Polyäpfelsäure-basierten Nano Biopolymere für Targeting mehrerer Tumormarker: Eine Chance für die personalisierte Medizin?

Das übergeordnete Ziel besteht darin, eine nanoskalige Plattform zu etablieren, die eine universelle Methode zur Synthese individualisierter Medikamente auf der Grundlage des genetischen Profils der Erkrankung einer Person ermöglicht, insbesondere bei Krebs. Zunächst wird Poly-malicsäure aus dem Mikroorganismus *Physarum polycephalum* hergestellt und gereinigt, gefolgt von einer chemischen Aktivierung der gereinigten PMLA an ihren Seitenketten. Carboxygruppen werden aktiviert, um durch Substitution kleine funktionelle Gruppen und den Linker MEA anzukoppeln; anschließend werden die nicht verwendeten aktiven Gruppen durch Hydrolyse wieder in Carboxygruppen zurückverwandelt.

Fügen Sie anschließend die Antikörper und Antisense-Moleküle über die Sulfhydrylgruppen des Spacers, MEA und Cap hinzu. Der ungenutzte Spacer wird durch Reaktion mit PDP nach Abschluss des Tests auf Zusammensetzung und Funktion der Leitstruktur überprüft. Nanomedikamente ergeben sich aus einem Tiermodell wie Mäusen, die aggressives menschliches Gewebe tragen.

HER2-positive Brustkrebs kann die Wirksamkeit der Behandlung bestimmen und auch, ob die Behandlung ohne unerwünschte Nebenwirkungen erfolgt. Der Hauptvorteil der Bioproduktion gegenüber bestehenden synthetischen Methoden wie der Zopf-Polymerisation besteht darin, dass das Biopolymer volle optische Reinheit behält und nicht mit Nebenprodukten verunreinigt ist. Diese Familie von PolyPhen-Nanoarzneimitteln kann beliebige Zelltypen basierend auf spezifischer Zielgerichtetheit ansprechen und die Proteinausprägung regulieren.

Im Allgemeinen ist die Krebsbehandlung mittels PHE-Nanoarzneimitteln bei mehreren Tiermodellen sehr effizient, insbesondere bei primären Gehirn- und Brustkrebserkrankungen. Unsere ursprüngliche Idee bestand darin, diese Methode zur Hemmung der Synthese glioblastom-spezifischer Lamine in Isoformen zu nutzen, und später konnten wir nachweisen, dass gezielt die HER2-Proteine sowie Proteine des triple-negativen Brustkrebses inhibiert werden können, um das Tumorwachstum zu verhindern. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur Krebsdiagnose mittels optischer und magnetresonanzbasierter Bildgebung.

Poly-Nano-Arzneimittel können Erkenntnisse zur Arzneimittelabgabe bei der Krebsbehandlung liefern. Sie können auch bei anderen pathologischen Zuständen wie Infektionskrankheiten, Schmerzlinderung und neurologischen Erkrankungen angewendet werden. Nach dem Anzüchten einer Impfkultur des Plasmodiums von Spial auf Auger werden 100 Milliliter Basalkulturmedium beimpft und die Kultur bei 25 Grad Celsius kultiviert.

Der Thermos-Inkubator erzeugt eine bestimmte Menge an gravitativ gepacktem Mikroplasma-Modium unter Lichtausschluss. Um eine Sporulation in einem 10-Liter-Bioreaktorbehälter zu vermeiden, lösen Sie 80 Gramm Calciumcarbonat in acht Litern Basalmedium auf, überführen Sie anschließend das gepackte Mikroplasma-Modium in den montierten Reaktionsbehälter und führen Sie den Bioprozess für 75 Stunden bei 25 Grad Celsius mit einem Luftstrom von 10 Litern pro Minute und einer Rührgeschwindigkeit von 150 U/min mittels Segmentrührer durch.

Wenn die Kulturbrühe einen pH-Wert von 4,8 aufweist, stoppen Sie die Kultur, um die Produktion von Poly-Maleinsäure zu messen. Kühlen Sie die Brühe nun auf 17 Grad Celsius ab, lassen Sie die Zellen durch Schwerkraft sedimentieren und entfernen Sie das Kulturüberstand aus dem Reaktor. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,5 ein.

Pumpen Sie nun das Supernatant von der Unterseite durch eine 1,5-Liter-DEAE-Zellulose-Säule, die mit 20 Millimolar Tris-Hydrochlorid, pH 7,5, bei fünf Grad Celsius equilibriert wurde. Danach lassen Sie drei Säulenvolumina Waschpuffer mit 0,3 Molar Natriumchlorid von der Unterseite zur Oberseite der Säule laufen und eluieren die PMLA in Gegenwart von 0,7 Molar Natriumchlorid. Stellen Sie die eluierte PMLA-Fraktion auf 0,1 Molar Calciumchlorid ein und geben Sie 80 % eiskalten Ethanol hinzu, um das PMLA-Calcium zu fällen. Führen Sie anschließend eine Größenausschlussfraktionierung des PMLA-Calciums mit Cidex G 25 und Wasser durch.

Schließlich wird jede Fraktion über eine Amber-Licht-Säule geleitet und der Durchfluss sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren, anschließend lyophilisiert und bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Zur Aktivierung der Carboxylgruppen von PMLA werden ein Millimol Mala-Einheiten von P-M-L-A-H in einem Milliliter wasserfreiem Aceton und jeweils ein Millimol Hydroxy-CIN-Aid und Cylo-Heyl-Carboid in zwei Millilitern Dimethylformamid gemischt. Nach dreistündiger Rührung bei 20 Grad Celsius werden 0,05 Millimol Methyl-Pega-Min in einem Milliliter DMF sowie 0,05 Millimol Triethylamin zugegeben.

Danach 0,4 Millimol Leucinethylester tropfenweise zugeben und nach einer Stunde das Reaktionsende durch eine negative Hyn-Reaktion in der Dünnschichtchromatographie überprüfen. Ebenso 0,1 Millimol 2-Mercapto-1-ethylamin und 0,5 Millimol TEA zugeben. Den überschüssigen NHS-Ester durch spontane Hydrolyse mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung entfernen.

Desalzierung über eine PD-10-Säule durchführen und lyophilisieren, um ein weißes Pulver zu erhalten; diesen Prä-Konjugat trocken bei minus 20 Grad Celsius lagern. Als Nächstes 30 Milligramm Antikörper in 4,5 Milliliter 150 Millimolar Natriumchlorid in 100 Millimolar Natriumphosphat, pH 5,5, zugeben. Die Disulfidbindungen mit fünf Millimolar Tris, zwei Carboxyethylphosphin-Hydrochlorid reduzieren und über eine PD-10-Säule reinigen.

Lösen Sie nun das IDE PEG IDE in zwei Millilitern des oben genannten Puffers, jedoch bei pH 6,3, auf. Geben Sie den reduzierten Antikörper hinzu und rühren Sie eine Stunde lang bei 20 Grad Celsius. Konzentrieren Sie die Lösung auf 2,5 Milliliter über AVEVA spin 20 mit 30 Kilodalton Ausschluss und reinigen Sie anschließend über cidex G 75.

Überprüfen Sie nun das Produkt mittels SEC-HPLC. Messen Sie die Menge bei 280 Nanometern und bestätigen Sie zusätzlich das Fehlen von Verunreinigungen bei anderen Wellenlängen. Als Nächstes mischen Sie 50 Milligramm des Prä-Konjugats mit 200 MLEs des Antikörper-PEG-IDE-Konjugats in fünf Millilitern Puffer mit pH 6,3.

Stellen Sie die Konzentration von Sulfhydrol auf zwei Millimolar ein und inkubieren Sie bei 20 Grad Celsius für drei Stunden. Um eine 98 % Ausbeute an löslichem Produkt zu erhalten, lassen Sie das drei-Ende-amin-modifizierte Antisense-Oligonukleotid mit einem Volumen SPDP reagieren, reinigen das A-O-N-P-D-P über Sephadex LH-20 in Methanol, verdampfen anschließend das Methanol, lösen das Produkt in Wasser auf und lyophilisieren es. Inkubieren Sie danach 800 Nanomol des aktivierten AOS mit dem Antikörper-PEG-Vorkonjugat zu MEA-SH über Nacht. Sobald die Disulfid-Austauschreaktion beendet ist, koppeln Sie den fluoreszierenden Farbstoffblock an, blockieren die überschüssigen Sulfhydrolgruppen mit PDP und reinigen über Sephadex G-75.

Lagern Sie das endgültige auf Poly-Milchsäure basierende Nanomedikament bei minus 20 Grad Celsius. Um den Gehalt an Poly-Milchsäure während der Herstellung zu bestimmen, verfahren Sie wie folgt: Geben Sie zu 320 Mikrolitern Probe 160 Mikroliter 10%iger Hydroxylammoniumchloridlösung und 160 Mikroliter 10%iger Natriumhydroxidlösung hinzu. Nach 10 bis 15 Minuten versetzen Sie die Mischung mit 160 Mikrolitern 5%iger Eisen(III)-chloridlösung und beobachten die Bildung einer dunkelvioletten Färbung bei 540 Nanometern. Anschließend hydrolysieren Sie das Nanomedikament über Nacht in zwei molarer Salzsäure bei 110 Grad Celsius unter Verwendung einer versiegelten Ampullenprobe und weisen Maleinsäure mittels umgekehrter Phasenchromatographie nach.

Unter Verwendung von Proben, die mit Standardsäure Maleinsäure versetzt wurden. Spalten Sie nun das Nanomedikament mit 100 Millimolar Dihi-Drei-Etol und messen Sie die morph-Antisense-Oligonukleotide mittels quantitativer umgekehrter Phasen-HPLC gegen morpho-ein-ON-Standards. Bestimmen Sie unter Verwendung des gespaltenen Nanomedikaments den Antikörpereinsatz mit einem Protein-Assay-Kit, um den Malik-PEG-Gehalt zu quantifizieren.

Zunächst mit Ammoniumthiocyanat umsetzen, anschließend mit Chloroform extrahieren und die Extinktion bei 510 Nanometern messen. Testen Sie die Antikörperaktivität und Co-Ligation mittels ELISA unter Verwendung von fünf Mikrolitern Nanodroge pro Mulde und 0,5 Mikrogramm pro Mulde von HER2 als plattengebundenem Antigen. Berechnen Sie schließlich den erreichten Prozentsatz für Antisense-Oligonukleotid, EG und Antikörper in Bezug auf Maleinsäure.

Vergleichen Sie dies mit dem durch das Arzneimitteldesign angestrebten Prozentsatz. Dieser bimodale strategische Ansatz beim Nanomedikament verwendet Herceptin, um den HER2-Signalweg und HER2-spezifische Antisense-Oligonukleotide (aON) zur Blockade der Transkription des HER2-Rezeptors zu hemmen; Antikörper ermöglichen die Transzytose über den endothelialen TFR der Tumorgefäße. Die nanostrukturierte Konjugatplattform aus Poly(maleinsäure) wurde durch kultivierte Mikroplasmodien erzeugt und durch Aktivierung der carboxylieren Gruppen des PMLA gereinigt, wodurch die Synthese des Prä-Konjugatgerüsts erleichtert wurde.

Und schließlich der Blei-Nano-Konjugat. ELISA-Analysen zeigten den Erhalt aktiver monoklonaler Antikörper während der gesamten Nano-Wirkstoff-Synthese. Mit beiden Antikörpern, die auf der gleichen Polymerplattform angeordnet waren, wurde die zelluläre Aufnahme des Nano-Wirkstoffs mittels fluoreszenzkonfokaler Mikroskopie verfolgt.

Die überlagerten Bilder von null und drei Stunden wurden gemeinsam mit den markierten Endosomen analysiert. Die Pearsonschen Korrelationskoeffizienten für die Kolokalisation deuten auf eine Freisetzung des Nanomedikaments aus den Endosomen in das Zytoplasma sowie auf eine Abspaltung einer ON vom Nanomedikament durch eine glutathionabhängige Disulfidspaltung im Zytoplasma hin. In vitro hemmte das führende Nanomedikament das Wachstum am wirksamsten in der HER2-überexprimierenden Zelllinie.

In vivo-Experimente an Mäusen mit BT 4 74, HER zwei überexprimierendem menschlichem Brustkrebs, zeigten eine Wachstumshemmung von mehr als 95 % durch das führende Nanomedikament, das Herceptin enthält. Und HER zwei-spezifische A ON-Untersuchungen mittels Western Blot ex vivo wiesen auf eine Hemmung sowohl der HER zwei-Synthese als auch der Phosphorylierung von a KT und einer Spaltung von PARP hin, was auf Apoptose schließen lässt. Die Tumorremission als Reaktion auf die Medikamentenbehandlung zeigt sich in der Tumorschrumpe und der Verringerung der Tumorzellen bei histologischer Untersuchung.

Sie sollten nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine biokompatible Nano-Plattform nutzt, um eine wirksame personalisierte Therapie ohne Nebenwirkungen zu erreichen und ein Nano-Arzneimittel mit kontrollierter Zusammensetzung und nachgewiesenen funktionellen Aktivitäten herzustellen. Sobald diese Methode beherrscht ist, können diese Sensoren nach der Entwicklung mit hoher Reproduzierbarkeit durchgeführt werden. Diese Technik, die eine poly saure Nano-Plattform für die gezielte Abgabe von Antisense-Oligonukleotiden verwendet, ebnet Forschern auf dem Gebiet der personalisierten Nano-Medizin den Weg, Tumortherapien zu erforschen, die auf spezifische molekulare Tumormarker abzielen, die durch personalisierte genetische Analysen identifiziert wurden. Pharmakologisch können Wirkstoffe und Zellen äußerst gefährlich sein.

Es sollten stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen einer Maske und von Handschuhen beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.