Name: Die Lebensfähigkeit Assays für Zellen in Kultur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Lernen Sie multiple Lebensfähigkeitsassays für Zellen in Kultur durch ATP-Messung, Immunfärbung und Infrarot-Bildgebung. Diese Methoden ermöglichen eine objektive Bewertung zellulärer Struktur und Funktion.

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Wir erkennen Juliann Jaumotte für die Idee des Sparens auf die Volumina der Reagenzien in der ATP-Assay. Wir sind zutiefst dankbar für die hervorragende administrative Unterstützung der Maria Caruso, Deb Willson, und Jackie Farrer und an die Mylan Schule der Apotheke für die finanzielle Unterstützung für diese Studien. Dank gebührt auch den Hunkele gefürchtete Krankheiten Stiftung und die Parkinson und Bewegungsstörungen Stiftung für die finanzielle Unterstützung der primären neuronalen Studien.

Keiner der Autoren haben alle Konflikte offen zu legen.

Wir haben gefunden, dass die Signalstärke in allen drei Lebensfähigkeitstests ist linear und mit Beschichtungs-Dichte korreliert. Jedoch nicht alle Assays sind gleichermaßen empfindlich auf das 2-fache bzw. 1,5-fache Veränderungen Plattierungsdichte. Für N2a-Zellen, die Infrarot-Tests sind weniger empfindlich als die ATP-Assay, insbesondere bei niedrigeren Beschichtungsdichten. Obwohl die Infrarot-Tests sind weniger empfindlich als ATP, die DRAQ5 + Sapphire-Assays und die α-Tubulin-Assays sind in guter Übereinstimmung, ...

Die häufigste Lebensfähigkeitstest in den biologischen Wissenschaften beinhaltet Zellzahlen. Dies wird durch eine Analyse der Top (jüngste) 200 Publikationen, die in PubMed mit einem der Schlüsselwörter &quot;in vitro&quot; oder &quot;Kultur&quot; auf 2013.04.29 und 2013.04.30 erschien belegt. Von diesen Publikationen, 23,5% verwendeten Zellzahl-Assays, einschließlich der manuellen Zellzahl zählt, zählt die automatisierte Zellzahl mit Imaging-Software, und Trypanblau-Ausschluss. Die Live / Dead-Assay wurde in 1% dieser Publikationen verwendet. Die Anzahl von Publikationen mit dem MTT (3 - (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-Assay für metabolische Lebensfähigkeit betrug 11%. Dieser Überblick über die Literatur zeigt auch, dass die Anzahl von Publikationen mit dem MTT-Assays, wie in Verbindung mit der Zellzahl Assays war nur 3,5%. Trotz der Trend zu einer Lebensfähigkeitstest für sich zu nutzen, die Beurteilung zelluläre Funktion in Kombination mit der Zellzahl scheint die beste Wahl für die Beurteilung der Zell integrity. Zellzahlen allein nicht ausreichend, da die verbleibenden Zellen nicht funktionell oder gesund, obwohl sie in der gut 1,2 vorhanden sind. Umgekehrt kann die funktionelle Maßnahmen wie ATP erhöhen oder verringern in Abwesenheit von parallelen Veränderungen in der Anzahl der Zellen. Die Entkopplung von Stoffwechselanzeigen von Zellzahl zeigt, dass ATP und MTT-Assays sollten niemals als alleinige Lebensfähigkeitstest verwendet werden. In dem vorliegenden Bericht werden drei Lebensfähigkeitstests, die sowohl zelluläre Strukturen und Stoffwechselfunktion Umfrage beschrieben, für eine umfassendere Sicht der zellulären Integrität als einem Test von selbst leisten können. Zwei unserer Tests erfordern eine Infrarotkamera, die Fluoreszenz misst in der 700 und 800 nm-Kanäle. Rauschen in dem Infrarot-Wellenlängen gering, was zu höheren Signal-zu-Rausch-Verhältnisse 3. Die Odyssee, die wir verwenden Imager hat einen 4,5 log Dynamikbereich und eine Bit-Tiefe von 16, Translating bis 2 16 oder 65536 Schattierungen von Infrarot. Dies kann zu einer 8-Bit-Farbbilderzeugung, die nur liefert 2 8 oder 256 Farbtöne für jede Wellenlänge gegenübergestellt werden. So hat 16-Bit-Bild feinere Auflösung. Es sei angemerkt, daß die ursprünglichen Infrarotbilder werden oft grünen (800 nm) und roten (700 nm) in veröffentlichten Berichten zur Darstellung pseudocolored werden. Odyssey Bildkameras werden häufig sowohl für die Western-Blot-und In-Cell Western 4-7 verwendet. In-Cell Western auf Formaldehyd-fixierten Zellen verwenden primären Antikörper gegen jedes Protein von Interesse und beschriften Sie sie wiederum mit Infrarot-Fluoreszenzsekundärantikörper. Diese Technik ist besonders nützlich für die Phosphorylierung Endpunkte 6 sein. In unserer In-Cell Western, färben wir feste Zellen Proteine ​​des Zytoskeletts α-Tubulin oder die neuronale Mikrotubuli-assoziierten Protein 2 (MAP2) in der 800 nm-Kanal. Diese Proteine ​​sind reich genug, um hohen Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erhalten. Wir unseren Platten in der 700 Fleck auchnm-Kanal für Kerne mit dem DRAQ5 Fleck und für das Cytoplasma mit der Sapphire Fleck. Sowohl die Proteine ​​des Zytoskeletts und die DRAQ5 + Sapphire Flecken spiegeln somit zelluläre Strukturen. Die dritte Lebensfähigkeitstest misst metabolische Funktion und wird als &quot;Zelltiters Glo&quot;. In diesem Luciferase-basierenden Assay werden Helligkeitswerte direkt proportional zu der ATP-Spiegel. ATP-Assays werden häufig verwendet, um lebensfähige Zellen zu quantifizieren 8-12. Einschließlich das Wort &quot;Titer&quot; im Namen des Assays ist jedoch etwas irreführend, da ATP Produktion pro Zelle als eine Funktion der Toxin-Behandlungen zu ändern und kann daher nicht immer im Verhältnis zu Zellzahl 8. ATP-Spiegel kann auch durch zirkadianen Rhythmen 13 und 14 durch Zellteilung und Zelldifferenzierung 15 betroffen sein. Dennoch ist die hier gezeigte ATP-Assay leicht durchzuführen und geeignet, da ATP ist ein robusteres Maß des metabolischenLebensfähigkeit 16-21, wenn nicht Nummer Zelle an sich. Verwendung dieses Tests als Ergänzung zu den Infrarot-In-Cell Western ergibt daher ein umfassenderes Bild der zellulären Integrität als jeder Test allein.

<table><tbody><tr><td>Zelltiter Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Kaufen Sie in Mengen von 100 ml und aliquotieren, anstatt die teurere Menge von 10 ml zu kaufen. Rekonstituierte, unbenutzte Reagenzien können bei -20 & Grad wieder eingefroren werden; C für mindestens 21 Wochen</td></tr><tr><td>18% Formalin</td><td>Thermo-Shandon</td><td>9990244</td><td>Der Kauf dieses Fixiermittels vermeidet das Abwiegen von Formaldehydpulvern und das Sieden der Lösung; die Exposition gegenüber Dämpfen wird dadurch minimiert</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>Es ist nicht unbedingt erforderlich, dies Formaldehydlösungen zuzusetzen, aber es verbessert das Aussehen der fixierten</td></tr><tr><td>Zellen Odyssey Block</td><td>LI-COR</td><td>927-40003</td><td>Dieses Fischserum kann in großen Mengen gekauft und bei -20 ° eingefroren werden. C für den Langzeitgebrauch</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21568</td><td>Wir lagern eine Stammlösung von 10% Triton-X 100 in sterilem Wasser bei 4 & Grad; C</td></tr><tr><td>Natriumphosphat Monobasisch</td><td>Fisher</td><td>S468</td><td>Man kann auch PBS-Tabletten oder 10x PBS-Lösungen kaufen, aber sie sind teurer</td></tr><tr><td>Natriumphosphat Dibasisch</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td>Siehe oben</td></tr><tr><td>Natriumazid (250x)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>7144.8-16</td><td>Kaufen Sie das Pulver nicht, da Natriumazid sehr giftig ist. Wir lagern alle unsere verwendeten Antikörper in 1x Natriumazid bei 4 μg; C, bis sie mit Ablagerungen kontaminiert werden</td></tr><tr><td>Maus-Anti-&Alpha;-Tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td>Dieser Antikörper ist teuer, kann aber stark verdünnt werden und ist hochspezifisch</td></tr><tr><td>Maus-Anti-MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942</td><td>Dieser Antikörper ist teuer, aber hochspezifisch (eine Voraussetzung für In-Cell-Western)</td></tr><tr><td>800 nm Ziegen-Anti-Maus-IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>Auch andere Unternehmen verkaufen Infrarot-Sekundärantikörper. Achten Sie darauf, die hochgradig kreuzadsorbierten Antikörper zu kaufen, und beachten Sie, dass die IgG-Konzentrationen je nach Quelle variieren können</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td>Diese Verbindung wurde früher von LI-COR in 1 mM verkauft</td></tr><tr><td>Saphir</td><td>LI-COR</td><td>928-40022</td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>PerkinElmer</td><td>VICTOR3 1420 Multilabel-Zähler</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Imager</td><td>LI-COR</td><td>9201-01</td><td></td></tr><tr><td>Schüttel-/Mischer-Forschungsprodukte</td><td>International</td><td>248555</td><td></td></tr></tbody></table>

die lebensfähigkeit assays für zellen in kultur

Viability Assays for Cells in Culture

Manuelle Zellzahlen auf einem Mikroskop sind ein empfindliches Mittel zur Bewertung zelluläre Lebensfähigkeit aber zeitaufwendig und daher teuer. Computergestützte Lebensfähigkeitstests sind teuer in Bezug auf Ausrüstung, aber schneller und objektiver als die manuelle Zellzahlen sein. Der vorliegende Bericht beschreibt die Verwendung von drei solcher Lebensfähigkeitstests. Zwei dieser Assays sind Infrarot und einem lumineszierend. Beide Infrarot-Assays basieren auf einer 16-Bit-Odyssey Imager. Eine Infrarot-Assay verwendet den Farbstoff für DRAQ5 Kernen kombiniert mit dem Saphir-Färbung für Cytosol und in den Kanal 700 nm sichtbar gemacht. Die andere Infrarot-Assay, ein In-Cell Western nutzt Antikörper gegen Proteine ​​des Zytoskeletts (α-Tubulin-oder Mikrotubuli-assoziierten Protein 2) und kennzeichnet sie in der 800 nm-Kanal. Die dritte Lebensfähigkeitstest ist eine häufig verwendete Leucht Assay für ATP, aber wir verwenden ein Viertel der empfohlenen Volumens um Kosten zu sparen. Diese Messungen sind lineare und korrelieren mit der Anzahl von cells zogen, aber unterschiedlich in der Empfindlichkeit. Alle drei Tests zu umgehen zeitraub Mikroskopie und probieren Sie die gesamte Wohl, wodurch Stichprobenfehler zu reduzieren. Schließlich können alle Assays leicht innerhalb eines Tages nach dem Ende des Experiments durchgeführt werden, so dass eine größere Anzahl von Versuchen, um in kurzen Zeiträumen durchgeführt werden. Sie beruhen jedoch alle auf der Annahme, dass die Zellzahlen im Verhältnis zur Stärke Signal nach Behandlungen, eine Annahme, die manchmal nicht erfüllt, insbesondere für zelluläre ATP bleiben. Außerdem, wenn Zellen zu erhöhen oder zu verringern in der Größe nach der Behandlung, könnte dies die Signalstärke beeinflussen, ohne die Zellzahl. Wir schließen daraus, dass alle Lebensfähigkeitstests, einschließlich Handbuch zählt, leiden unter einer Reihe von Vorbehalten, aber, dass computergestützte Lebensfähigkeitstests sind auch die anfängliche Investition wert. Mit allen drei Assays zusammen ergibt sich ein umfassendes Bild der zellulären Struktur und Funktion.

Der limitierende Faktor bei diesen Versuchen ist die Infrarot-Färbung, wie die ATP-Assay ist in relativ kurzer Dauer. Für die Infrarot-Assays, erwarten wir, dass acht 96-Well-Platten können durch die Staffelung der zwei Gruppen von je vier Platten gefärbt und gescannt werden innerhalb eines Tages (siehe Abbildung 1). Diese Schätzung geht davon aus, 20 min der Fixierung, 30 min Waschen, 30 min zu blockieren, 2 h Inkubation primärer Antikörper, gefolgt von 30 min von Waschanlagen, 1 Stunde sekundären Anti...

Therapeutische Verbindungen werden oft zunächst in vitro-Lebensfähigkeitstests untersucht. Blindzellzählungen durch einen menschlichen Betrachter sehr empfindlich auf kleine Änderungen in der Zellzahl, aber nicht beurteilen Funktion. Computergestützte Lebensfähigkeitstests, wie hier beschrieben, kann sowohl die Struktur und Funktion in einer objektiven Weise zu beurteilen.

Die Lebensfähigkeit Assays für Zellen in Kultur

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mehrere Vitalitätsassays durchzuführen, die gemeinsam einen umfassenderen Einblick in die zelluläre Fitness ermöglichen, als es ein einzelner Assay allein könnte. Dies wird erreicht, indem zunächst die ATP-Konzentration in angezüchteten Zellen gemessen wird, um die Stoffwechselfunktion zu beurteilen. Der zweite Schritt besteht darin, zytoskelettale Proteine wie Alpha-Tubulin oder Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 mit Infrarot-Antikörpern mit Wellenlängen von 800 Nanometern immunzufärben.Anschließend werden die Zellen mit Infrarot-DraC5 und Sapphire markiert, um den Zellkern und das Zytoplasma bei 700 Nanometern anzufärben. Der letzte Schritt besteht darin, Alpha-Tubulin bzw. MAP2 sowie DraC5 plus Sapphire bei den Wellenlängen 700 und 800 Nanometern auf einem Infrarot-Bildgebungsgerät abzubilden. Letztlich liefern diese lumineszenten und infraroten Nachweisverfahren Informationen sowohl über anatomische Strukturen als auch über physiologische Funktionen.Der Hauptvorteil dieser Techniken gegenüber etablierten Methoden wie dem MTT-Vitalitätsassay liegt in der schnellen und empfindlichen Messung mehrerer Aspekte der zellulären Integrität. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Neurowissenschaften und Pharmakologie zu beantworten, beispielsweise, ob therapeutische Substanzen anatomische Strukturen und den Stoffwechsel schützen können. Beginnen Sie damit, Zellen in 100 oder 200 Mikroliter Medium bei variierenden Zelldichten in einer 96-Loch-Platte gemäß des begleitenden Protokolls zu gewinnen und erneut aufzuschwemmen; füllen Sie die umgebenden Vertiefungen mit 200 Mikroliter sterilem Wasser, um Randverdunstungseffekte zu verringern.Lassen Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem CO2-pufferten Inkubator andocken. Am nächsten Tag entfernen Sie 50 von den 100 Mikrolitern Medium oder 150 von den 200 Mikrolitern Medium, sodass jeweils 50 Mikroliter Medium in jedem Wells verbleiben. Geben Sie anschließend 25 Mikroliter des Cell Titer Glow-Reagenz in jeden der inneren Wells in den Spalten zwei bis sechs.Um eine Verdünnung von eins zu zwei in den Spalten sieben bis elf, Reihen B bis D zu erhalten, geben Sie 50 µL des Cell Titer Glow-Reagenz hinzu, um eine Verdünnung von eins zu eins in den verbleibenden Vertiefungen zu erreichen. Spalten sieben bis elf, Reihen E bis G. Entfernen Sie kein Medium, sondern fügen Sie stattdessen 100 µL Cell Titer Glow-Reagenz hinzu, um eine Verdünnung von eins zu eins bei einem Gesamtvolumen von 200 µL zu erhalten. Stellen Sie die Platte unverzüglich auf einen rotierenden oder orbitalen Schüttler und schütteln Sie 10 Minuten lang, um die Proben während der Inkubation zu vermischen.Übertragen Sie anschließend 60 Mikroliter von jedem Well in eine weißwandige 96-Well-Platte. Die Lumineszenzwerte sind in weißen Platten höher als in klaren oder schwarzen Platten, da sie das Licht nach oben in Richtung Detektor reflektieren. Sollten während der Übertragung Blasen entstehen, entfernen Sie diese mit Druckluft aus einer Kunststoff-Pipettierhilfe.Danach innerhalb von 12 Minuten nach Zugabe der Reagenzien die Platte auf ein Luminometer setzen und die Lumineszenzwerte ablesen. Die Lumineszenzwerte aus drei oder sechs Vertiefungen jeder Gruppe mitteln und als Funktion der Zellzahl darstellen; fortfahren mit der höchsten Verdünnung der Reagenzien, die noch lineare und proportionale Ergebnisse liefert, wie im begleitenden Text definiert. Dies spart Kosten für die Infrarot-Assays; Zellen ernten und wie im begleitenden textlichen Protokoll beschrieben in unterschiedlichen Dichten resuspendieren.Füllen Sie die umliegenden Vertiefungen mit 200 Mikrolitern sterilem Wasser, um die Auswirkungen von Temperaturgradienten und Verdunstung an den Rändern zu verringern. Lassen Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem CO2-gepufferten Inkubator ankleben und fixieren Sie die Zellen anschließend durch Zugabe von 100 Mikrolitern eines Fixierungsmittels, wie beispielsweise 4 % Formaldehyd und 4 % Saccharose in 0,1 molarer Phosphatpufferlösung. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 20 Minuten, entfernen Sie danach das Fixierungsmittel und waschen Sie die Zellen dreimal mit jeweils 200 Mikrolitern PBS.Als Nächstes verdünnen Sie die Blockierungslösung im Verhältnis 1:1 in PBS und geben 0,3 % Triton X-100 als zellpermeabilisierendes Mittel hinzu. Geben Sie dann 35 Mikroliter der Blockierungslösung in jede Vertiefung, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen in den Vertiefungen entstehen. Inkubieren Sie die Platte mit der Blockierungslösung 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur.Während dieser Inkubation verdünnen Sie die primären Antikörper für die Proteine von Interesse. Verdünnen Sie beispielsweise den Antifa-Tubulin-Primärantikörper im Verhältnis 1:10.000 in einer 1:1-Mischung aus Blockierpuffer und PBS mit 0,3 % TRITTON X 100, während Sie das Verfahren optimieren. Weitere Antikörperverdünnungen hier: Der Antifa-Tubulin-Primärantikörper wird ebenfalls im Verhältnis 1:5.000 in einer 1:1-Mischung aus Blockierpuffer und PBS mit 0,3 % Triton X 100 verdünnt.Fügen Sie anschließend die Antikörper in den hier angegebenen Konzentrationen zu den auf der Platte fixierten Zellen hinzu. Achten Sie darauf, die Negativkontroll-Löcher in Spalte zwei in der Blockierungslösung zu belassen, da sie nur den sekundären Antikörpern ausgesetzt werden. Inkubieren Sie die Zellen mit den primären Antikörpern eine bis zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius.Bereiten Sie anschließend die 800 Nanometer Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper vor, indem Sie diese im Verhältnis 1 zu 1000 oder 1 zu 2000 in einer 1:1-Mischung aus Blockpuffer und PBS mit 0,3 % Triton X-100 verdünnen, nachdem die Inkubation mit dem Primärantikörper erfolgt ist. Waschen Sie die Vertiefungen dreimal je 10 Minuten mit jeweils 200 Mikroliter PBS pro Vertiefung. Geben Sie danach 35 Mikroliter der Sekundärantikörper in die Vertiefungen.Fügen Sie die Verdünnung 1:1000 auf die obere Hälfte der Platte und die Verdünnung 1:2000 auf die untere Hälfte hinzu. Inkubieren Sie die Zellen eine Stunde bei Raumtemperatur mit den sekundären Antikörpern, wobei sie vor Licht geschützt werden müssen. Anschließend waschen Sie die nicht gebundenen sekundären Antikörper durch dreimaliges Waschen mit jeweils 200 µL PBS pro Mulde und einer Waschdauer von jeweils 10 Minuten ab.Verdünnen Sie anschließend den DRAC-Fünf-Stammlösung 1:10.000 auf eine Endkonzentration von 0,5 µM und die Sapphire-Stammlösung 1:1.000 in PBS mit 0,3 % Triton X-100. Geben Sie 35 µL dieses Gemischs auf die linke Hälfte der Platte, fügen Sie jedoch in die Negativkontroll-Löcher der Spalte zwei nichts hinzu. Für die rechte Hälfte der Platte geben Sie jeweils 35 µL DRAC Fünf im Verdünnungsverhältnis 1:20.000 und Sapphire im Verdünnungsverhältnis 1:2.000 hinzu.Die Proben 30 Minuten bei Raumtemperatur und im Dunkeln in diesen Lösungen inkubieren. Anschließend die Platte dreimal mit jeweils 200 µL PBS pro Mulde und jeweils 10 Minuten Waschdauer waschen. Beginnen Sie mit der Aufnahme der Platten im Infrarot-Imager bei einer Intensität von fünf und einer Auflösung von 169 µm.Einstellungen mittlerer oder niedriger Qualität sind ausreichend. Anschließend bei verschiedenen Fokusverschiebungen von 2,5 Millimetern, 3,0 Millimetern, 3,5 Millimetern und 4,0 Millimetern scannen, um festzustellen, bei welcher der höchste Signal-Rausch-Abstand und das schärfste Signal erreicht wird. Sobald die Fokusverschiebung optimiert ist, verwenden Sie die InCel-Western-Funktion in der Software, um ein Raster der passenden Größe auf das Bild der Platte zu legen, und exportieren Sie die Daten in Microsoft Excel.Subtrahieren Sie den Mittelwert der integrierten Intensitäten in den Negativkontrollgefäßen von jedem entsprechenden Datenpunkt in den Kanälen bei 700 und 800 Nanometer. Bilden Sie anschließend den Mittelwert der integrierten Signalintensitäten für jede Gruppe von Gefäßen und tragen Sie die Daten nach der Optimierung als Streudiagramm gegen die Zelldichte auf. Die Signalstärke in allen drei Assays zeigte eine signifikante Korrelation mit der Anzahl der Zellen pro Gefäß; obwohl alle drei Assays hochgradig linear waren, unterschieden sie sich hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit.Der ATP-Assay zeigte die höchste Empfindlichkeit der drei untersuchten Assays, definiert als die proportionalste Änderung des lumineszenten Signals bei Abnahme der Zellanzahl in primären neuronalen Rattenzellen. Die optimalen Reagenzkonzentrationen unterschieden sich, und die Assays zeigten eine geringere Linearität über den gesamten Messbereich hinweg. Beide Assays waren jedoch linear und empfindlich bei Ansiedlungsdichten unterhalb von 100.000 Zellen, wie hier dargestellt.Unsere Dosis-Wirkungs-Kurven von Neuroblastomzellen, die mit MG-132, einem Proteasomhemmer, behandelt wurden, zeigen, dass MG-132 in Anwesenheit oder Abwesenheit des Glutathionvorläufers N-Acetylcystein (NAC) appliziert wurde. N-Acetylcystein verschiebt alle drei Kurven nach rechts. Beispielsweise betrug die IC50, gemessen mittels DRAC5+ Sapphire, 1,64 µM MG-132 ohne N-Acetylcystein und 4,64 µM MG-132 in Gegenwart von N-Acetylcystein. Dies entsprach den Werten im Alpha-Tubulin-Assay mit 1,96 µM bzw. 6,35 µM MG-132.Jedoch stiegen die ATP-Konzentrationen bei niedrigen Konzentrationen von MG-132 an, ein Phänomen, das als Hormese bezeichnet wird. Diese Daten zeigen, dass die ATP-Konzentrationen nicht notwendigerweise proportional zur Zellzahl nach der Behandlung sind und dass N-Acetylcystein ebenfalls die Stoffwechselfunktion schützen kann. Nachdem man den lumineszenten ATP-Assay beherrscht hat, kann dieser innerhalb von 30 Minuten abgeschlossen werden, und die Infrarot-Färbung kann problemlos innerhalb von acht Stunden durchgeführt werden.Bei der Durchführung dieser Verfahren ist zu beachten, dass sie die Zellanzahl nicht auf dieselbe Weise messen wie ein Mikroskop mit hoher Auflösung. Ein Beispiel dafür ist, dass die Proteinspiegel von alpha-Tubulin oder TP-Spiegel durch die Behandlungen verändert werden können, ohne dass parallele Änderungen in der Zellanzahl vorliegen.

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