Name: Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Erfahren Sie die Erzeugung rekombinanter Arenaviren in FDA-zugelassenen Vero-Zellen für die Impfstoffentwicklung. Diese Methode nutzt Plasmid-Transfektion und Immunfluoreszenz zur Bestätigung des Virus-Rescue.

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Wir danken Vergangenheit und Gegenwart Mitglieder in JCT und LM-S Laboratorien für die Entwicklung und Verbesserung der Arenavirus reversen Genetik Techniken und Plasmide. Wir danken auch Snezhana Dimitrova für technische Unterstützung. Der monoklonale Antikörper, der gegen JUNV NP (SA02-BG12) wurde von BEI Resources (NIAID Biodefense and Emerging Infektionen Research Resources Repository) erhalten. BYHC wurde von Grant Number GM068411 von Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award unterstützt. EO-R ist ein Fulbright-Conicyt (BIO 2008) und eine Rochester Vaccine Fellowship (2012) Empfänger. EO-R aktuellen Unterstützung wird durch ein Postdoc-Fellowship für Diversity &amp; Academic Excellence-vom Amt für Faculty Development &amp; Diversity an der Universität von Rochester zur Verfügung gestellt. Research in LM-S Labor wird durch die NIH Zuschüsse RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, die NIAID Centers of Excellence für Forschung und Influenza Surveillance (HHSN266200700008C) finanziert undDie University of Rochester Center for Biodefense Immune Modeling (HHSN272201000055C). Forschung an JCT Labor wurde durch Zuschüsse RO1 AI047140, RO1 AI077719 und RO1 AI079665 von NIH unterstützt.

1. Arenavirus Rettung Transfektion Unsere Rettungssystem auf der Verwendung beider Polymerase II-Protein-Expressionsplasmide Codieren des Nucleoprotein (NP) und RNA-abhängige RNA-Polymerase-(L), die viralen trans-wirkende Faktoren für die RNA-Replikation und Genexpression des Arenavirus Genoms erforderlich basierend 7, 19, und in der Lage, Plasmide intrazellulären Synthese über die zelluläre RNA-Polymerase I (Pol-I), der S-und L-Antigenom RNA-Spezies 7 leiten. In unseren Untersuchungen verwenden wir die pCAGGS Proteinexpression Plasmid, das das Huhn β-Actin-Promotor und polyadenylanation (pA) Signalsequenzen verwendet, und die menschliche pol-I-Plasmid, die den menschlichen Polymerase I verwendet Promotor und Terminator-Sequenzen der Maus (Abbildung 2) . Die S-und L-RNA-Segmente in das HPOL-I-Plasmid in einer antigenomische Orientierung für die Erzeugung von genomischer RNA-Segmente bei der Transkription von HPOL-I lassen kloniert. Für die Rettung von Wildtyp-type rekombinanten LCMV (rLCMV) und offenen # 1 (rCandid # 1) der pCAGGS NP und L von jedem Virus zusammen mit ihren jeweiligen menschlichen Pol-I S und L RNA-Segmente (3) co-transfiziert. Erzeugung von rekombinantem trisegmented LCMV (r3LCMV) und Candid # 1 (r3Candid # 1) folgte ein ähnliches Protokoll, aber die S-Segment wurde in zwei verschiedenen pol-I S Plasmide, die jeweils für ein unverwechselbares Reportergen aufgeteilt: in eine, die NP open reading Frame (ORF) wurde mit dem Green Fluorescent Protein (GFP)-Reportergen (HPOL-I S GFP / GP) und in der anderen, die virale Glycoprotein Vorstufe (GPC) ORF mit dem Gaussia Luciferase (Gluc) Reporter-Gen ersetzt ist (HPOL-I S NP / Gluc). Eine schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 4 dargestellt. Die folgende Transfektion und Infektion Protokoll wurde für 6-well-Platten aufgebaut. <ol><li> OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) Mischung: Bereiten Sie 250 ul OptiMEM Medien und jeauf das Virus zu retten, 10 - 12 ug LPF2000 (1 ug / ul) pro Transfektion (Tabelle 1). Ein Verhältnis von 2,5 ug LPF2000 pro ug DNA wird empfohlen. Inkubation für 5 - 10 min bei RT. Unterdessen bereiten die Plasmidtransfektion Mischung in einem separaten Mikrozentrifugenröhrchens (Schritt 1.2). </li><li> Plasmid-DNA Transfektion Mischung: Bereiten Sie die Plasmidtransfektion Cocktail in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit den empfohlenen Mengen für jeden Virus Rettung (siehe Tabelle 1). Bringen Sie das Endvolumen auf 50 ul mit OptiMEM. </li><li> OptiMEM-LPF2000-DNA-Plasmid Mischung: In 250 ul der OptiMEM-LPF2000 Mischung (Schritt 1.1) in das Plasmid DNA Transfektion Mischung (Schritt 1.2). Inkubieren dieser Mischung für 20 - 30 min bei RT. Unterdessen bereiten und zählen 1 x 10 6 Zellen pro Vero Transfektionsreaktion. Vero-Zellen in Suspension transfiziert werden. </li><li> Vorbereitung von Vero-Zellen: Vero cells werden in 100 mm Schalen kultiviert. Vor dem Start bringen 1x PBS, DMEM 10% FBS 1% PS Medien und Trypsin-EDTA Gemisch auf 37 ° C. <ol><li> Waschen der Zellen zweimal mit 5 ml 1x PBS. </li><li> Trypsinize Zellen mit 1 ml Trypsin-EDTA und warten, bis die Zellen getrennt werden (ca. 5 min). Antippen vielleicht erforderlich, um vollständig lösen die Zellen von den Gerichten. </li><li> Vorsichtig die Zellen in 10 ml DMEM 10% FBS 1% PS in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugation der Zellen 5 min bei 1000 rpm in einer Zentrifuge. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 10 ml DMEM-10% FBS 1% PS und Zählen der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und stellen Konzentration auf 1 x 10 6 Zellen / ml. Es wurde festgestellt, daß 0,5 - 1 x 10 6 Vero Zellen pro Transfektion wurden die besten Ergebnisse erzielt. </li></ol></li><li> Mix LPF2000/DNA und Zellen: Nach 20 - 30 min Inkubation bei Raumtemperatur (Schritt 1.3), 1 ml von Vero-Zellen (1 x 10 6) (Schritt 1.4) zudie OptiMEM-LPF2000-DNA-Plasmid Mischung und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Seed LPF2000/DNA-cell Mischung in 6-well-Platten: Fügen Sie die DNA-LPF2000-Vero Mischung (Schritt 1.5) in die Vertiefungen der 6-Well-Platte. Schütteln Sie die 6-well-Platte und lassen Sie die Transfektion Inkubation über Nacht im Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Ändern Transfektionsmedium: Etwa 16 - 24 h nach der Transfektion, entfernen Sie die Transfektion Medien, 2 ml Infektion Medien und Inkubation transfizierter Zellen für eine zusätzliche 48 Stunden. </li><li> Zellpassage: Nach 48 Stunden Inkubation in Medien Infektion, entfernen Sie die Gewebekulturüberstand (TCS) und passieren die transfizierten Zellen in einer 100 mm-Schale. Der TCS selten enthält infektiösen Virus, weil die transfizierten Zellen zusätzliche Inkubation müssen Viruspartikel zu generieren. Für die Zellpassage: <ol><li> Waschen der Zellen zweimal mit 2 ml 1x PBS. </li><li> Trypsinize Zellen w<html> it 0,5 ml Trypsin-EDTA und warten, bis die Zellen lösen. </li><li> Die Zellen in 1 ml DMEM 10% FBS 1% PS in einem 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Zentrifugation der Zellen 5 min bei 5000 rpm, 4 ° C in einer Mikrozentrifuge. </li><li> Vorsichtig werden die Zellen in 1 ml einer Infektion Medien und die Übertragung der Zellen in einer 100 mm-Schale. Um das Gesamtvolumen in der Platte, mit infektiösen Medien bis 8 ml, ein ausreichendes Volumen, um die Trocknung der Zellen, sowie zum Konzentrieren des Virus zu verhindern. </li></ol></li><li> Schütteln Sie die 100 mm-Schale und setzen die Inkubation von Vero-Zellen im Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 für 72 Stunden. </li><li> Sammlung von TCS: Nach 72-stündiger Inkubation, sammeln die TCS in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen. Entfernen Zelltrümmer durch Zentrifugation für 5 min bei 2500 rpm in einer Zentrifuge. Infektiöse Arenavirus im TCS gefunden wird, so von der Zelltrümmer Pellet Entfernung und Speicherung des TCS bei -80 ° C. </li></ol>le &quot;&gt; 2. Bestätigung von rekombinanten Arenavirus Rettung Nachweis einer erfolgreichen Rettung von rLCMV und rCandid # 1 ist über dem Schwerpunkt bildende Einheit (FFU) Immunofluoreszenz-Assay (IFA) erreicht. Für Wildtyp-Virus Rettung verwenden wir spezifische Antikörper gegen das virale NP. Die r3LCMV und r3Candid Nr. 1 kodieren zwei Reportergene (GFP und Gluc), so dass virale Detektion und Titration ohne die Notwendigkeit von Antikörpern durch Fluoreszenzmikroskopie (GFP) und / oder Lumineszenz (Gluc). <ol><li> Bestätigen Wildtyp rekombinanten Arenavirus Rettung: Der Tag vor der Titration, waschen Vero-Zellen zweimal mit PBS, trypsinize und bereiten 96-Well-Platten bis 80 zu erreichen - 90% Zusammenfluss nächsten Tag (4 x 10 4 Zellen / well). Schütteln Sie die Platten von Hand auf einen uniformierten Verteilung der Zellen zu erhalten. Kultur die Zellen über Nacht in der 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um eine Monoschicht zu bestätigen, bevor mit der Infektion: <ol><li> Serienmäßig verdünnen (10 fache Verdünnungen) das Virus enthaltenden TCS erholte sich von den transfizierten Zellen in der 100-mm-Schale (Schritt 1.10) in OptiMEM. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus den gesäten Vero-Zellen, zweimal waschen mit 50 ul 1x PBS und infizieren Zellen mit 50 ul der seriell verdünnten Virus (Schritt 2.1). Infect Zellen für 1,5 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Nach der Infektion, entfernen Sie die Virusinokulum, fügen Sie 100 ul Infektion Medien / well und Inkubation der Zellen für 16 - 18 Stunden. Viral Re-Infektion kann nach 18-stündiger Inkubation führen, was in Überschätzung der viralen Titer führen. </li><li> Bei 16 - 18 Stunden nach der Infektion, entfernen Sie den TCS aus jeder Vertiefung und fixieren Sie die Zellen mit 4% Formaldehyd in 1x PBS verdünnt, für 15 min bei RT. </li><li> Dann entfernen Sie den Fixierungslösung und permeabilisieren die Zellen mit 0,1% Triton X-100 verdünnt in 1x PBS, für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Saugen Sie die Permeabilisierung Lösung, dann waschen Sie die Zellen 3 mal with 1x PBS. </li><li> Blockieren der Zellen mit 2,5% Rinderserum Albumin (BSA) in 1x PBS (Blockierungslösung) für 1 h bei RT. Alternativ können die Zellen über Nacht bei 4 ° C blockiert und weiterhin mit Antikörper-Inkubation des folgenden Tages. </li><li> Inzwischen bereitet die primären Antikörper. Verdünnen Sie die LCMV-und Candid # 1-spezifischen primären Antikörper in Blocking-Lösung und dann zentrifugiert den Antikörper / Blocking-Lösung für 15 min bei 3.500 Umdrehungen pro Minute. Der monoklonale anti-LCMV NP Antikörperklon 1.1.3 (1:30 Verdünnung) 16 und der monoklonale anti-NP JUNV Antikörper SA02-BG12 von BEI Ressourcen (1:500 Verdünnung) können für den Nachweis von rLCMV und rCandid Nr. 1 verwendet werden sind. </li><li> Nach einer 1-stündigen Inkubation absaugen Blocking-Lösung und 50 ul des primären Antikörpers an die Zellen und Inkubation für 1 Stunde bei 37 ° C. </li><li> Zu diesem Zeitpunkt verdünnen sekundären Antikörper in Blocking-Lösung, und dann zentrifugiert, die den Antikörper / Blockieren Lösung für 15 min bei 3.500 UpM. Das Polyklonalen Kaninchen-anti-Maus-IgG-FITC sekundären Antikörper für den Nachweis von primären monoklonalen Antikörper wurde verwendet, um Bilder in 5 beobachtet erhalten. </li><li> Nach 1 Stunde Inkubation absaugen primärer Antikörper, 3 x waschen mit 1x PBS, und fügen Sie die sekundären Antikörper für 30 min bei 37 ° C </li><li> Nach 30 min Inkubation absaugen sekundären Antikörper und waschen 3 mal mit 1x PBS. Die Zellen sind nun bereit, beobachtet werden mittels Fluoreszenzmikroskopie sowohl bestimmen den Erfolg von viralen Rettung und Titration durch Zählen der Schwerpunkt bildende Einheiten pro ml (FFU / ml). </li></ol></li><li> r3LCMV und r3Candid Nr. 1 virale Rettung: Da diese Viren zwei Reporter Gene exprimieren, rettet ihr kann durch Fluoreszenzmikroskopie überwacht werden, um die GFP-Expression oder Gluc Ausdruck in TCS erkennen. Rettung kann auch durch die Expression von Gluc werden in TCS bestätigt. Um die trisegmented Viren titrieren, wir Schritte 2.1 bis 2.1.4 folgen, jedoch Zellen nicht zu b brauchene befestigt, um eine erfolgreiche virale Rettung, weil der GFP-Expression zu bestimmen. Die Titration des Virus wird durch Zählen der FFU / ml bestimmt werden. Um eine erfolgreiche virale Rettung durch Gluc Ausdruck, Gluc Ausdruck von TCS bestimmen kann unter Verwendung eines Gluc Assay-Kit (Biolux Gaussia Luciferase Assay Kit, New England Biolabs) werden. Zu diesem Zweck: <ol><li> Je 100 ul TCS in eine 96-Well-Platte, weiß (Flat Mikrotiterplatten, Fisher Scientific). </li><li> Richten Sie das Luminometer (LumiCount, Packard Biosciences). </li><li> In 50 - 100 ul Gluc Assay-Lösung (wie vom Hersteller empfohlen) zu jeder Probe und messen Sie die Gluc Reporter Genexpression mit dem Luminometer. Als Negativ-Kontrolle wurde Gluc Ausdruck des TCS von den Wildtyp-Viren infizierten Zellen gemessen. </li></ol></li></ol> 3. Passage von Gewebekulturüberstände Viral Rettung hängt Transfektionseffizienzen. Vero-Zellen wurde gezeigt,zu niedrigeren Transfektionseffizienzen als andere Zelllinien 14 haben. Wenn Virustiter in der TCS niedrig sind, infizieren frisch Vero-Zellen mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,01 (LCMV) bzw. 0,1 (Candid # 1) für 72 Stunden, um das Virus zu verstärken.

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Erzeugung von rekombinanten Arenaviren Verwendung von Plasmid-basierte reverse Genetik Techniken hat sich zu einem weit verbreiteten Ansatz zur Untersuchung der vielen verschiedenen Facetten der Arenavirus Biologie. Hier dokumentieren wir eine entscheidende Verbesserung des derzeitigen Systems durch Ausführen Arenavirus rettet in Vero-Zellen, so dass für das Potenzial Generation von FDA-zugelassenen Impfstoff-Kandidaten gegen Arenaviren und Vakzinvektoren gegen andere Infektionskrankheiten. ...

Arenaviren sind umhüllte Viren mit einem bisegmented negative RNA-Genom, dass 3 der Arenaviridae Familie gehören. Die Arenavirus Genom kodiert vier Proteine ​​in einer AmbiSense Mode aus zwei getrennten viralen Segmente 3. Der große (L)-Segment kodiert für das RNA-abhängigen RNA-Polymerase (L) und die kleine RING (Really Interesting New Gene) finger protein (Z), die als die wichtigste treibende Kraft der Virusknospung dient. Die kleinen (S)-Segment kodiert für das virale nucleoprotein (NP) und die Oberflächen-Glykoprotein (GP) (Abbildung 1). Mehrere Mitglieder der Familie Arenaviridae sind verantwortlich für die tödlichen hämorrhagischen Fieber (HF) in Menschen 3. Grundsätzlich Bedenken sind Lassa-Virus (LASV) und Junín Virus (JUNV), die bekanntlich hohe Mortalität bei hospitalisierten Patienten 8, 9 verursachen. Obwohl diese Viren sind endemisch in Westafrika und ländlichen Argentinien, bzw.mehren sich die Bedenken der Einfuhr von LASV und JUNV zu nicht-endemischen Gebieten aufgrund der erhöhten Reise 10. Dazu kommt, obwohl in der Regel nicht mit einer schweren Krankheit in den Menschen verbunden sind, wird die prototypische Arenavirus lymphatischer Choriomeningitisvirus (LCMV) einen vernachlässigten Erreger gilt als es Fälle von tödlichen Infektionen bei immungeschwächten Patienten 6, 15 und ist verantwortlich für angeborene Missbildungen und Fehlgeburten bei schwangeren Frauen 2, 13. Derzeit gibt es keine FDA-zugelassenen Impfstoffe gegen Arenaviren und Behandlung der Nukleosid-Analogon Ribavirin, die nur teilweise wirksam ist und oft mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden ist, begrenzt. Die Einführung von Plasmid-basierte reverse genetics 4 und Erzeugung rekombinanter Arenaviren 7, 19 haben stark auf dem Gebiet der Forschung Arenavirus fortgeschritten. Derzeit werden Nagerzellen (wie BHK-21) für die Gener verwendetation von rekombinanten Arenaviren aufgrund der artspezifischen murine RNA-Polymerase I (pol-I) Promotor, der die anfängliche Transkription der S-und L-Segmente. Allerdings Virus Rettung in BHK-21-Zellen sind keine anerkannte Methode zur Erzeugung von rekombinanten Arenaviren als potentielle Vakzine Saatgut Kandidaten. Hier dokumentieren wir die Verwendung des menschlichen pol-I-Promotor für eine effiziente Rettung des prototypischen Alten Welt (OW) LCMV und der Neuen Welt (NW) JUNV Candid # 1-Stamm in Vero-Zellen. Mit einer ähnlichen Methode erzielten wir rekombinantes trisegmented LCMV (r3LCMV) und Candid # 1 (r3Candid # 1) Arenaviren, die zwei zusätzliche fremde Gene in zwei verschiedene S RNA Segmente 5 codiert enthalten. Dieses neue System nicht nur folgt eine hohe Reproduzierbarkeit und einfache Protokoll, sondern sofort in der Erzeugung von rekombinanten Arenaviren als potentielle Vakzine oder Impfvektor Samen eingeführt werden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Material und Methoden</td></tr><tr><td colspan="4"> Zelllinien Vero E6 (Epithelzellen der afrikanischen grünen Affenniere) werden in einem 37 &deg; C-Inkubator mit 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Zellen sind aus der American Type Culture Collection (ATCC, Katalognummer CRL-1586) erhältlich. Plasmides Alle Plasmide, mit Ausnahme von hpol-I L, können bei 37 &/deg gezüchtet werden; C, für 16-18 Std. Wir empfehlen, Kulturen der hpol-I L bei 30 μg zu züchten; C für 24 Std. Die Plasmide werden mit einem Plasmid-Maxi-Kit (EZNA Fastfilter, Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) gemäß den Empfehlungen des Herstellers hergestellt und bei -20 °C gelagert. Die Konzentration des gereinigten DNA-Plasmids wird durch Spektrophotometrie bei 260 nm bestimmt, wobei die Reinheit anhand des Verhältnisses 260:280 nm geschätzt wird. Präparate mit einem Verhältnis von 1,8-2,0 260:280 nm gelten als geeignet für die Virusrettung. Zusätzlich sollten die Plasmidkonzentration und -reinheit mit Agarose-Gelelektrophorese bestätigt werden. Viruses Das beschriebene Protokoll zur Rettung von rLCMV (Armstrong 53b) und rCandid#1 kann unter Bedingungen der Biosicherheitsstufe (BSL) 2 durchgeführt werden. Kontaminiertes Material, einschließlich TCS und Zellen, sollte vor der Entsorgung sterilisiert werden. Für die Rettung anderer Arenaviren sind möglicherweise höhere BSL-Einrichtungen erforderlich, so dass angemessene Sicherheitsmaßnahmen befolgt werden müssen. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM), 50 ml fötales Rinderserum (FBS) und 5 ml 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Bei 4 °C lagern. Dieses Medium wird zur Erhaltung von Vero-Zellen verwendet. Infektiöse Medien: 2-zu-1-Mischung aus OptiMEM und DMEM 10 %FBS 1 %PS. Bei 4 μC lagern. Dieses Medium wird bei Virusinfektionen verwendet. 10X Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS): 80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g Na2HPO4.7H2O, 2 g KH2PO4. ddH2O bis zu 1 Liter zugeben. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 ein. Im Autoklaven sterilisieren. Bei Raumtemperatur lagern. 1X PBS: 10X PBS 1:10 mit ddH2O. Im Autoklaven sterilisieren und bei Raumtemperatur lagern. 2,5 % BSA: 2,5 g BSA in 97,5 ml 1X PBS. Bei 4 °C lagern. Diese wird als Blockierungslösung für die IFA verwendet. </td></tr></tbody></table>

erzeugung von rekombinanten arenavirus für die impfstoffentwicklung in fda-zugelassenen vero-zellen

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Die Entwicklung und Umsetzung von Arenavirus reversen Genetik stellt einen bedeutenden Durchbruch in der Arenavirus Feld 4. Die Verwendung von zellbasierten Arenavirus Minigenom Systeme zusammen mit der Fähigkeit, rekombinante infektiöse Arenaviren mit vorgegebenen Mutationen in ihrem Genom erzeugen hat die Untersuchung der Beteiligung von viralen Faktoren zu den verschiedenen Stufen des Lebenszyklus Arenavirus sowie Virus-Wirt erleichtert Wechselwirkungen und Mechanismen der Pathogenese Arenavirus 1, 3, 11. Darüber hinaus hat die Entwicklung von trisegmented Arenaviren die Verwendung der Arenavirus Genom zusätzliche fremde Gene von Interesse exprimieren gestattet und eröffnet damit die Möglichkeit, Arenavirus basierender Impfstoff Vektor Anwendungen 5. Ebenso bietet die Entwicklung von Single-Cycle-infektiösen Arenaviren auszudrücken vermag Reportergene ein neues experimentelles Werkzeug, um die Sicherheit der Forschung mit highl verbesserny pathogenen menschlichen Arenaviren 16. Die Erzeugung von rekombinanten Arenaviren Verwendung von Plasmid-basierte reverse Genetik Techniken bislang auf die Verwendung von Nagetier-Zelllinien 7,19, die einige Hindernisse für die Entwicklung der Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Impfstoff-oder Vakzinvektoren Posen verlassen. Um dieses Hindernis zu überwinden, beschreiben wir hier die effiziente Erzeugung von rekombinanten Arenaviren in FDA-zugelassenen Vero-Zellen.

Erfolgreiche Rettung eines rekombinanten Wildtyp Arenavirus wird durch das Vorhandensein von viralen Antigenen mit IFA (Fig. 5) bestätigt werden. Im Falle von rekombinanten Viren trisegmented können erfolgreiche virale Rettung durch Beobachtung GFP-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie (6A) beurteilt werden. Erfolgreiche Rettung wird weiter durch die Beurteilung Gluc Ausdruck (6B) bestätigt werden. Repräsentative Ergebnisse, welche die erfolgreiche Rettung von Wildt...

Rettung von rekombinanten Arenaviren von geklonten cDNAs, ein Ansatz, so genannte Reverse Genetik, ermöglicht es den Forschern, die Rolle der spezifischen viralen Genprodukte, sowie den Beitrag ihrer unterschiedlichen spezifischen Domänen und Rückstände zu untersuchen, um viele verschiedene Aspekte der Biologie von Arenavirus . Ebenso Techniken reverser Genetik in FDA-zugelassenen Zelllinien (Vero) für die Impfstoffentwicklung bietet neue Möglichkeiten für die Erzeugung und sichere Impfstoffe zur Bekämpfung von humanpathogenen Arenaviren.

Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein einfaches und hochgradig reproduzierbares Protokoll für die Erzeugung rekombinanter Arenaviren in von der FDA zugelassenen Vero-Zellen für die Entwicklung potenzieller Impfstoffe oder Impfstoffvektoren zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das Plasmid-DNA-Transfektionsgemisch sorgfältig vorbereitet wird. Der zweite Schritt besteht darin, Vero-Zellen mit dem Plasmid-DNA-Transfektionsgemisch zu transfizieren.Als nächstes ist es notwendig, transfizierte Zellen in 100-Millimeter-Schalen zu skalieren. Letztendlich besteht der letzte Schritt darin, eine erfolgreiche Virusrettung durch Immunfluoreszenz mittels Wildtyp-Virus- oder Bi-Fluoreszenzmikroskopie und GIA-Luciferase-Expression mittels Tris-segmentiertem Virus im Vergleich zu bestehenden Methoden wie Rescues und Rine-Zelllinien zu bestätigen. Dieses Protokoll erzeugt Nierenviren in Vero-Zellen, die von der FDA für die Entwicklung von Impfstoffen zugelassen sind.Neben der Erzeugung von potenziellem Impfstoffsaatgut kann das berichtete Gen, das das trisegmentierte Virus exprimiert, auch zur Identifizierung von antiviralen Wirkstoffen gegen VIRs in Kopfdurchsatz-Screenings eingesetzt werden, ohne dass sekundäre Assays für den Virusnachweis erforderlich sind. Bereiten Sie zunächst 250 Mikroliter des optimalen Mediums vor und inkubieren Sie je nach Virus 10 bis 12 Mikrogramm Lipo 2000 pro Transfektion fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur. Bereiten Sie während dieser Zeit die Plasmatransfektionsmischung in einem separaten Mikrozentrifugenröhrchen mit den für jede Virusrettung empfohlenen Mengen vor.Bringen Sie das Endvolumen mit Optimum auf 50 Mikroliter. Anschließend mit 250 Mikrolitern des optimalen Lipo-Gemischs in das Plasma-DNA-Transfektionsgemisch geben und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Um Vero-Zellen vorzubereiten, äquilibrieren sie zunächst das P-B-S-D-M-E-M 10%FBS 1%PS-Medium und das Trypsin-EDTA-Gemisch auf 37 Grad Celsius, um das Zellbüro zu ernten, waschen Sie die Kulturen zweimal mit fünf Millilitern PBS.Fügen Sie dann bei Bedarf einen Milliliter Trypsin EDTA zur Zellablösung hinzu und klopfen Sie sanft ab, um die Zellen vollständig zu lösen. Nun werden die Zellen in 10 Millilitern vollständigem DMEM in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen wieder suspendiert. Zentrifugieren Sie dann die Zellen fünf Minuten lang bei 1000 U/min und suspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern vollständigem DMEM.Zählen Sie die Zellen und stellen Sie die Konzentration auf eins mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter ein. Nach der 20- bis 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur geben Sie einen Milliliter Vero-Zellen in die optimale Lemin-DNA-Plasmid-Mischung und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Säen Sie nun die Lipo-DNA-Zellmischung in sechs Well-Platten.Vorsichtig schütteln und dann in den Inkubator stellen. Nach 16 bis 24 Stunden, nach der Transfektion, entfernen Sie das Transfektionsmedium und fügen Sie zwei Milliliter Infektionsmedienkultur hinzu, die Zellen für weitere 48 Stunden. Neben der Passage entfernen die Zellen den Gewebekulturüberstand, waschen die Zellen zweimal mit einem XPBS und Trypsin kühlen die Zellen ein, wie zuvor gezeigt.Dann resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter vollständigem DMEM, um die Zellen fünf Minuten lang zu pelletieren. Bei 5.000 U/min und vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie die Pellets vorsichtig in einem Milliliter Infektionsmedium und geben Sie die Zellen in eine 100-Millimeter-Schale.Bei infektiösen Medien erhöhen Sie das Gesamtvolumen in der Platte auf acht Milliliter, ein ausreichendes Volumen, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern und das Virus zu konzentrieren. Schütteln Sie die 100-Millimeter-Schale vorsichtig, um nach der Kultur eine gleichmäßige Monoschicht aus transfizierten Zellen zu erhalten. Nach 72 Stunden sammeln Sie die Gewebekulturüberstände, zentrifugieren Sie, um die Zelltrümmer zu entfernen, und lagern Sie die Überstände am Tag vor der Titration bei minus 80 Grad Celsius.Waschen Sie die Vero-Zellen zweimal mit PBS und Trypsineis. Nach der Reanimation werden die Zellen in 10 Millilitern vollständigem DMEM suspendiert. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und stellen Sie die Konzentration auf viermal 10 der vier Zellen pro Vertiefung ein, dann bereiten Sie 96-Well-Platten vor, um eine flüssige Flüssigkeit von 80 bis 90 % zu erreichen.Am nächsten Tag. Schütteln Sie die Platten vorsichtig mit der Hand, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu erhalten. Kultivieren Sie die Zellen für die Nacht am Tag der Infektion.Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um eine Monoschicht zu bestätigen, bevor Sie mit der Infektion fortfahren. Verdünnen Sie nun seriell das Virus, das Gewebekulturüberstände enthält, die zuvor optimal in einer 96-Well-Platte gewonnen wurden, und aspirieren Sie dann das Medium aus den ausgesäten Vero-Zellen. Waschen Sie sich zweimal mit 50 Mikrolitern PBS und infizieren Sie die Zellen mit 50 Mikrolitern des seriell verdünnten Virus.Infizieren Sie die Zellen für eineinhalb Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Entfernen Sie anschließend das Virusinokulum bei 100 Mikrolitern Infektionsmedium pro Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen 16 bis 18 Stunden lang. Entfernen Sie nun jeweils die Gewebekulturüberstände.Fixieren Sie die Zellen gut mit 4% Formaldehyd, verdünnt in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Dann das Formaldehyd entfernen und mit 0,1% Trite X 100 bei Raumtemperatur 10 Minuten permeasen. Anschließend die Permeationslösung aspirieren und dreimal mit 100 Mikrolitern PBS-Lock-Zellen mit 2,5 % Rinderalbuminserum waschen.Verdünnen Sie den primären Antikörper, der spezifisch für ein Arenavirus-Protein ist, in 2,5 % BSA und zentrifugieren Sie ihn 15 Minuten lang. Bei 3.500 U/min werden die Zellen mit dem Antikörper eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert, nachdem sie dreimal PBS mit einem geeigneten Fluor-Vier-konjugierten Sekundärantikörper für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius gewaschen wurden. Entfernen Sie den Sekundärantikörper und waschen Sie ihn dreimal mit 100 Mikrolitern PBS.Als nächstes titrieren Sie durch Zählen von fluoreszierenden Fokusformungseinheiten mittels Fluoreszenzmikroskopie. Ähnlich wie das rekombinante Wildtyp-Arenavirus. Titrieren Sie das tric segmentierte Virus, indem Sie zuerst das in der Gewebekultur vorhandene Virus seriell verdünnen, dann den Überstand infizieren Sie Vero-Zellen in 96 Well-Platten nach 16 bis 18 Stunden Inkubationszeit, titrieren Sie durch Zählen des Fluoreszenzfokus und bilden Sie Einheiten unter Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie.Alternativ können Sie die erfolgreiche Virusrettung durch Gaia-Luciferase-Expression mit 100 Mikrolitern Gewebekulturüberständen in einer weißen 96-Well-Platte messen. Richten Sie das Luminometer gemäß den Empfehlungen des Herstellers ein. Geben Sie 50 bis 100 Mikroliter Gaia-Assay-Lösung zu jeder Probe.Messen Sie dann die Expression des Gaia-Reportergens mit dem Luminometer als Negativkontrolle. Messung der Gaia-Expression aus TCS von Wildtyp-Virus-infizierten Zellen. Arena-Viren sind behüllte RNA-Viren mit negativem Sinn und bi-segmentierten Genomen.Jedes Segment verwendet eine Ambi-Sense-Beschichtungsstrategie, um die Synthese von zwei viralen Proteinen zu steuern. In entgegengesetzter Ausrichtung werden zwei Arten von Rescue-Plasmiden zur Erzeugung von rekombinanten Arenaviren in Vero-Zellen verwendet. Die PCA-Expressionsplasmide steuern die Synthese der viralen Proteine L und np.Das humane Polymerase-ein-Plasmid steuert die Synthese der viralen RNA-Abschnitte. Die erfolgreiche Rettung eines rekombinanten Wildtyp-Arenavirus wird durch das Vorhandensein von viralen Antigenen mittels IFA nach 16 bis 18 Stunden bestätigt. Nach der Infektion von Vero-Zellen durch Gewebekultur werden die überstehenden Zellen mit LCMV- oder Caniden-Nr. 1-spezifischen Antikörpern gefärbt.Bei der Rettung der humanen Polymerase durch das Tris-segmentierte Arenavirus wird ein Plasmid in zwei Plasmide in einem Plasmid getrennt. NP wird durch GFP ersetzt und im anderen Plasmid wird das GP durch das Gaia-Gen ersetzt. Eine erfolgreiche Virusrettung kann einfach durch Beobachtung der GFP-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie beurteilt werden.Darüber hinaus kann eine erfolgreiche Rettung durch die Beurteilung der Gaia-Expression bestätigt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie sowohl Wildtyp- als auch Tris-segmentierte Arenaviren in Vero-Zellen mit hoher Reproduzierbarkeit retten können. Wir empfehlen drei unabhängige Transfiktionen für jedes empfohlene Virus, um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Rettung zu erhöhen, da schwere Zellen nicht leicht transfiziert werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Ein optimiertes und standardisiertes Verfahren zur Generierung von hochtiternden, qualitativ hochwertigen Adeno-assoziierten Virusvektoren unter Verwendung einer Zellfabrikplattform

Erfahren Sie die Erzeugung rekombinanter Arenaviren in FDA-zugelassenen Vero-Zellen für die Impfstoffentwicklung. Diese Methode nutzt Plasmid-Transfektion und Immunfluoreszenz zur Bestätigung des Virus-Rescue.

Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen

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