2.11: Der Western Blot

Western Blotting ist eine leistungsstarke Technik, die von vielen Forschern verwendet wird, um das Vorhandensein bestimmter Proteine in einer elektrophoretisch getrennten Probe mithilfe von Antikörpern zu identifizieren.

Es gibt 3 Hauptphasen dieser Technik, die für ein qualitativ hochwertiges Ergebnis unerlässlich sind: Elektroblotting, Immunoblotting und Detektion. Bevor diese Stufen versucht werden, muss eine SDS-PAGE durchgeführt werden, bei der denaturierte Proteine in einem Polyacrylamid-Gel nach Größe getrennt werden.

Das Elektroblotting, auch bekannt als der westliche "Transfer" und benötigt eine Transferkassette, um das "Sandwich" zusammenzuhalten. sowie eine Vorrichtung zum Übertragen von Protein von einem Acrylimidgel auf eine dünne Membran. Das Elektroblotting-Sandwich besteht aus dem Gel und einer speziellen Membran, die zwischen zwei Stücken Filterpapier eingebettet ist. Während des Transfers wird ein elektrisches Feld verwendet, um die Proteine durch das Gel zu bewegen, wo sie aufgrund geladener und hydrophober Wechselwirkungen auf einer Membran gefangen werden.

Immunoblotting verwendet Antikörper, um zu "sondieren" die Membran für bestimmte Proteine. Antikörper sind große Y-förmige Proteine, die zwei Fragmente enthalten, die auch als Fab-Regionen bezeichnet werden und an andere Proteine binden. Die Fab-Region definiert das spezifische Epitop oder den spezifischen Teil eines Proteins, an den ein Antikörper bindet.

Monoklonale Antikörper sind Antikörper, die ein einzelnes Epitop erkennen und aufgrund ihrer Spezifität der bevorzugte Antikörpertyp für das Immunblotting sind. Im Gegensatz dazu handelt es sich bei polyklonalen Antikörpern um eine Reihe verschiedener Antikörper, die auf viele Epitope desselben Antigens abzielen ? oder Protein, für das ein Antikörper Spezifität aufweist. Monoklonale Antikörper, die ein lineares Epitop erkennen, werden bevorzugt, da dies sicherstellt, dass das Epitop auf einem denaturierten oder linearisierten Protein zu finden ist. Dies ist wichtig, da viele Antikörper nur Konformationsepitope erkennen, was bedeutet, dass sie Proteine nur in ihrem nativen 3D-Zustand erkennen.

Zusätzlich zu den Fab-Fragmenten enthalten Antikörper eine Fc-Region, die spezifisch für das Tier ist, das den Antikörper produziert hat. Beim Immunblot wird diese Region hauptsächlich als Epitop für einen Sekundärantikörper verwendet ? Ein Antikörper, der den ersten Antikörper erkennt, der an das Protein gebunden ist, das Sie nachweisen möchten.

Um ein beobachtbares Signal zu erzeugen, sind Antikörper oft über ihre Fc-Region an ein Reporterenzym wie alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase gebunden. Diese Reporterenzyme erzeugen Signale, indem sie mit Substraten reagieren, um Farb- oder Lichtveränderungen zu verursachen.

Diese Veränderungen können dann mit Hilfe der Densitometrie quantifiziert werden. Die Densitometrie ist die Technik, mit der die Dichte einer Proteinbande mithilfe einer Bildanalysesoftware gemessen wird, um die Dichte jeder Bande zu berechnen. Die Banden können dann direkt mit Referenzstandards quantifiziert oder intern mit einer Kontrollprobe kontrolliert werden.

Für einen erfolgreichen Western Transfer wird das Gel zunächst für 15 Minuten in Transferpuffer äquilibriert. Die Membran sollte auch gemäß den Anweisungen des Herstellers äquilibriert werden.

Anschließend wird das Geltransfer-Sandwich sorgfältig in einem Transferpuffer vorbereitet, um zu verhindern, dass Blasen im System eingeschlossen werden. Im Sandwich eingeschlossene Blasen können herausgedrückt werden, indem man sie mit einer kleinen Pipette überrollt. Selbst kleine Bläschen können den Transfer von Proteinen unterbrechen und zu einem unvollständigen Transfer führen, wie an den unteren Teilen dieser Membran zu sehen ist.

Nach dem Zusammenbau wird ein zusätzlicher Transferpuffer in die Transferkammer gegossen und 2-3 Stunden lang mit 20-30 mA betrieben. Der Transferpuffer enthält Methanol, das die Bindung der Proteine an die Membran verbessert.

Sobald der Transfer abgeschlossen ist, wird die Kassette zerlegt und die Qualität des Transfers kann mit einem unspezifischen Proteinfleck wie Ponceau S überprüft werden. Dies ermöglicht einen schnellen und reversiblen Nachweis von Proteinbanden.

Der erste Schritt des Immunblottings besteht darin, die verbleibenden Bereiche der Membran mit einer verdünnten Lösung von Proteinen zu bedecken. Dieser Schritt wird als Blockierung bezeichnet und wird durchgeführt, um die Membran zu blockieren und die unspezifische Bindung des Antikörpers an die Membran zu reduzieren. Typischerweise besteht die Blockierungslösung entweder aus Rinderserumalbumin oder fettfreier Trockenmilch, die in einer gepufferten Kochsalzlösung gelöst ist. Dieser Schritt wird in der Regel für 1 Stunde bis über Nacht auf einem Shaker durchgeführt.

Der nächste Schritt besteht darin, die Membran mit dem in der Blockierungslösung verdünnten Primärantikörper zu inkubieren. Dieser Schritt kann zwischen 30 Minuten und über Nacht dauern und sollte unter leichtem Rühren durchgeführt werden.

Dann wird die Membran gründlich gespült, um unspezifische Hintergrundfärbungen zu reduzieren, und der Sekundärantikörper wird in einem Blockierungspuffer zur Membran hinzugefügt. Nach einer kurzen Inkubation wird die Membran noch einmal gründlich gespült.

Sekundäre Antikörper sind dank der Reporterenzyme, die an sie gebunden sind, nachweisbar. Nach Zugabe des richtigen Substrats können kolorimetrische oder chemilumineszierende Veränderungen abgebildet und dann mit Densitometrietechniken gemessen werden. Darüber hinaus bietet die Proteinleiter eine wertvolle Größenreferenz, so dass die lineare Größe jedes Proteins basierend darauf geschätzt werden kann, wie weit es im Gel im Verhältnis zu den Größenmarkern in der Leiter gewandert ist. Die Beobachtung der Größe von Proteinen, die durch Immunblotting nachgewiesen werden, ist eine gute Möglichkeit, um zu überprüfen, ob der Antikörper das richtige Protein erkennt und ob es sich um ein Monomer oder mehrere Kopien des Proteins handelt.

Es gibt Tausende von kommerziell erhältlichen Primärantikörpern, die den Nachweis und die Quantifizierung spezifischer Proteine in einer Probe ermöglichen. Hier verwendet ein Forscher einen Antikörper gegen HIF-1? Um die Menge dieses sauerstoffresponsiven Transkriptionsfaktors in Zellkulturen zu messen, um auf Hypoxie zu screenen. Sie verwendeten auch einen Antikörper für Beta-Aktin, um als Belastungskontrolle zu fungieren. Wie Sie sehen können, produzierten die Zellen, die unter normalen Sauerstoffbedingungen kultiviert wurden, weitaus weniger HIF-1 als diejenigen, die unter sauerstoffarmen Bedingungen kultiviert wurden.

Die Kombination von 2D-Gelelektrophorese und Immunblotting kann wertvolle Informationen über das Vorhandensein von Proteinkomplexen liefern. Hier wurden die Proben zunächst nach Größe des Proteinkomplexes entnommen und dann denaturiert, so dass jedes einzelne Protein im Komplex nach seiner individuellen Größe getrennt werden konnte. Antikörper für drei verschiedene Proteine zeigen drei einzigartige Komplexe, die eine unterschiedliche Anzahl dieser Proteine enthalten, wobei jeder Komplex in einer vertikalen Linie angeordnet ist. Die Spalte ganz links enthält Beta-2 und MCP-21 sowie ein weiteres Protein, das von diesen Markern nicht gezeigt wird. Die mittlere Spalte zeigt einen Komplex, der alle 3 Proteine enthielt, und die rechte Spalte enthielt nur Beta-2 und MCP-21.

Immunoblotting kann auch verwendet werden, um Protein-Protein-Wechselwirkungen sichtbar zu machen. Dazu werden zunächst Proteine aus einem Gel auf eine Nitrozellulosemembran übertragen und diese Membran dann mit weiteren Proteinen untersucht. Immunoblotting wird dann verwendet, um nachzuweisen, ob die hinzugefügten Proteine mit einem der Proteine komplexiert sind, die auf der Membran immobilisiert wurden.

Sie haben gerade das Video von JoVE über Immunoblotting gesehen. Sie sollten nun verstehen, wie man Proteine auf eine Membran überträgt, die Membran mit Antikörpern untersucht und das Signal nachweist. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!