Name: Langzeit-Potenzierung der perforant Pathway-Gyrus dentatus Synapse in Frei Behaving Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Erfahren Sie die Aufzeichnung von Langzeit-Potenzierung in frei beweglichen Mäusen durch chirurgische Mikroelektroden-Implantation. Diese Methode ermöglicht neurophysiologische Studien zu Lernen und Gedächtnis.

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Die Autoren möchten die folgende bestätigen: Dr. Joseph Bronzino, Dr. Abu-Khamis Hassaballah, Mr. Austin RJ-LaFrance und Frau Jessica Koranda.

Dieses Protokoll ist für Mäuse von 3 und 18 Monate alt sind und die ungefähre Körpergewicht von 30-50 g) geeignet. Mäuse können von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) bezogen werden. Alle chirurgischen und experimentelle Protokolle wurden von der Trinity College Animal Care und Verwenden Ausschuss genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit der NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Tier Vorbereitung und chirurgische Verfahren <ol><li> Vorbereitung Anästhesie Cocktail Ketamin (25 mg / ml), Xylazin (2,5 mg / ml) und Acepromazin (0,5 mg / ml) enthält. Spritzen 1 ml / kg Körpergewicht in der rechten unteren Quadranten des Bauches ergänzt durch 0,2 ml / kg Injektionen alle 45 min danach, eine stabile Narkosetiefe mit dem Pedal Rückzugsreflex halten. </li><li> Bereiten narkotisierten Maus für Chirurgie durch Rasieren das Fell auf seine Schädeldecke mit einem elektrischen Rasierer. Die rasierte Fläche sollte die Mitte der Augen auf die Mitte der Ohren umfassen. Achten Sie darauf, nicht zu rasieren Whiskers, da sie Teil des Maus-Lauf sensorischen Systems sind. </li><li> Verwenden Sie Wattestäbchen zu Isopropyl-Alkohol, gefolgt von Betadine auf die rasierte Fläche auf dem Kopf an. Dann auch mit Wattestäbchen, eine kleine Menge von Mineralöl auf die Augen, um die Augäpfel aus Austrocknen zu verhindern. </li><li> Verwenden Sie Babyratte Ohr Manschetten anstelle der normalen Ohr Bars, den Kopf des Tieres auf der stereotaktischen Rahmen Gerät zu montieren. Um dies zu tun, zuerst montieren linken Ohr am linken Ohr Manschette. Dann vorsichtig mit dem rechten Ohr auf die rechte Manschette vorsichtig unterstützt den Kopf des Tieres mit einer Hand und Förderung der Ohr-Manschette mit der anderen Hand. Als nächstes legen Sie ein Heizkissen unter den Körper des Tieres und stellen Sie es auf 86 ° C Körpertemperatur aufrecht zu erhalten. </li><li> Überprüfen Sie dann für bilaterale Steifigkeit durch den Versuch, den Kopf Seite zu Seite. Das Tier richtig auf dem stereotaktischen Rahmen montiert, wenn der Kopf ist starr und kann nicht bewegt Seite zu Seite, kann aber leicht nach oben und unten schwenken. </li><li> Sanft ruhen dieMaus Schnauze auf die Nase / Zahnstangenanordnung, sicherzustellen, dass die Schneidezähne sind sanft, aber sicher in der Zahn Öffnung der Nase / Zahnleiste ruht. </li><li> Mit einem sterilen Skalpell ein Mittellinienschnitt von der Mitte des Auges zu der Mitte der Ohren. Stellen Sie sicher, das Skalpell in einem 45 °-Winkel statt und gelten genügend Druck, um durch die darunterliegende Faszie, aber nicht durch den Schädel geschnitten als dass starke Blutungen verursachen. </li><li> Verwenden Sie Wattestäbchen, um die Blende zu trennen und setzen den Schädel. Schädel der Sehenswürdigkeiten Bregma und Lambda muss deutlich sichtbar (Abbildung 1A) sein. Stellen Sie sicher, dass das Tier in den Schädel flachen Position, indem die Nase / Zahnleiste, so dass Bregma und Lambda Wahrzeichen sind bei gleichen dorsoventraler (DV)-Position (+ 0,1 mm). </li><li> Eine kleine Menge steriler Kochsalzlösung auf den Bereich und verwenden Sie Wattestäbchen vorsichtig reinigen den Schädel. Dann warten Sie 2-3 Minuten für den Schädel vollständig an der Luft trocknenbevor Sie fortfahren. </li><li> Montieren Sie eine Nadel auf der linken stereotaktischen Arm um die DV-Position des Bregma und Lambda messen. Das DV-Positionierung dieser beiden Wahrzeichen sollte innerhalb von 0,1 mm voneinander entfernt sein. Wenn nicht, wird der Nasenleiste des stereotaktischen Rahmen nach oben und unten eingestellt werden, um dies zu erreichen. </li><li> Positionieren Sie die Nadel auf Bregma seiner anterior-posterioren (AP), lateral (LAT) und dorsoventralen (DV)-Messungen aufzeichnen. Seien Sie sicher, dass die Nadel gerade berührt den Schädel und nicht es zu durchdringen. </li><li> Verwenden Sie eine Maus Hirnatlas, wie &quot;Gehirn der Maus in Stereotaktische Koordinaten&quot; ein, um die Koordinaten für die Zielstrukturen bestimmen: medial perforant Weg (MPP) in der Winkelbündels und Gyrus dentatus (DG) des Hippocampus, bezogen auf Lambda und Bregma, bzw. (siehe auch Tabelle 1). Dann, mit einem feinen Kugelschreiber oder Bleistift, diese Punkte auf dem Schädel zu markieren. </li><li> Außerdem kennzeichnen zwei weitere Punkte auf der kontralateralen Seite des Schädels. Diese Punkte wird als Masse (GND) und Referenz (REF) dienen sollte etwa 3 mm von der Mittellinie angeordnet sein und in Längsrichtung relativ zueinander (Fig. 1A, Tabelle 1). </li><li> Entfernen Sie die Nadel Marker von links stereotaktischen Arm und ersetzen Sie es mit einem elektrischen Zahnbohrer mit einer stereotaktischen Halterung ausgestattet. Setzen Sie den Bohrer über jeden markierten Punkt und kleine Bohrlöcher von ca. 0,5 mm im Durchmesser. Beim Bohren mit einem sich wiederholenden Auf-und-Ab-Bewegung und überprüfen Sie häufig, ob der Bohrer den Schädel eingedrungen, um die Gehirnoberfläche freizulegen. </li><li> Sanft, aber bestimmt eine Schraube Elektrode (# 0-80 1/8 Edelstahl-Maschinenschrauben, Schlitz Rundkopf) in jedem der kontralateralen Löcher (GND und REF) zu fahren, dass sie den kortikalen Oberfläche gerade berühren, ohne ihn zu durchdringen (Abbildung 1A ). Diese beiden Schrauben Elektroden dienen als Grund-und Referenz. </li><li> Berg anregende und Aufzeichnungselektroden in elektrode Halter an den linken und rechten stereo Arme sind. </li><li> Verbinden die stimulierenden Elektrodenanschlüsse an eine elektro Stimulator mit Stromisolierung und dem Aufzeichnungselektrodenanschluss mit einem elektroDifferenzVerstärker (Verstärkung = 1.000, Bandpaßfilter = 1 Hz-3 kHz) und dann zu einem Digital-Oszilloskop zur visuellen Inspektion von evozierten Reaktionen. Außerdem verbinden GND und REF Elektrodenanschlüsse an den Differenzverstärker. </li><li> Sanft und langsam unteren stimulierende und Aufzeichnungselektroden in 0,5 mm-Schritten, während visuell evozierten Überwachung der Reaktion auf einen Reiz Schock von 600-800 uA. Weiterhin jede Elektrode zu senken, bis sie ihre jeweiligen DV Zielposition zu erreichen und eine stereo Signal wird auf dem Oszilloskop (1B) beobachtet. </li><li> Danach können Zahnacrylzement, eine Kappe zu machen, um die Elektrodenanschlüsse in Position zu halten, jede Zahnzement, die die Haut berührt, sollte abgewischt werdensofort. Sobald die Zahnzement vollständig ausgehärtet übertragen Sie die Tier aus dem stereotaktischen Rahmen für eine saubere Nagerkäfig. Verwenden Sie eine Wärmelampe oder-Pad, um die Kerntemperatur aufrecht zu erhalten. </li><li> Überwachung der dem Tier jede Stunde, bis er das Bewusstsein wiedererlangt. Eine Injektion von Flunixin können als Analgetikum verabreicht werden. </li></ol> 2. LTP Induktion <ol><li> Lassen Sie das Tier 5-7 Tage, um sich von der Operation zu erholen. Legen Sie das Tier in der Aufnahmeumgebung, bestehend aus einem Faraday-Käfig (122 cm x 43 cm x 43 cm) mit Schallschutzmaterial ausgestattet und ein 5-Kanal-Drehkollektorverbindungs ​​die Elektrode führt zu der stimulierenden / Aufnahme-Setup. </li><li> Lassen Sie das Tier, um für 1-2 Stunden in der Aufnahmeumgebung, bevor Sie die Elektroden an den anregenden und Aufzeichnungsgeräten (siehe Schritt 1.17) akklimatisieren. </li><li> Stellen Sie die Kontrollen Stimulator zur Ausgabe 400 uA und notieren Sie die Amplitude von durchschnittlich 10 hervorgerufenen Reaktionen dafür, dass than mindestens 10 Sekunden verstreichen zwischen Reizen. Die in Abbildung 1C dargestellten Verfahren, die evozierte Reaktion zu quantifizieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für 600, 800, 1.000, 1.200 und 1.400 uA. </li><li> Konstrukt eine Eingangs / Ausgangskurve durch Auftragen der mittleren Amplitude der evozierten Reaktion gegen Reizstärke. Aus diesem Diagramm zu bestimmen, die Reizstärke auf 50% der Maximalamplitude gemessen wird, entspricht. Verwenden des 50%-Intensität für den Rest des Experiments. </li><li> Dann, mit 50% Reizintensität, erhalten eine Basislinie durch die Aufnahme die mittlere Amplitude von 5 evozierte jede Minute für 15 min. Wieder stellen Sie sicher, dass mindestens 10 Sekunden verstreichen zwischen Reizen. </li><li> Anschließend liefern die tetanische Stimulation, bestehend aus 10 Ausbrüche von 10 Impulsen bei 400 Hz mit einer Burst-Rate von 5 Hz bis der medialen perforant Weg ausgeliefert. Überwachen Sie die Tier engmaschig auf Anzeichen der Beschlagnahme, einschließlich nasser Hund schüttelt. Wenn das Tier einen Anfall hat die experiment sollte beendet werden und alle Daten von diesem Tier sollte von den Ergebnissen der Studie ausgeschlossen werden. </li><li> Dann weiterhin aufzeichnen die mittlere Amplitude von 5 evozierte jede Minute für 30 Minuten posttetanization. Danach Vergleichen dieses Amplitude zur Grundlinie Amplitude im Schritt 2.5 durch Berechnen der prozentualen Änderung von der Basislinie (Fig. 2) erhalten. </li><li> Nach Abschluss der Experimente wird das Tier durch Inhalation von Isofluran-Methode, die im Einklang mit den Leitlinien für Euthanasie von der American Veterinary Medical Association ist eingeschläfert. </li></ol>

<ol><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , Compact 2nd edn, Elsevier Academic Press. (2004).</li>
<li>Bliss, T. V. P., Lomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+potentiation+of+synaptic+transmission+in+the+dentate+area+of+the+anesthetized+rabbit+following+stimulation+of+the+perforant+path%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anesthetized rabbit following stimulation of the perforant path.</a> J. Physiol. 232, 331-356 (1973).</li>
<li>Blaise, J. H., Bronzino, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+stimulus+frequency+and+age+on+bidirectional+synaptic+plasticity+in+the+dentate+gyrus+of+freely+moving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Effects of stimulus frequency and age on bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of freely moving rats.</a> Exp. Neurol. 182, 497-506 (2003).</li>
<li>Blaise, J. H., Koranda, J. L., Chow, U., Haines, K. E., Dorward, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+isolation+stress+alters+bidirectional+long-term+synaptic+plasticity+in+amygdalo-hippocampal+synapses+in+freely+behaving+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Neonatal isolation stress alters bidirectional long-term synaptic plasticity in amygdalo-hippocampal synapses in freely behaving adult rats.</a> Brain Res. 1193, 25-33 (2008).</li>
<li>Koranda, J. L., Masino, S. A., Blaise, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+synaptic+plasticity+in+the+dentate+gyrus+of+the+awake+freely+behaving+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of the awake freely behaving mouse.</a> J. Neurosci. Methods. 167, 160-166 (2008).</li>
<li>Cooke, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophosphorylation+of+alphaCaMKII+is+not+a+general+requirement+for+NMDA+receptor-dependent+LTP+in+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Autophosphorylation of alphaCaMKII is not a general requirement for NMDA receptor-dependent LTP in the adult mouse.</a> J. Physiol. 574, 805-818 (2006).</li>
<li>Davis, S., Bliss, T. V., Dutrieux, G., Laroche, S., Errington, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+duration+of+long-term+potentiation+in+the+hippocampus+of+the+freely+moving+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Induction and duration of long-term potentiation in the hippocampus of the freely moving mouse.</a> J. Neurosci. Methods. 75, 75-80 (1997).</li>
<li>Jones, M. W., Peckham, H. M., Errington, M. L., Bliss, T. V., Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+in+the+hippocampus+of+awake+C57BL%2F6+and+DBA%2F2+mice%3A+interstrain+differences+and+parallels+with+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity in the hippocampus of awake C57BL/6 and DBA/2 mice: interstrain differences and parallels with behavior.</a> Hippocampus. 11, 391-396 (2001).</li>
<li>Zhang, T. A., Tang, J., Pidoplichko, V. I., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addictive+nicotine+alters+local+circuit+inhibition+during+the+induction+of+in+vivo+hippocampal+synaptic+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Addictive nicotine alters local circuit inhibition during the induction of in vivo hippocampal synaptic potentiation.</a> J. Neurosci. 30, 6443-6453 (2010).</li>
<li>Tang, J., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+enables+in+vivo+synaptic+plasticity+associated+with+the+addictive+drug+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dopamine enables in vivo synaptic plasticity associated with the addictive drug nicotine.</a> Neuron. 63, 673-682 (2009).</li>
</ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

In diesem Protokoll haben wir eine zuverlässige und einfache Methode zur Untersuchung LTP in der GD in frei verhalten Mäusen gezeigt. Während viele Studien von LTP an wachen Ratten durchgeführt wurden 3,4, haben nur sehr wenige an wachen Mäusen vor allem aufgrund der technischen Komplexität durch die begrenzte Hirn Immobilien in Mäusen und dem Gewicht der Elektrode headstages bezogen auf das durchschnittliche Gewicht der gestellten durchgeführt worden 5 Mäuse. Die wenigen Studien, die LTP in der GD...

Die Entwicklung der Technik, um Gene zu manipulieren hat transgenen und Knockout-Mausmodellen von fast jedem neurodegenerative und neurologische Krankheiten hergestellt. Dies hat Übersetzung von elektrophysiologischen Forschungstechniken zuvor in größeren Nagetieren zur Maus-Tiermodell verwendet wird, bedingt. Ein solcher neurophysiologische Untersuchung Technik ist die Verwendung Langzeitpotenzierung (LTP), die Wirksamkeit der synaptischen Verbindungen im neuronalen Netzwerken in verschiedenen neuropathologischen Störungen beteiligt testen. Dieses Protokoll beschreibt Techniken für zuverlässige elektrophysiologische Untersuchung von LTP in frei verhalten Mäusen. Der Vorteil dieses Protokolls über andere ist, dass es einfach und leicht zu implementieren, es ist auch eher weniger kostspielig, da es weder die Verwendung von teuren computergesteuerten Mikroantriebssystems oder Feldeffekttransistor headstages erfordern, und unseres Wissens ist die erste Video-Protokoll von chronischen elektrophysiologischen Ableitungen to studieren LTP in frei verhalten Mäusen. Zu diesem Zweck beschreiben wir in diesem Artikel einfache Methoden zur Untersuchung von Langzeit-Potenzierung im frei verhalten Mäusen. Diese Methoden leicht an transgenen und Knockout-Mausmodellen der neuropathologischen Störungen übersetzt werden.

<table><tbody><tr><td>Ketamin (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>10177</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin (20 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>33197</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazin (10 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>2177</td><td></td></tr><tr><td>Dentales Acrylpulver</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>1330CLR</td><td></td></tr><tr><td>Dental Acryl Flüssigkeit</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>1306CLR</td><td></td></tr><tr><td>Wolframdraht (0,127 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>TGW0515</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl-Injektionsschlauch (0,286 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>832400</td><td></td></tr><tr><td>Flunixin (50 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>14165</td><td></td></tr><tr><td>Epoxilyte</td><td>Superior Essex</td><td>EP 6001-M</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahldrahteinsatz (0,2 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>792900</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktisches Rahmengerät</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modell 902</td><td></td></tr><tr><td>Ear Cuffs (Ohrmuscheln)</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modell 921</td><td></td></tr><tr><td>Elektrophysiologischer Stimulator</td><td>Astro-Med, Inc.</td><td>S88</td><td></td></tr><tr><td>Digitales Oszilloskop</td><td>B K Precision Corp.</td><td>2542</td><td></td></tr><tr><td>Stromisolationseinheit</td><td>Astro-Med, Inc.</td><td>PSIU-6</td><td></td></tr><tr><td>Differenzverstärker</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>DAM-50</td><td></td></tr><tr><td>Kommutator</td><td>Kunststoffe One</td><td>SLC6</td><td></td></tr><tr><td>Dentalbohrer</td><td>Stoelting</td><td>58650</td><td></td></tr></tbody></table>

langzeit-potenzierung der perforant pathway-gyrus dentatus synapse in frei behaving mäuse

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Untersuchungen der Langzeit-Potenzierung der synaptischen Wirksamkeit, eine leistungsabhängige synaptische Phänomen mit Eigenschaften, die es attraktiv als potentielle zelluläre Mechanismus zugrunde liegende Lern-und Informationsspeicher machen, sind seit langem verwendet worden, um die Physiologie der verschiedenen neuronalen im Hippocampus, Amygdala aufzuklären und anderen limbischen und kortikalen Strukturen. In diesem Sinne, transgenen Mausmodellen für neurologische Erkrankungen stellen nützliche Plattformen, um Langzeit-Potenzierung (LTP) Studien durchzuführen, um ein besseres Verständnis der Rolle von Genen in normalen und abnormalen synaptische Kommunikation in neuronalen Netzwerken in Lernen, Emotion und Information beteiligt entwickeln Verarbeitung. Dieser Artikel beschreibt Methoden für die Induktion von LTP zuverlässig in der frei verhalten Maus. Diese Methoden können in den Studien von transgenen verwendet werden und Knockout Mausmodelle verhalten frei von neurodegenerativen Erkrankungen.

Tabelle 1 zeigt die Koordinaten für DG und mPP wie in diesem Protokoll verwendet 1A zeigt die Markierungen für die Zielstrukturen auf den Schädel;.. Auch gezeigt, sind die Lage der Boden-und Referenzelektroden 1B zeigt repräsentativ hervorgerufene Reaktion zeichnet sowohl vor und posttetanization im gleichen Tier. Beachten Sie, dass die posttetanization evozierte Antwort größer als der pretetanization Antwort, die anzeigt, Induktion von LTP 2 ist. 1C<...

Transgene und Knockout-Mausmodellen von neurologischen Erkrankungen nützlich sind für die Untersuchung der Rolle von Genen in normalen und abnormalen Neurophysiologie. Dieser Artikel beschreibt Methoden, die verwendet werden können, um Langzeit-Potenzierung, eine zelluläre Mechanismus, Lernen und Gedächtnis zugrunde liegen, in transgenen und Knockout frei verhalten Maus-Modellen der Neuropathologie studieren.

Langzeit-Potenzierung der perforant Pathway-Gyrus dentatus Synapse in Frei Behaving Mäuse

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Aufzeichnung von LTP in einem frei verhaltenden Mausmodell zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Mikroelektroden im Perforierten Pfad und im Gyrus dentatus chirurgisch implantiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die basale evozierte Antwort im Gyrus dentatus als Reaktion auf Einzelpulsstimulation des perforierten Pfads aufzuzeichnen.Anschließend wird eine LTP nach einer tetanisierenden Stimulationsprotokoll induziert. Der letzte Schritt besteht darin, postsynaptische Antworten aufzuzeichnen und mit den Basiswerten zu vergleichen. Letztendlich erhöhte Amplitude des Populations-Spike.Maße der evozierten Antwort werden verwendet, um die sukzessive Induktion von LTP zu zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der in-vitro-Schnittpräparation besteht darin, dass das frei bewegliche Mausmodell die physiologisch relevanteste Plattform bietet, um die Wirkungen von neuropharmakologischen Substanzen oder genetischen Manipulationen an tierischen Modellen menschlicher neurologischer Erkrankungen zu testen. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie das Fell auf dem Kopf der Maus von dem Bereich direkt über den Augen bis knapp vor den Ohren rasieren; achten Sie darauf, die Schnurrhaare nicht zu rasieren, da sie Teil des sensorischen Barrel-Systems der Maus sind.Reinigen Sie als Nächstes den rasierten Bereich zuerst mit Isopropylalkohol, dann mit Betadine, und tragen Sie anschließend mit Wattestäbchen eine kleine Menge Mineralöl auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Überführen Sie die Maus in die stereotaktische Vorrichtung. Verwenden Sie statt der regulären Ohrstangen Ohrklemmen für Säuglingsratten, um den Kopf des Tieres zu befestigen, indem Sie zuerst das linke Ohr auf die linke Ohrklemme setzen.Dann das rechte Ohr vorsichtig auf die rechte Manschette schieben, indem man den Kopf des Tieres mit einer Hand stützt und die Ohrmanschette mit der anderen Hand voranschiebt. Anschließend eine Heizplatte unter den Körper des Tieres legen und auf 86 Grad Fahrenheit einstellen, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Danach die bilaterale Starrheit überprüfen, indem versucht wird, den Kopf seitlich zu bewegen. Das Tier ist korrekt am stereotaktischen Rahmen befestigt, wenn der Kopf starr ist und sich nicht seitlich bewegen lässt, sich aber leicht nach oben und unten drehen kann.Legen Sie anschließend die Schnauze der Maus auf die Zahnhalterung und stellen Sie sicher, dass die Schneidezähne sanft, aber sicher in der Zahnöffnung der Zahnhalterung liegen. Führen Sie mit einem sterilen Skalpell einen medianen Schnitt aus, beginnend von der Mitte zwischen den Augen bis zur Mitte der Ohren. Achten Sie darauf, dass das Skalpell in einem Winkel von 45 Grad gehalten wird und ausreichender Druck ausgeübt wird, um die darunterliegende Faszie zu durchtrennen, jedoch nicht den Schädel, da dies zu stärkerer Blutung führen würde.Verwenden Sie dann Wattestäbchen, um die Faszie zu lösen, und gebogene Hämostasen, um den Schädel freizulegen. Die Schädelmarkierungen bgma und Lambda sollten deutlich sichtbar sein. Stellen Sie sicher, dass der Schädel des Tieres waagerecht ausgerichtet ist, indem Sie die Zahnhalterung so justieren, dass bgma und Lambda in derselben DV-Position liegen.Als Nächstes reinigen Sie den freigelegten Schädel mit einer kleinen Menge steriler Kochsalzlösung und warten Sie zwei bis drei Minuten, bis der Schädel vollständig an der Luft getrocknet ist, bevor Sie fortfahren. Danach befestigen Sie eine Nadel am linken stereotaktischen Arm. Zur Messung der DV-Positionen von bgma und Lambda.Stellen Sie sicher, dass sie sich innerhalb von 0,1 Millimeter zueinander befinden. Andernfalls justieren Sie die Nasenstange des stereotaktischen Rahmens nach oben oder unten, um dies zu erreichen. Positionieren Sie dann die Nadel auf B bgma und notieren Sie deren AP-L-A-T-N-D-V-Messwerte.Stellen Sie sicher, dass die Nadel gerade die Schädeldecke berührt und nicht in sie eindringt. Verwenden Sie einen Maus-Hirnatlas, um die Koordinaten der Zielstrukturen relativ zu Lambda und bgma zu bestimmen. In unserem Fall handelt es sich um den medialen perentalen Pfad im angular bundle und den Gyrus dentatus des Hippocampus.Markieren Sie diese Punkte anschließend mit einem feinen Stift oder Bleistift am Schädel. Danach kennzeichnen Sie zwei weitere Punkte auf der kontralateralen Seite des Schädels. Diese Punkte, die als Erdung dienen werden, sollten etwa drei Millimeter von der Mittellinie entfernt sein und zueinander longitudinal ausgerichtet liegen.Entfernen Sie danach den Nadelmarkierer vom linken stereotaktischen Arm und ersetzen Sie ihn durch einen elektrischen Zahnbohrer, der mit einer stereotaktischen Halterung ausgestattet ist. Positionieren Sie den Bohrer über jedem markierten Punkt und bohren Sie kleine Mulden von etwa 0,5 Millimeter Durchmesser. Verwenden Sie beim Bohren eine wiederholte Auf-und-ab-Bewegung, und prüfen Sie regelmäßig, ob der Bohrer den Schädel durchdrungen hat, um die Gehirnoberfläche freizulegen. Treiben Sie dann vorsichtig, aber fest eine Schraubenelektrode in jede der kontralateralen Bohrungen ein, sodass diese gerade die kortikale Oberfläche berührt, ohne sie zu durchdringen.Diese beiden Schraubenelektroden dienen als Masse und Referenz. Anschließend befestigen Sie die stimulierende und die Ableitelektrode in den Elektrodenhaltern an den linken bzw. rechten stereotaktischen Armen. Danach verbinden Sie die Anschlüsse der stimulierenden Elektrode mit einem elektrophysiologischen Stimulator mit Stromisolation und den Anschluss der Ableitelektrode mit einem elektrophysiologischen Differenzverstärker und anschließend mit einem digitalen Oszilloskop zur visuellen Überprüfung der evozierten Antworten.Als Nächstes verbinden Sie die Erdungs- und Referenzelektrodenanschlüsse mit dem Differenzverstärker und senken Sie die Stimulations-Elektrode langsam und vorsichtig in 0,5-Millimeter-Schritten entlang der medialen Perran-Bahn und die Ableitelektrode in den Gyrus dentatus ab. Überwachen Sie mithilfe des Oszilloskops die evozierte Antwort auf einen einzelnen Reizimpuls. Setzen Sie das schrittweise Absenken der Elektroden fort, bis die jeweiligen Ziel-TV-Positionen erreicht sind und ein typisches Signal auf dem Oszilloskop erscheint. Verwenden Sie zahnmedizinischen Kunststoffzement, um eine Kappe anzufertigen, die die Elektrodenanschlüsse an ihrem Platz hält.Jeglicher Zahnzement, der die Haut berührt, sollte sofort abgewischt werden. Sobald der Zahnzement vollständig ausgehärtet ist, überführen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen in einen sauberen Nagetierkäfig und verwenden Sie eine Wärmelampe oder eine Heizplatte, um die Kerntemperatur aufrechtzuerhalten. Überwachen Sie das Tier stündlich, bis es das Bewusstsein wiedererlangt. Eine Injektion von Fuxin kann als Analgetikum verabreicht werden, nachdem das Tier sich fünf bis sieben Tage lang von der Operation erholt hat. Stellen Sie es in die Aufnahmeumgebung, die aus einer mit schallisolierendem Material ausgestatteten Faraday-Kabine und einem Fünf-Kanal-Drehkommulator besteht, der mit der Elektrode verbunden ist, die zur stimulierenden Aufnahmeeinrichtung führt. Lassen Sie das Tier sich ein bis zwei Stunden lang an die Aufnahmeumgebung gewöhnen, bevor Sie die Elektroden mit den Stimulations- und Aufnahmegeräten verbinden.Als Nächstes stellen Sie die Stimulatoreinstellungen auf eine Ausgabe von 400 Mikroampere ein. Notieren Sie die Amplitude eines Durchschnitts von 10 evozierten Antworten, wobei zwischen den Reizen jeweils mindestens 10 Sekunden vergehen sollten, und wiederholen Sie dieses Verfahren für 600, 800, 1000, 1200 und 1400 Mikroampere. Anschließend verwenden Sie die in dieser Abbildung dargestellte Methode, um die Amplitude der evozierten Antworten zu quantifizieren.Erstellen Sie eine Input-Output-Kurve, indem Sie die durchschnittliche Amplitude der evozierten Antwort in Abhängigkeit von der Reizintensität auftragen. Bestimmen Sie anschließend die Reizintensität, die 50 % der maximal gemessenen Amplitude entspricht, und verwenden Sie diese Intensität für den weiteren Verlauf des Experiments. Erheben Sie nun eine Basislinie, indem Sie die durchschnittliche Amplitude von fünf evozierten Antworten pro Minute über einen Zeitraum von 15 Minuten aufzeichnen, wobei zwischen den Reizen jeweils mindestens 10 Sekunden vergehen.Leiten Sie anschließend die Titanic-Stimulation an den medialen perentalen Pfad weiter. Überwachen Sie in der Zwischenzeit das Tier sorgfältig auf Anzeichen eines Anfalls, einschließlich nasser Hundeschütteln. Falls das Tier einen Anfall erleidet, sollte das Experiment beendet werden und alle Daten dieses Tieres aus den Studienergebnissen ausgeschlossen werden.Notieren Sie anschließend für 30 Minuten lang jede Minute die durchschnittliche Amplitude von fünf hervorgerufenen Antworten. Danach vergleichen Sie diese Amplitude mit der zuvor ermittelten Basislinienamplitude, indem Sie die prozentuale Änderung gegenüber der Basislinie berechnen. Hier gezeigt ist die schematische Darstellung der relativen Position der Elektroden auf dem Schädel einer Maus sowie typische Aufzeichnungen der hervorgerufenen Antworten sowohl vor als auch nach der ization.Diese Abbildung zeigt die LTP-Induktion an der medialen peripheren Pfad-Dentatgyrus-Synapse eines frei verhaltenden Mäuses, sobald die Methode beherrscht ist. Bei korrekter Durchführung kann diese Technik innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden. Während des Verfahrens ist es wichtig, das Tier regelmäßig zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die Anästhesietiefe aufrechterhalten wird.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine stereotaktische Operation durchführt, um Mikroelektroden chronisch zu implantieren, die anschließend verwendet werden, um die langzeitpotenzierung (LTP) bei frei beweglichen Mäusen aufzuzeichnen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Behavior

Verhalten

Dieser Artikel beschreibt Verfahren zur Herstellung von Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für die Untersuchung der synaptischen Veränderungen mit Gehirn Altern und altersbedingte neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit.

Vorbereitung der akuten Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für das Studium der Synaptic Veränderungen während des Alterns und Amyloid-Pathologie

Quelle: Zhao, Z. et al. Eine invasive Methode zur Aktivierung des Gyrus dentatus der Maus durch hochfrequente Stimulation. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt das Protokoll für die Verabreichung einer hochfrequenten tiefen Hirnstimulation an einen Gyrus dentatus der Maus im Hippocampus und beschreibt seine Auswirkungen auf die neuronale Aktivierung, die synaptische Plastizität und die Neurogenese.

Hochfrequente Stimulation zur Verbesserung der neuronalen Aktivierung und Neurogenese im Gyrus dentatus der Maus

Dieser Beitrag stellt eine komplette Methode für die Vorbereitung und die...

Verbesserte Zubereitung und Konservierung von Hippocampus Maus Slices für eine sehr stabile und reproduzierbare Erfassung der Langzeit-Potenzierung

Die Slice-Patch-Clamp-Technik ist eine wirksame Methode zur Analyse von lernen-induzierte Veränderungen der inhärenten Eigenschaften und Plastizität der erregenden oder hemmenden Synapsen.

Slice-Patch-Clamp-Technik für die Analyse von Learning-induzierte Plastizität

Dieses Protokoll zeigt, wie eine zuverlässige HFS-Methode bei Mäusen einrichten. Neuronen in der hippocampal dentate Gyrus werden durch HFS direkt und indirekt in Vivoelektrisch stimuliert. Neuronale Aktivität und molekulare Signale werden vom c-fos und Notch1 immunofluorescent Färbung, geprüft; Neurogenese wird durch Bromodeoxyuridine Assay Kennzeichnung quantifiziert.

Eine Invasive Methode zur Aktivierung der Maus Dentate Gyrus durch hochfrequente Stimulation

Diese Methode beschreibt eine chronische Zubereitung, die den optischen Zugang zum Hippocampus lebender Mäuse ermöglicht. Dieses Präparat kann verwendet werden, um längsinale optische Bildgebung der neuronalen strukturellen Plastizität und aktivitätsbeschworenen zellulären Plastizität über einen Zeitraum von mehreren Wochen durchzuführen.

Längs-Zwei-Photon-Bildgebung des Dorsal Hippocampal CA1 in lebenden Mäusen

Wir verwendeten Aufnahme- und Stimulationselektroden in Längs-Hippocampus-Gehirnscheiben und längs positionierten Aufnahme- und Stimulationselektroden im dorsalen Hippocampus in vivo, um extrazelluläre postsynaptische Potenziale zu evozieren und langfristige synaptische Plastizität entlang des Längsinterlamellars CA1.

Untersuchung der langfristigen synaptischen Plastizität im Interlamellar Hippocampus CA1 durch elektrophysiologische Feldaufzeichnung

Dieser Artikel zielt darauf ab, ein systematisches Protokoll zu beschreiben, um horizontale Hippocampus-Gehirnscheiben bei Mäusen zu erhalten. Das Ziel dieser Methode ist es, die Integrität von Hippocampus-Faserwegen zu erhalten, wie dem Perforantenweg und dem moosigen Fasertrakt, um dentate Gyrus-bezogene neurologische Prozesse zu bewerten.

Horizontale Hippocampal Scheiben der Maus Gehirn

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion der langfristigen Plastizität der neuronalen intrinsischen Erregbarkeit in Relaisneuronen aus dem dorsalen lateralen Genikulatkern, der in ex vivo Hirnschnitten erhalten bleibt.

Induktion der Langzeitplastizität der intrinsischen neuronalen Erregbarkeit in Neuronen des dorsalen lateralen Genikulatkerns

Laufaktivität (LMA) ist eine einfache und leicht durchgeführt Messung des Verhaltens bei Mäusen. Kopplung von Video-Tracking-Software (VTS) und LMA ermöglicht die Verbesserung der Spezifität und Sensitivität, vor allem, wenn mit dem Handbuch, Linie überqueren Methode der LMA Analyse verglichen. Zusätzlich VTS ermöglicht langfristige Verfolgung von Maus LMA.

Maus Kurz-und Langzeit-Bewegungsaktivität von Video-Tracking-Software analysiert

Erfahren Sie die Aufzeichnung von Langzeit-Potenzierung in frei beweglichen Mäusen durch chirurgische Mikroelektroden-Implantation. Diese Methode ermöglicht neurophysiologische Studien zu Lernen und Gedächtnis.

Langzeit-Potenzierung der perforant Pathway-Gyrus dentatus Synapse in Frei Behaving Mäuse

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