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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Der Western Blot

The Western Blot

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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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JoVE Science Education Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

The Western Blot

2.10: Gel Purification

2.12: An Introduction to Transfection

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08:48 min

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April 30, 2023

Overview

Ein Western Blot wird benutzt, um spezifische Proteine in einer elektrophoretisch aufgetrennten Probe nachzuweisen. Nach der Auftrennung mit Hilfe eines Verfahrens das “Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese”, oder SDS-PAGE, genannt wird, benutzt man einen Westerntransfer um Proteine aus dem Polyacrylamidgel auf eine Membran zu übertragen, welche die Proteine in ihrer Position festhält. Danach wird die Membran mit Antikörpern inkubiert – ein Prozess der auch Immunblotting genannt wird. Beim Immunblotting finden Antikörper-Protein und Antikörper-Antikörper Bindungen durch spezifische Bindungsseiten statt, wodurch die hohe Spezifizität die gebraucht wird um ein einzelnes Protein nachzuweisen, sichergestellt wird. Die Detektion von Antikörpern findet mit Hilfe von Reportersystemen statt, welche die Benutzung von Enzymen einschließen. Diese Enzyme sind an einem Ende des Antikörpers angebracht und reagieren mit Substraten um Farb- oder Lichtänderungen zu bewirken. Diese Signale können dann abgebildet und mit Densitometrie quantifiziert werden.

Dieser Videoartikel präsentiert einen Überblick über die Western Blot Methode und beschreibt einen Westerntransfer, die Benutzung von Antikörpererkennung und Bildanalyse. Die Schritte im Westerntransfer, wie zum Beispiel der Aufbau des “Sandwiches” und die Transferbedingungen, sowie die Theorie hinter der Antikörperbindung und wie man diese Antiköper erkennt, werden im Detail erörtert. Die weitreichenden Anwendungen dieses Verfahrens werden mit Hilfe von mehreren Beispielen, wie dem Nachweis von Protein-Protein Interaktionen und der Identifikation von individuellen Proteinen in Komplexen, gezeigt.

Procedure

Der Western Blot ist ein wichtiges Verfahren, bei dem Forscher mit Hilfe von Antikörpern untersuchen können, ob spezifische Proteine in einer elektrophoretisch aufgetrennten Probe enthalten sind.

Es gibt drei Schritte in dieser Technik, die für qualitativ hochwertige Resultate wichtig sind: das Elektroblotting, das Immunblotting und die Detektion. Vor diesen Schritten wird die Probe mit SDS-PAGE aufgetrennt. SDS-PAGE ist ein Verfahren in dem denaturierte Proteine in einem Polyacrylamidgel nach ihrer Größe separiert werden.

Elektroblotting nennt man auch Elektrotransfer. Man braucht eine Transferkassette, die das “Sandwich“ zusammenhält, und eine Transferkammer um das Protein von dem Acrylamidgel auf eine dünne Membran zu übertragen. Das sogenannte “Elektrotransfersandwich“ besteht aus dem Gel und einer speziellen Membran, die zwischen zwei Blätter Filterpapier gelegt werden. Während des Transfers wird ein elektrisches Feld genutzt um Proteine durch das Gel auf die Membran zu transferieren, wo sie durch hydrophobische Interaktionen fest gehalten werden.

Beim Immunblotting verwendet man Antikörper, welche die Membran auf spezifische Proteine hin untersuchen. Antikörper sind große Y-förmige Proteine, die zwei Fragmente (auch Fab Fragmente genannt) enthalten, die andere Proteine binden. Die Fab Fragmente definieren das spezifische Epitop, oder den spezifischen Teil des Proteins, das an einen Antikörper bindet.

Monoklonale Antikörper sind Antikörper, die nur ein einziges Epitop erkennen. Sie werden wegen ihrer Spezifizität verzugsweise für das Immunblotting benutzt. Im Gegensatz dazu sind polyklonale Antikörper verschiedene Antikörper, die auf verschiedene Epitope des gleichen Antigens – also dem Protein für welches der Antikörper spezifisch ist – reagieren. Monoklonale Antikörper, die ein lineares Epitop erkennen, werden bevorzugt verwendet, da sie denaturierte und linearisierte Proteine erkennen können. Das ist wichtig, denn viele Antikörper erkennen nur strukturierte Epitope, das heißt sie erkennen nur Proteine in ihrer nativen 3D Struktur.

Neben den Fab Fragmenten bestehen Antikörper auch aus Fc Regionen, die spezifisch für das Tier sind, in welchem der Antikörper produziert wurde. Beim Immunblotting wird diese Region hauptsächlich als Epitop für den sekundären Antikörper benutzt – also einem Antikörper der den ersten Antikörper erkennt, welcher wiederum das Protein bindet, das wir nachweisen wollen.

Um ein sichtbares Signal zu produzieren, sind Antikörper durch ihre Fc Region oft mit einem Reporterenzym, wie zum Beispiel der alkalinen Phosphatase oder der Meerrettichperoxidase, verbunden. Diese Reporterenzyme produzieren nachweisbare Signale, in dem sie mit einem Substrat reagieren das Farbänderungen bewirkt oder Licht produziert.

Diese Änderungen können mit Hilfe von Densitometrie quantifiziert werden. Densitometrie ist ein Verfahren das benutzt wird um die Dichte einer Proteinbande mit Hilfe von Bildanalysesoftware zu berechnen. Die Banden können dann direkt mit einem Referenzstandard oder durch interne Kontrollproben quantifiziert werden.

Für einen erfolgreichen Elektrotransfer wird das Gel zuerst für 15 Minuten in Transferpuffer equilibriert. Die Membran wird auch abhängig von den Herstellerangaben equilibriert.

Danach wird das sogenannte „Gelsandwich“ im Transferpuffer vorbereitet um Luftblasen im Transfersystem zu vermeiden. Luftblasen in dem Transfersandwich können durch Rollen mit einer kleinen Pipette entfernt werden. Schon kleine Luftblasen können den Transferprozess unterbrechen und zu einem unvollständigen Transfer führen, wie hier an dem unteren Teil der Membran zu sehen ist.

Wenn der Transfer fertig angerichtet ist, lässt man ihn für 2-3 Stunden bei 20-30 mA laufen, nachdem zusätzlicher Transferpuffer zugegeben wurde. Der Transferpuffer enthält Methanol, was die Bindung des Proteins an die Membran erleichtert.

Nachdem der Transfer abgeschlossen ist, wird das „Sandwich“ auseinander gebaut. Die Qualität des Transfers kann mit Hilfe von Ponceau S, einem nicht spezifischen Farbstoff, kontrolliert werden. Dadurch kann man schnell und umkehrbar Proteinbanden erkennen.

Der erste Schritt im Immunblotting ist den restlichen Teil der Membran mit einer verdünnten Lösung von Proteinen zu bedecken. Dieser Schritt wird auch Blockieren genannt und wird ausgeführt um die Membran zu blockieren und dadurch nicht-spezifische Bindungen des Antikörpers zu der Membran einzuschränken. Normalerweise besteht die Blockierlösung aus bovinen Serumalbumin oder getrockneter Milch ohne Fettanteil, die in einer gepufferten Salzlösung aufgelöst ist. Dieser Schritt wird normalerweise eine Stunde oder über Nacht auf einem Schüttler durchgeführt.

Danach wird die Membran mit dem primären Antikörper, der in der Blockierlösung verdünnt ist, inkubiert. Dieser Schritt kann 30 min dauern oder über Nacht mit sanftem Schütteln ausgeführt werden.

Nun wird die Membran gründlich gewaschen um nicht-spezifsche Hintergrundsignale zu vermeiden. Danach wird ein sekundärer Antikörper, der in der Blockierlösung verdünnt ist, zu der Membran zugegeben. Nach kurzer Inkubationsdauer wird die Membran erneut gründlich gewaschen.

Sekundäre Antikörper können mit Hilfe von Reporterenzymen, die an sie gebunden sind, erkannt werden. Bei Zugabe des richtigen Substrats können Farbänderungen oder Chemilumineszenz abgebildet und mit densitometrischen Methoden gemessen werden. Zusätzlich stellt die Proteinleiter eine Größenreferenz für die Größe eines linearisierten Proteins dar, abhängig davon wie weit es im Gel relativ zu den Größenanzeigern der Leiter migriert ist. Das Beobachten der Größe von Proteinen im Immunblotting ist eine gute Methode um sicherzustellen, dass der Antikörper das richtige Protein erkennt und festzustellen ob es verschiedene Kopien dieses Proteins gibt.

Es gibt tausende von käuflich erhältlichen primären Antikörpern, die es einem erlauben spezifische Proteine in einer Probe nachzuweisen und zu quantifizieren. Hier verwendet ein Forscher einen HIF-1 α Antikörper um die Menge dieses Transkriptionsfaktors, der auf Sauerstoffänderungen reagiert, zu bestimmen und dadurch die Zellen auf Hypoxie zu untersuchen. Als Kontrollantikörper wurde beta-actin verwendet. Wie man hier sehen kann produzieren Zellen, die unter normalen Sauerstoffbedingungen kultiviert worden sind, bedeutend weniger HIF-1.

Die Kombination von 2D-Gelelektrophorese und Immunblotting ermöglicht es wichtige Informationen über die Existenz von Proteinkomplexen zu erlangen. Hier werden Proben zuerst nach der Größe der Komplexe aufgelöst und dann denaturiert, so dass jeder individuelle Proteinkomplex nach seiner Größe aufgelöst werden kann. Antikörper für drei verschiedene Proteine zeigen drei verschiedene Komplexe mit einer verschiedenen Anzahl dieser Proteine, die in einer vertikalen Linie angebracht sind. Die linke Spalte enthält beta-2 und MCP-21, sowie ein anderes Protein das nicht durch diese Marker gezeigt wird. Die mittlere Spalte zeigt einen Komplex mit allen 3 Proteinen, und die rechte Spalte enthält nur beta-2 und MCP-21.

Immunblotting kann auch benutzt werden um die Interaktionen von zwei Proteinen zu visualisieren. Das wird gemacht in dem man zuerst Proteine von einem Gel auf eine nitrozellulose Membran überträgt und diese Membran dann mit zusätzlichen Proteinen inkubiert. Immunblotting wird dann ausgeführt um zu erkennen, ob die zusätzlichen Proteine in einem Komplex mit Proteinen auf der Membran sind.

Das war die Einführung in das Immunblotting von JoVE. Ihr solltet nun verstehen wie man Proteine auf eine Membran transferiert, wie man die Membran mit Antikörpern inkubiert, und wie man ein Signal misst. Wie immer – danke für eure Aufmerksamkeit!

Transcript

Western Blotting is a powerful technique utilized by many researchers to identify the presence of specific proteins in an electrophoretically-separated sample using antibodies.

There are 3 principal stages of this technique that are essential for a quality outcome: Electroblotting, Immunoblotting, and Detection. Before these stages are attempted, SDS-PAGE, in which denatured proteins are separated by size in a polyacrylamide gel, must be performed.

Electroblotting, is also known as the Western “transfer” and requires a transfer cassette for holding together the “sandwich” as well as an apparatus for transferring protein from an acrylimide gel to a thin membrane. The electroblotting sandwich consists of the gel and a specialized membrane, sandwiched between two pieces of filter paper. During the transfer, an electric field is used, to move the proteins through the gel, where they become trapped on a membrane due to charged and hydrophobic interactions.

Immunoblotting uses antibodies to “probe” the membrane for specific proteins. Antibodies are large Y-shaped proteins that contain two fragments, also known as Fab regions, which bind to other proteins. The Fab region defines the specific epitope, or specific portion of a protein, to which an antibody will bind.

Monoclonal antibodies are antibodies that recognize a single epitope and are the preferred antibody type used for immunoblotting due to their specificity. In contrast, polyclonal antibodies are a series of different antibodies that target many epitopes on the same antigen – or protein for which an antibody has specificity. Monoclonal antibodies that recognize a linear epitope are preferred as that ensures the epitope can be found on a denatured, or linearized, protein. This is important because many antibodies only recognize conformational epitopes, which means that they recognize proteins in their native 3D state only.

In addition to Fab fragments, antibodies contain an Fc region, which is specific to the animal that produced the antibody. In immunoblotting, this region is mainly utilized as the epitope for a secondary antibody – an antibody which recognizes the first antibody that has bound to the protein you’re trying to detect.

In order to produce an observable signal, antibodies are often linked, through their Fc region, to a reporter enzyme, such as alkaline phosphatase or horseradish peroxidase. These reporter enzymes produce signals by reacting with substrates to cause color changes or produce light changes.

These changes can then be quantified using densitometry. Densitometry is the technique used to measure the density of a protein band using image analysis software to calculate the density of each band. The bands can then be directly quantified using reference standards or internally controlled using a control sample.

For a successful Western transfer, the gel is first equilibrated in transfer buffer for 15 minutes. The membrane should also be equilibrated according to manufactures instructions.

Next, the gel transfer sandwich is carefully prepared in transfer buffer to prevent bubbles from being trapped within the system. Bubbles trapped in the sandwich can be forced out by rolling over them with a small pipette. Even small bubbles can interrupt the transfer of proteins causing incomplete transfer as can be seen on the lower parts of this membrane.

Once assembled, additional transfer buffer is poured into the transfer chamber and it is run at 20-30 mA for 2-3 hours. Transfer buffer contains methanol, which enhances the binding of the proteins to the membrane.

Once the transfer is complete the cassette is disassembled and the quality of the transfer can be checked using a non-specific protein stain such as Ponceau S. This offers a quick and reversible detection of protein bands.

The first step of immunoblotting is to cover the remaining areas of the membrane with a dilute solution of proteins. This step is called blocking and is performed, in order to block the membrane and reduce the nonspecific binding of the antibody to the membrane. Typically, the blocking solution consists of either bovine serum albumin or non-fat dry milk dissolved in a buffered saline solution. This step is usually done for 1 hour to overnight on a shaker.

The next step is to incubate the membrane with the primary antibody diluted in the blocking solution. This step can take from 30 minutes to overnight and should be performed with gentle agitation.

Then, the membrane is thoroughly rinsed to reduce nonspecific background staining and the secondary antibody is added in blocking buffer to the membrane. After a short incubation, the membrane is again thoroughly rinsed.

Secondary antibodies are detectable thanks to the reporter enzymes that are tethered to them. Upon addition of the correct substrate, colorimetric or chemiluminescent changes can be imaged and then measured using densitometry techniques. In addition, the protein ladder provides a valuable size reference so that each protein’s linear size can be estimated based on how far it has migrated in the gel relative to the size markers in the ladder. Observing the size of proteins detected via immunoblotting is a good way to verify that the antibody is recognizing the correct protein and whether it is a monomer or a multiple copies of the protein that are being seen.

There are thousands of commercially available primary antibodies, which allows for the detection and quantification of specific proteins within a sample. Here a researcher uses an antibody for HIF-1α to measure the amount of this oxygen responsive transcription factor in cell cultures to screen for hypoxia. They also used an antibody for beta-actin to act as a loading control. As you can see, the cells cultured in normal oxygen conditions produced far less HIF-1 than those cultured in low oxygen conditions.

The combination of 2D gel electrophoresis and immunoblotting can provide valuable information into the presence of protein complexes. Here, samples were first run by protein complex size, and then denatured so each individual protein in the complex could be separated by their individual size. Antibodies for three different proteins show three unique complexes containing different numbers of these proteins with each complex arranged in a vertical line. The left most column contains beta-2 and MCP-21, as well as another protein not shown by these markers. The center column shows a complex that contained all 3 proteins, and the right column contained only beta-2 and MCP-21.

Immunoblotting can also be used to visualize protein-protein interactions. This is performed by first transferring proteins from a gel onto a nitrocellulose membrane and then probing that membrane with additional proteins. Immunoblotting is then used to detect the if the added proteins complexed with any of the proteins that were immobilized on the membrane.

You’ve just watched JoVE’s video on immunoblotting. You should now understand how to transfer proteins to a membrane, probe the membrane with antibodies, and detect the signal. As always, thanks for watching!

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