelzellinformationen für diese einfachen Experimente, die Variabilität zwischen drei biologischen Replikaten ist gering im Vergleich zu der großen Variabilität, die bei den Einzelzellantworten durch Mikroskopie oder Durchflusszytometrie beobachtet wird. Nach diesen Verfahren können andere Methoden wie diese Antwortmessungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Frage, welches die Schwelle für die Genexpression ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Proteinexpression auf Einzelzellebene mit dem Mikroskop der Durchflusszytometrie misst.