Die Quantifizierung der Atem Burst Antwort als Indikator für Angeborene Immunsystem Gesundheit in Zebrafisch

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Fluoreszenz zur Quantifizierung der respiratorischen Burst-Reaktion zu verwenden. Laden Sie zunächst die Zebrafischembryonen in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Fügen Sie dann ein fluoreszierendes Substrat hinzu und aktivieren Sie den Atemstoß mit einem chemischen Mittel.

Quantifizieren Sie dann die relative Fluoreszenz mit einem Fluorimeter. Letztendlich wird die Fluoreszenz verwendet, um das respiratorische Burst-Potenzial anzuzeigen. Mit dieser Methode kann untersucht werden, wie sich experimentelle Manipulationen auf die allgemeine Gesundheit des angeborenen Immunsystems auswirken.

Hier verwenden wir es, um Einblicke in den Atemausbruch von Zebrafischembryonen zu geben, aber es kann auch auf andere Systeme wie adulte Zebrafische, Nierenzellen und Zellpräparate anderer Fischarten angewendet werden. Züchten Sie die Embryonen in tiefen Petrischalen bei 28 Grad Celsius in Eiwasser bis zum gewünschten Entwicklungsstadium. Entferne täglich alle toten Embryonen.

Das alte Eiwasser vorsichtig umfüllen und täglich mit neuem Eiwasser auffüllen. Stellen Sie am Tag des Experiments eine reduzierte Fluoreszein-Arbeitslösung in einem mit Folie umwickelten 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen her. Bereiten Sie auch eine Arbeitslösung mit 20 Mikrogramm pro Milliliter PMA-Endkonzentration vor.

Stellen Sie dann von jeder Dosierlösung fünf Milliliter in konischen 15-Milliliter-Röhrchen her, wie im Begleittext beschrieben. Halten Sie die Dosierlösungen auf Eis, schalten Sie zuerst den Mikroplatten-Reader ein und erwärmen Sie die Lichtquelle, um die Fluoreszenz zu messen. Richten Sie ein Programm ein, in dem die Anregungs- und Emissionswellenlängen sowie die Positionsempfindlichkeit der Optik aufgeführt sind, und fügen Sie auch einen fünfsekündigen Schüttelschritt hinzu.

Ordnen Sie vor dem Schilf die experimentellen Vorräte von Schalen mit beschichteten Embryonen an. Eine schwarze 96-Well-Mikroplatte, eine P 200-Pipette und eine Spitze eines Eiskübels mit dem Fluorescein, das Reagenzien enthält. Eine Mehrkanalpipette P 200, zwei sterile Reservoire, Aluminiumfolie und eine Schere.

Schneide nun eine Pipettenspitze so ab, dass die Embryonen oder Nieren durch die Öffnung passen. Setzen Sie eine P 200-Pipette auf 100 Mikroliter und geben Sie einen Embryo zusammen mit Eiwasser in so viele Vertiefungen einer schwarzen 96-Well-Mikroplatte wie gewünscht. Gießen Sie nun die Dosierlösung mit einer Mehrkanalpipette P 200 in ein steriles 25 Milliliter Reservoir.

Geben Sie 100 Mikroliter H 2D CFDA-Dosierlösung in eine Säule der 96. Nun: Mikroplatten-Wiederholung für die Hälfte der Kontrollembryoproben und die Hälfte der experimentell manipulierten Embryoproben. Gießen Sie die PMA-haltige Dosierlösung in ein neues steriles 25-Milliliter-Reservoir.

Aliquotieren Sie dann diese Dosierlösung in die verbleibenden Säulen der 96-Well-Mikroplatte. Decken Sie die Mikroplatte mit Alufolie ab und legen Sie sie für ca. 20 Sekunden auf einen Shaker. Inkubieren Sie die Mikroplatte bei 150 U/min, wenn sie nicht abgelesen wird.

Lesen Sie die Mikroplatte nach der Zugabe von PMA ab. Führen Sie weiterhin alle paar Minuten Messungen für das gewünschte Zeitintervall durch oder inkubieren Sie die mit Folie umwickelte Mikroplatte bei 28 Grad Celsius bis zu einem festgelegten Zeitpunkt. Als nächstes entnehmen Sie die Embryonen aus den Vertiefungen, euthanasieren Sie die Embryonen gemäß dem institutionellen Tierpflege- und Verwendungsprotokoll.

Entsorgen Sie auch die Mikroplatte und andere Einwegmaterialien im Maler für biogefährliche Abfälle. Entscheiden Sie sich für den Zeitpunkt, zu dem Sie die Fluoreszenz vergleichen möchten. Subtrahieren Sie den durchschnittlichen Fluoreszenzwert der uninduzierten Kontrollgruppe von den Grippefluoreszenzwerten der einzelnen PMA-induzierten Kontrollgruppe.

Wiederholen Sie dies für die Versuchsgruppe mit und ohne PMA. Speichern Sie dann diese normierten Fluoreszenzwerte in den Spalten, der Kontroll- und PMA-Gruppe und der experimentellen plus PMA-Gruppe. Berechnen Sie als Nächstes die Mittelwerte und Standardabweichungen für die normierten Fluoreszenzwerte der Kontroll- plus PMA-Gruppe und der experimentellen plus PMA-Gruppe.

Vergleichen Sie die normierten Fluoreszenzwerte mit einem ungepaarten T-Test, um die statistische Signifikanz zu bestimmen. Stellen Sie nun die Mittelwerte der Kontroll- plus PMA-Gruppe und der experimentellen plus PMA-Gruppe mit Fehlerbalken dar, die die entsprechenden Standardabweichungen widerspiegeln, und zeichnen Sie das Signifikanzniveau im Diagramm und in der Abbildungslegende auf. Dieses Experiment vergleicht die respiratorische Burst-Reaktion in Wildtyp-Zebrafischembryonen mit AB-Hintergrund 48 Stunden und 72 Stunden nach der Befruchtung.

Die Rohfluoreszenz wurde vier Stunden nach der Zugabe von PMA in den PMA-induzierten Gruppen gemessen. Die Rohfluoreszenzwerte waren in der 72-HPF-Population höher. Wie aus den berechneten Mittelwerten hervorgeht, sind die Fluoreszenzwerte normalisiert, um die Variabilität der Hintergrundwerte der Fluoreszenz zu berücksichtigen.

Die Ergebnisse dieses respiratorischen Burst-Assays zeigten, dass die 72 HPF-Zebrafischembryonen in der Lage sind, signifikant reaktivere Sauerstoffspezies zu produzieren und daher eine robustere respiratorische Burst-Reaktion als 48 HPF-Embryonen nach Induktion mit PMA zu zeigen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Fluoreszenz verwenden können, um das respiratorische Burst-Potenzial von Zebrafischembryonen zu quantifizieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit PMA-Pulver extrem gefährlich sein kann, also treffen Sie Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen einer Gesichtsmaske, während Sie PMA-Pulver abwiegen.