Hohe Auflösung Ganze Berge

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die räumlich-zeitliche Expression spezifischer Gene von Interesse in stadienartigen Zebrafischembryonen zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst CD-NA-Sonden erzeugt werden, indem Digo-Sauerstoff in verknüpfte Nukleotide mittels In-vitro-Transkription eingebaut wird. Anschließend werden die Embryonen in definierten Entwicklungsstadien entnommen.

Die Hornhaut wird entnommen und die Embryonen werden in Methanol bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Nach der Verdauung und nach der Fixierung werden die Embryonen mit den entsprechenden Sonden hybridisiert. Schließlich werden die Embryonen mit dem Antide-Gen und Antikörpern gefärbt und das Signal mit Substraten für die alkalische Phosphatase entwickelt.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Gewebeverteilung der Genexpression in einem bestimmten Entwicklungsstadium durch Whole Mount in situ Hybridisierung und Bildgebung zeigen. Obwohl diese Methode viel bessere Einblicke in die normale Expression des Zielgens liefern kann, kann sie auch auf andere Erkrankungen angewendet werden, wie z. B. die Expression von Zielgenen im Krankheitsmodell und wenn andere Gene über- oder unterexprimiert werden. Unter Verwendung der Mikroinjektionstechnologie Unter Verwendung von CDNA für ein Gen von Interesse wird eine RNA-Markierungsreaktion zur Synthese von Digo-Sauerstoff in markierten RNA-Sonden in einem RNA-freien Reaktionsfläschchen eingerichtet, indem ein bis fünf Mikrogramm gereinigte Template-DNA zu sterilen RNAs hinzugefügt werden, die frei von behandeltem, doppelt destilliertem Wasser bis zu einem Volumen von 13 Mikrolitern sind.

Die Reaktion auf Eis abkühlen lassen und die folgenden Reagenzien hinzufügen, nachdem die Zentrifuge vorsichtig 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur mit 2000 U/min gemischt wurde, bevor die Reaktion nach der Inkubation zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert wurde. Entfernen Sie die Matrizen-DNA, indem Sie zwei Mikroliter freie RNAs hinzufügen. DNAs inkubieren 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und stoppen die Reaktion durch Zugabe von zwei Mikrolitern 0,2 molaren EDTA, fällen die Reaktionsprodukte durch Zugabe von 2,5 Mikrolitern viermolaren Lithiumchlorid und 75 Mikrolitern 100%igem Ethanol aus. Mischen Sie die Lösung und inkubieren Sie sie 45 Minuten lang oder über Nacht bei minus 20 Grad Celsius.

Zentrifugieren Sie die Suspension 30 Minuten lang bei 13.000 U/min und vier Grad Celsius. Waschen Sie das Pellet dann mit eiskaltem, 70%igem Ethanol, nachdem Sie es 10 Minuten lang geschleudert haben. Trocknen Sie das Pellet vor der Reanimation zwei Minuten lang und suspendieren Sie es in 50 Mikrolitern Nuklease und freiem doppelt destilliertem Wasser.

Dann 30 Minuten inkubieren. Lassen Sie die Sonde bei 37 Grad Celsius etwa 30 Minuten lang ein bis zwei Mikroliter der Sonde auf einem 1%aros-Gel laufen, um ihre Qualität und Integrität zu überprüfen. Verwenden Sie dann ein Spektralphotometer, um die Sonde zu quantifizieren, um zuvor fixierte und eingefrorene Embryonen zu rehydrieren.

Beginnen Sie mit der Herstellung von Körben, indem Sie die konischen Enden von 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen abschneiden. Entfernen Sie dann bei der Hälfte die oberen Felgen. Schneiden Sie kleine Stücke Nylonnetz ab, um die Enden zu bedecken, und erhitzen Sie dann in ein paar Hauben die Rohrenden auf einer elektrischen Heizplatte und drücken Sie sie nach dem Abkühlen in das Netz.

Entfernen Sie das überschüssige Nylonnetz und lagern Sie die Körbe in 100% Methanol bei Raumtemperatur. Nach der Vorbereitung einer sukzessiven Verdünnung von Methanol in PBS gemäß dem Textprotokoll und der Zugabe von jeweils vier Millilitern in die Vertiefungen einer Schale mit sechs Vertiefungen legen Sie die Embryonen in einzelne Körbe für jede Sonde und inkubieren sie in der Methanol-PBS-Serie für fünf Minuten pro Vertiefung, die mit drei Waschgängen in PBST endet. Permieren Sie die Embryonen mit Proteinase K bei Raumtemperatur unter Verwendung der folgenden Inkubationszeiten pro Entwicklungsstadium.

Fixieren Sie dann die Embryonen 20 Minuten lang in 4%-Paraformaldehyd in PBS und waschen Sie sie dreimal für jeweils fünf Minuten in PBST. Bereiten Sie anschließend die Acetylierungsmischung gemäß dem Textprotokoll vor und inkubieren Sie die Embryonen zweimal für jeweils 10 Minuten. Waschen Sie dann die Embryonen und PBST zweimal für jeweils 10 Minuten.

Übertragen Sie die Embryonen in sterile Mikroröhrchen und inkubieren Sie sie mit 200 Mikrolitern Hybridisierungsmischung oder HM in einem 70 Grad Celsius warmen Wasserbad für zwei bis vier Stunden. Geben Sie 100 bis 200 Nanogramm Sonde in die Lösung und inkubieren Sie sie über Nacht bei 70 Grad Celsius in einem Wasserbad. Ersetzen Sie die Sondenlösung durch vorgewärmtes HM und inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei 70 Grad Celsius.

Nachdem Sie die Proben einer H-M-S-S-C-Serie unterzogen und die Embryonen gemäß dem Textprotokoll blockiert haben, inkubieren Sie die Embryonen in einer Verdünnung von ein bis 5.000 Grad Anti-D-AP-Antikörper in einem Blockierungspuffer über Nacht bei vier Grad Celsius und sanftem Rühren am nächsten Tag. Waschen Sie die Embryonen sechsmal für jeweils 15 Minuten. Nachdem Sie die Embryonen vorgefärbt haben, inkubieren Sie sie in BCIP und NBT.

Im Dunkeln 30 Minuten lang Raumtemperatur erhitzen. Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Färbereaktion alle 30 Minuten zu überwachen, um die Reaktion zu stoppen. Übertragen Sie die Körbe mit den Embryonen zweimal für jeweils 10 Minuten unter leichtem Rühren in Vertiefungen mit der Stopplösung.

Nach der Nachfixierung der Embryonen mit 4%para-Formaldehyd in PBS für 20 Minuten. Montieren Sie die Embryonen, indem Sie sie in so wenig PBS wie möglich auf Sechs-Well-Platten mit 100 % Glycerin übertragen. Wiegen Sie die Embryonen vorsichtig im Dunkeln bei Raumtemperatur, über Nacht in 100%igem Glycerin unter einem Stereomikroskop aufnehmen.

Repräsentative Beispiele für die Färbung von situ zu Hybridisierung sind hier dargestellt. Die violette Färbung, die nach der Hybridisierung mit der interessierenden Ribosonde beobachtet wurde, repräsentiert sowohl die Häufigkeit als auch die Expressionsorte eines bestimmten Gens. Zum Beispiel zeigt PC 5.1 24 Stunden nach der Befruchtung eine sehr diskrete Expression innerhalb des vorderen und hinteren Teils des otischen Vesikels und der primordialen Seitenlinie und ist 72 Stunden nach der Befruchtung stark in den Neuromasten der vorderen und hinteren Seitenlinie lokalisiert.

Im Gegensatz dazu zeigt PC 5.2 eine ubiquitäre Expression innerhalb des ZNS mit deutlicher Regionalisierung innerhalb des Somiten otischen Vesikels und des Ductus frica in Bauchlage und ist 96 Stunden nach der Befruchtung in Leber und Darm stark exprimiert. Das Fehlen einer Genexpression bei Verwendung der entsprechenden Sense-Ribo-Sonden dient als Negativkontrolle, wie hier zu sehen. Expressionsanalysen von Blutmarkern zeigten eine Färbung von SCL T one innerhalb der bilateralen Schädelzellen und in der intermediären Zellmasse (ICM).

Obwohl die Färbung für gata one auch im ICM zu sehen ist, ist das Expressionsmuster anders. Die Expression von F-L-K-K-D-R-L wurde innerhalb der Haupt- und Intersegmentalgefäße des Hinterhirns beobachtet, und im ICM wurde eine Färbung für Sonic Hedgehog im Nocord beobachtet. In diesen Beispielen ist die Expression von DLX zwei 34 Stunden nach der Befruchtung im Talon Cephalon Hypothalamus und Cranio mesenchymale Bögen und im FK D sieben Fox lokalisiert, eine Eins-Expression 24 Stunden nach der Befruchtung ist hauptsächlich in der Bodenplatte und der HypoChlor-Expression zu sehen.

Die Muster der Pankreasmarker zeigten eine Insulinfärbung in der endokrinen Bauchspeicheldrüse und Trypsin in der exokrinen Bauchspeicheldrüse. Die Ergebnisse, die Expressionsmuster mit hoher Auflösung zeigen, bestätigen den Erfolg des skizzierten Protokolls zum Nachweis der Expression von Genen mit hoher und niedriger Abundanz. Hier sind einige Beispiele aus Experimenten, die unter optimalen Bedingungen durchgeführt wurden.

Zum Beispiel resultierte ein hohes Hintergrundsignal mit schlechter Sonic Hedgehog-Expression aus unzureichender, durchlässiger und Hybridisierung zwischen 55 und 60 Grad Celsius. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Ganzmontage in zwei Hybridisierungen von Zebrafischembryonen unter Verwendung von grabenmarkierten RNA-Sonden, der Färbung nach der Hybridisierung und der Bildgebung durchführen.