Name: Die Lebensfähigkeit Assays für Zellen in Kultur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Lernen Sie multiple Lebensfähigkeitsassays für Zellen in Kultur durch ATP-Messung, Immunfärbung und Infrarot-Bildgebung. Diese Methoden ermöglichen eine objektive Bewertung zellulärer Struktur und Funktion.

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Wir erkennen Juliann Jaumotte für die Idee des Sparens auf die Volumina der Reagenzien in der ATP-Assay. Wir sind zutiefst dankbar für die hervorragende administrative Unterstützung der Maria Caruso, Deb Willson, und Jackie Farrer und an die Mylan Schule der Apotheke für die finanzielle Unterstützung für diese Studien. Dank gebührt auch den Hunkele gefürchtete Krankheiten Stiftung und die Parkinson und Bewegungsstörungen Stiftung für die finanzielle Unterstützung der primären neuronalen Studien.

Keiner der Autoren haben alle Konflikte offen zu legen.

Wir haben gefunden, dass die Signalstärke in allen drei Lebensfähigkeitstests ist linear und mit Beschichtungs-Dichte korreliert. Jedoch nicht alle Assays sind gleichermaßen empfindlich auf das 2-fache bzw. 1,5-fache Veränderungen Plattierungsdichte. Für N2a-Zellen, die Infrarot-Tests sind weniger empfindlich als die ATP-Assay, insbesondere bei niedrigeren Beschichtungsdichten. Obwohl die Infrarot-Tests sind weniger empfindlich als ATP, die DRAQ5 + Sapphire-Assays und die α-Tubulin-Assays sind in guter Übereinstimmung, ...

Die häufigste Lebensfähigkeitstest in den biologischen Wissenschaften beinhaltet Zellzahlen. Dies wird durch eine Analyse der Top (jüngste) 200 Publikationen, die in PubMed mit einem der Schlüsselwörter &quot;in vitro&quot; oder &quot;Kultur&quot; auf 2013.04.29 und 2013.04.30 erschien belegt. Von diesen Publikationen, 23,5% verwendeten Zellzahl-Assays, einschließlich der manuellen Zellzahl zählt, zählt die automatisierte Zellzahl mit Imaging-Software, und Trypanblau-Ausschluss. Die Live / Dead-Assay wurde in 1% dieser Publikationen verwendet. Die Anzahl von Publikationen mit dem MTT (3 - (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-Assay für metabolische Lebensfähigkeit betrug 11%. Dieser Überblick über die Literatur zeigt auch, dass die Anzahl von Publikationen mit dem MTT-Assays, wie in Verbindung mit der Zellzahl Assays war nur 3,5%. Trotz der Trend zu einer Lebensfähigkeitstest für sich zu nutzen, die Beurteilung zelluläre Funktion in Kombination mit der Zellzahl scheint die beste Wahl für die Beurteilung der Zell integrity. Zellzahlen allein nicht ausreichend, da die verbleibenden Zellen nicht funktionell oder gesund, obwohl sie in der gut 1,2 vorhanden sind. Umgekehrt kann die funktionelle Maßnahmen wie ATP erhöhen oder verringern in Abwesenheit von parallelen Veränderungen in der Anzahl der Zellen. Die Entkopplung von Stoffwechselanzeigen von Zellzahl zeigt, dass ATP und MTT-Assays sollten niemals als alleinige Lebensfähigkeitstest verwendet werden. In dem vorliegenden Bericht werden drei Lebensfähigkeitstests, die sowohl zelluläre Strukturen und Stoffwechselfunktion Umfrage beschrieben, für eine umfassendere Sicht der zellulären Integrität als einem Test von selbst leisten können. Zwei unserer Tests erfordern eine Infrarotkamera, die Fluoreszenz misst in der 700 und 800 nm-Kanäle. Rauschen in dem Infrarot-Wellenlängen gering, was zu höheren Signal-zu-Rausch-Verhältnisse 3. Die Odyssee, die wir verwenden Imager hat einen 4,5 log Dynamikbereich und eine Bit-Tiefe von 16, Translating bis 2 16 oder 65536 Schattierungen von Infrarot. Dies kann zu einer 8-Bit-Farbbilderzeugung, die nur liefert 2 8 oder 256 Farbtöne für jede Wellenlänge gegenübergestellt werden. So hat 16-Bit-Bild feinere Auflösung. Es sei angemerkt, daß die ursprünglichen Infrarotbilder werden oft grünen (800 nm) und roten (700 nm) in veröffentlichten Berichten zur Darstellung pseudocolored werden. Odyssey Bildkameras werden häufig sowohl für die Western-Blot-und In-Cell Western 4-7 verwendet. In-Cell Western auf Formaldehyd-fixierten Zellen verwenden primären Antikörper gegen jedes Protein von Interesse und beschriften Sie sie wiederum mit Infrarot-Fluoreszenzsekundärantikörper. Diese Technik ist besonders nützlich für die Phosphorylierung Endpunkte 6 sein. In unserer In-Cell Western, färben wir feste Zellen Proteine ​​des Zytoskeletts α-Tubulin oder die neuronale Mikrotubuli-assoziierten Protein 2 (MAP2) in der 800 nm-Kanal. Diese Proteine ​​sind reich genug, um hohen Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erhalten. Wir unseren Platten in der 700 Fleck auchnm-Kanal für Kerne mit dem DRAQ5 Fleck und für das Cytoplasma mit der Sapphire Fleck. Sowohl die Proteine ​​des Zytoskeletts und die DRAQ5 + Sapphire Flecken spiegeln somit zelluläre Strukturen. Die dritte Lebensfähigkeitstest misst metabolische Funktion und wird als &quot;Zelltiters Glo&quot;. In diesem Luciferase-basierenden Assay werden Helligkeitswerte direkt proportional zu der ATP-Spiegel. ATP-Assays werden häufig verwendet, um lebensfähige Zellen zu quantifizieren 8-12. Einschließlich das Wort &quot;Titer&quot; im Namen des Assays ist jedoch etwas irreführend, da ATP Produktion pro Zelle als eine Funktion der Toxin-Behandlungen zu ändern und kann daher nicht immer im Verhältnis zu Zellzahl 8. ATP-Spiegel kann auch durch zirkadianen Rhythmen 13 und 14 durch Zellteilung und Zelldifferenzierung 15 betroffen sein. Dennoch ist die hier gezeigte ATP-Assay leicht durchzuführen und geeignet, da ATP ist ein robusteres Maß des metabolischenLebensfähigkeit 16-21, wenn nicht Nummer Zelle an sich. Verwendung dieses Tests als Ergänzung zu den Infrarot-In-Cell Western ergibt daher ein umfassenderes Bild der zellulären Integrität als jeder Test allein.

<table><tbody><tr><td>Zelltiter Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Kaufen Sie in Mengen von 100 ml und aliquotieren, anstatt die teurere Menge von 10 ml zu kaufen. Rekonstituierte, unbenutzte Reagenzien können bei -20 & Grad wieder eingefroren werden; C für mindestens 21 Wochen</td></tr><tr><td>18% Formalin</td><td>Thermo-Shandon</td><td>9990244</td><td>Der Kauf dieses Fixiermittels vermeidet das Abwiegen von Formaldehydpulvern und das Sieden der Lösung; die Exposition gegenüber Dämpfen wird dadurch minimiert</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>Es ist nicht unbedingt erforderlich, dies Formaldehydlösungen zuzusetzen, aber es verbessert das Aussehen der fixierten</td></tr><tr><td>Zellen Odyssey Block</td><td>LI-COR</td><td>927-40003</td><td>Dieses Fischserum kann in großen Mengen gekauft und bei -20 ° eingefroren werden. C für den Langzeitgebrauch</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21568</td><td>Wir lagern eine Stammlösung von 10% Triton-X 100 in sterilem Wasser bei 4 & Grad; C</td></tr><tr><td>Natriumphosphat Monobasisch</td><td>Fisher</td><td>S468</td><td>Man kann auch PBS-Tabletten oder 10x PBS-Lösungen kaufen, aber sie sind teurer</td></tr><tr><td>Natriumphosphat Dibasisch</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td>Siehe oben</td></tr><tr><td>Natriumazid (250x)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>7144.8-16</td><td>Kaufen Sie das Pulver nicht, da Natriumazid sehr giftig ist. Wir lagern alle unsere verwendeten Antikörper in 1x Natriumazid bei 4 μg; C, bis sie mit Ablagerungen kontaminiert werden</td></tr><tr><td>Maus-Anti-&Alpha;-Tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td>Dieser Antikörper ist teuer, kann aber stark verdünnt werden und ist hochspezifisch</td></tr><tr><td>Maus-Anti-MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942</td><td>Dieser Antikörper ist teuer, aber hochspezifisch (eine Voraussetzung für In-Cell-Western)</td></tr><tr><td>800 nm Ziegen-Anti-Maus-IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>Auch andere Unternehmen verkaufen Infrarot-Sekundärantikörper. Achten Sie darauf, die hochgradig kreuzadsorbierten Antikörper zu kaufen, und beachten Sie, dass die IgG-Konzentrationen je nach Quelle variieren können</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td>Diese Verbindung wurde früher von LI-COR in 1 mM verkauft</td></tr><tr><td>Saphir</td><td>LI-COR</td><td>928-40022</td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>PerkinElmer</td><td>VICTOR3 1420 Multilabel-Zähler</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Imager</td><td>LI-COR</td><td>9201-01</td><td></td></tr><tr><td>Schüttel-/Mischer-Forschungsprodukte</td><td>International</td><td>248555</td><td></td></tr></tbody></table>

die lebensfähigkeit assays für zellen in kultur

Viability Assays for Cells in Culture

Manuelle Zellzahlen auf einem Mikroskop sind ein empfindliches Mittel zur Bewertung zelluläre Lebensfähigkeit aber zeitaufwendig und daher teuer. Computergestützte Lebensfähigkeitstests sind teuer in Bezug auf Ausrüstung, aber schneller und objektiver als die manuelle Zellzahlen sein. Der vorliegende Bericht beschreibt die Verwendung von drei solcher Lebensfähigkeitstests. Zwei dieser Assays sind Infrarot und einem lumineszierend. Beide Infrarot-Assays basieren auf einer 16-Bit-Odyssey Imager. Eine Infrarot-Assay verwendet den Farbstoff für DRAQ5 Kernen kombiniert mit dem Saphir-Färbung für Cytosol und in den Kanal 700 nm sichtbar gemacht. Die andere Infrarot-Assay, ein In-Cell Western nutzt Antikörper gegen Proteine ​​des Zytoskeletts (α-Tubulin-oder Mikrotubuli-assoziierten Protein 2) und kennzeichnet sie in der 800 nm-Kanal. Die dritte Lebensfähigkeitstest ist eine häufig verwendete Leucht Assay für ATP, aber wir verwenden ein Viertel der empfohlenen Volumens um Kosten zu sparen. Diese Messungen sind lineare und korrelieren mit der Anzahl von cells zogen, aber unterschiedlich in der Empfindlichkeit. Alle drei Tests zu umgehen zeitraub Mikroskopie und probieren Sie die gesamte Wohl, wodurch Stichprobenfehler zu reduzieren. Schließlich können alle Assays leicht innerhalb eines Tages nach dem Ende des Experiments durchgeführt werden, so dass eine größere Anzahl von Versuchen, um in kurzen Zeiträumen durchgeführt werden. Sie beruhen jedoch alle auf der Annahme, dass die Zellzahlen im Verhältnis zur Stärke Signal nach Behandlungen, eine Annahme, die manchmal nicht erfüllt, insbesondere für zelluläre ATP bleiben. Außerdem, wenn Zellen zu erhöhen oder zu verringern in der Größe nach der Behandlung, könnte dies die Signalstärke beeinflussen, ohne die Zellzahl. Wir schließen daraus, dass alle Lebensfähigkeitstests, einschließlich Handbuch zählt, leiden unter einer Reihe von Vorbehalten, aber, dass computergestützte Lebensfähigkeitstests sind auch die anfängliche Investition wert. Mit allen drei Assays zusammen ergibt sich ein umfassendes Bild der zellulären Struktur und Funktion.

Der limitierende Faktor bei diesen Versuchen ist die Infrarot-Färbung, wie die ATP-Assay ist in relativ kurzer Dauer. Für die Infrarot-Assays, erwarten wir, dass acht 96-Well-Platten können durch die Staffelung der zwei Gruppen von je vier Platten gefärbt und gescannt werden innerhalb eines Tages (siehe Abbildung 1). Diese Schätzung geht davon aus, 20 min der Fixierung, 30 min Waschen, 30 min zu blockieren, 2 h Inkubation primärer Antikörper, gefolgt von 30 min von Waschanlagen, 1 Stunde sekundären Anti...

Therapeutische Verbindungen werden oft zunächst in vitro-Lebensfähigkeitstests untersucht. Blindzellzählungen durch einen menschlichen Betrachter sehr empfindlich auf kleine Änderungen in der Zellzahl, aber nicht beurteilen Funktion. Computergestützte Lebensfähigkeitstests, wie hier beschrieben, kann sowohl die Struktur und Funktion in einer objektiven Weise zu beurteilen.

Die Lebensfähigkeit Assays für Zellen in Kultur

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mehrere Vitalitätsassays durchzuführen, die gemeinsam einen umfassenderen Einblick in die zelluläre Fitness ermöglichen, als es ein einzelner Assay allein könnte. Dies wird erreicht, indem zunächst die ATP-Konzentration in angezüchteten Zellen gemessen wird, um die Stoffwechselfunktion zu beurteilen. Der zweite Schritt besteht darin, zytoskelettale Proteine wie Alpha-Tubulin oder Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 mit Infrarot-Antikörpern mit Wellenlängen von 800 Nanometern immunzufärben.Anschließend werden die Zellen mit Infrarot-DraC5 und Sapphire markiert, um den Zellkern und das Zytoplasma bei 700 Nanometern anzufärben. Der letzte Schritt besteht darin, Alpha-Tubulin bzw. MAP2 sowie DraC5 plus Sapphire bei den Wellenlängen 700 und 800 Nanometern auf einem Infrarot-Bildgebungsgerät abzubilden. Letztlich liefern diese lumineszenten und infraroten Nachweisverfahren Informationen sowohl über anatomische Strukturen als auch über physiologische Funktionen.Der Hauptvorteil dieser Techniken gegenüber etablierten Methoden wie dem MTT-Vitalitätsassay liegt in der schnellen und empfindlichen Messung mehrerer Aspekte der zellulären In

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Biologie

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Verbesserte Lebensfähigkeit für Ex vivo 3D Hydrogelkulturen von patientenabgeleiteten Xenografts in einer perfused Microfluidic Platform

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Zytotoxizitäts-Assays mit Zebrafisch-Zelllinien

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Ein optimierter LIVE/DEAD-Assay in Verbindung mit Durchflusszytometrie zur Quantifizierung des Post-Stress-Überlebens in Hefezellen

Lernen Sie multiple Lebensfähigkeitsassays für Zellen in Kultur durch ATP-Messung, Immunfärbung und Infrarot-Bildgebung. Diese Methoden ermöglichen eine objektive Bewertung zellulärer Struktur und Funktion.

Die Lebensfähigkeit Assays für Zellen in Kultur

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