Name: Polyäpfelsäure-basierten Nano Biopolymere für Targeting mehrerer Tumormarker: Eine Chance für die personalisierte Medizin? (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 20 s
Description: Erfahren Sie die Synthese von Polyäpfelsäure-basierten Nanodrogen zur gezielten Krebstherapie. Diese Methode ermöglicht personalisierte Behandlungen durch Antikörper-vermittelte Zielgerichtetheit bei Her2-positivem Mammakarzinom.

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Wir danken sehr für die finanzielle Unterstützung durch NIH R01 CA123495, U01 CA151815, R01 CA136841, Zuschüsse von der Abteilung für Neurochirurgie am Cedars-Cedars Medical Center und Arrogene Technology Inc.

Alle Experimente mit amtlichen Tier Vorschriften, einschließlich chirurgischen und nicht-chirurgischen Verfahren in vivo durchgeführt und sind in voller Übereinstimmung mit IACUC Protokolle erfüllen. 1. Bioproduktion von Polyäpfelsäure <ol><li> Wachsen Sie eine Vorkultur von Kügelchen auf Agar und übertragen Plasmodien auf 100 ml Kulturmedium mit einer 25 ° C Thermo genannten Inkubator und basalen Kulturmedium 8,9. </li><li> Produzieren einen Betrag von Schwerkraft-verpackt 500 ml Mikro Plasmodien unter Ausschluss von Licht, um die Sporenbildung zu vermeiden. </li><li> Bereiten Sie in 80 L 8 Basismedium in 10-l-Bioreaktor suspendiert g CaCO3. Übertragen Sie die 500 ml verpackt Mikro Plasmodien in das Reaktionsgefäß montiert und ermöglichen die Bioprozess für 75 Stunden bei 25 ° C, 10 l / min Volumenstrom gefilterter Luft und 150 rpm Rühren mit einem Rührer Segment. </li><li> Zu beenden, wenn die Kulturbrühe hat pH 4,8, der das Ende der Produktion von PMLA und messen PMLA Inhalt von ter Hydroxamat / Fe (III)-Assay. </li><li> Kühlen Sie die Brühe auf 17 ° C und lassen Zellen durch die Schwerkraft zu begleichen. </li><li> Abkühlen auf 4 ° C und auf pH 7,5, 2 M NaOH zu verwenden. Pumpe den Überstand durch ein mit 1,5 l DEAE-Cellulose in der Richtung von unten nach oben (Grobkorn DEAE, mit 20 mM Tris-HCl pH 7,5 bei 5 ° C äquilibriert) gefüllte Säule. </li><li> Wäscht mit 3 Säulen-Puffer, enthaltend 0,3 M NaCl nach dem Ändern der Richtung von oben nach unten und eluieren PMLA in Gegenwart von 0,7 M NaCl. </li><li> Passen auf 0,1 M CaCl 2 und fällt PMLA-Calcium mit 80% eiskaltem Ethanol. Fraktionierung über Sephadex G25 in PMLA-Kalzium von 80 bis 300 kDa, 50-80 kDa und 10-50 kDa, verwenden Sie Wasser in Abwesenheit von Puffer und Salz. </li><li> Führen Sie jede Fraktion über eine Amberlite IR 120H + Spalte und sofort frieren die Durchfluss Polyäpfelsäure in flüssigem Stickstoff für die Lyophilisation. </li><li> Lösen Sie in trockenem Aceton. Nach der Filtration wird das Lösungsmittel entferntin trockenen Luftstrom, lyophilisiere und lagern bei minus 20 ° C </li></ol> 2. Synthese von Polyäpfelsäure-basierten Nano Drug <ol><li> Aktivieren Carboxylgruppen PMLA (P) durch Mischen 116 mg (1 mmol Malyl Einheiten) PMLA-H in 1 ml wasserfreiem Aceton und 1 mmol N-Hydroxysuccinimid und 1 mmol Dicyclohexyl Carbodiimid in 2 ml Dimethylformamid (DMF). Rühren bei 20 ° C für 3 Stunden. Hinzufügen 0,05 mmol mPEG 5000-NH 2 (0,05 Mol-% Einheiten Malyl) in 1 ml DMF, gefolgt von 0,05 mmol Triethylamin (TEA). </li><li> In DMF tropfenweise 0,4 mmol leucinethylester (Loet) (40 Mol-% Einheiten Malyl), gelöst mit 0,1 mmol 2-thiol-1-ethylamin (2-MEA) (10 Mol-% der Einheiten Malyl) und 0,5 mmol TEA, Alle in DMF gelöst. Nach jeder Zugabe 1 h ermöglichen und überprüfen Abschluss der Reaktion durch negative Ninhydrin-Reaktion (Dünnschicht-Chromatographie, DC). </li><li> Entfernen übrig gebliebenen NHS-Ester, der durch spontane Hydrolyse mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (30 min, pH 6,8). Desalt über PD-10 Spalte erhalten &quot;preconjugate&quot; als weißes Pulver lyophilisiert. Trocken lagern bei minus 20 ° C </li><li> Man löst 30 mg Antikörper (mAb, IgG2a-κ) in 4,5 ml 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 5,5. </li><li> Reduzieren Disulfidbindungen mit 5 mM Tris (2-carboxy-ethyl)-phosphin-hydrochlorid 30 min bei 20 ° C und Reinigung über PD-10-Säule. </li><li> Auflösen Mal-PEG 3400-Mal in 2 ml des gleichen Puffers und fügen reduziert mAb an Endvolumen von 10 ml zugegeben und über Nacht bei 4 ° C. Konzentrieren Sie sich auf 2,5 ml über Vivaspin 20, Ausschluss 30 kD und reinigte über Sephadex G75. Überprüfen Produkts über SEC-HPLC und messen Menge photometrisch bei 280 nm Wellenlänge. </li><li> Befestigen Mal-PEG-Mal-mAb &quot;preconjugate&quot; Thiole Erhalten P / PEG 5000 (5%) / Loet (40%) / mAb (0,2%) / 2-MEA (10%). Dies geschieht durch Mischen von 5 ml von 200 nmol mAb-PEG 3400-Mal um 50 mg (P / mPEG 5000 / LOEt/2-MEA) in dem obigen Puffer, pH 5,5, einzustellen Konzentration sulfhyDryl bis 2 mM und Inkubation bei 20 ° C für 3 Stunden (Ausbeute 98%). </li><li> Solubilisierung 3&#39;-H 2 N-AON in DMF / PBS (pH 7,2) und reagieren mit N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionat (SPDP) in (1:1 v / v) DMF / Methanol (Ninhydrin-Test ) und zu reinigen, AON-PDP über Sephadex-LH20 in Methanol, dann in Wasser und lyophilisiere. </li><li> Inkubieren 800 nmol aktiviert AONs in der pH 5,5-Puffer mit der oben hergestellten Mal-PEG 3400-Mal-mAb-preconjugate über Nacht, bis der Disulfid-Austauschreaktion wird beendet. </li><li> Integrieren fluoreszierenden Alexa Fluor 680-Maleimid bilden Thioether mit Polymer-2-MEA-SH. Blockieren Über Sulfhydryle mit 3-pyridyldithio-propionat (PDP) und zu reinigen, über Sephadex G75. Lagerung bei 4 ° C oder Schnapp bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung eingefroren. </li></ol> 3. Assays und Eigenschaften <ol><li> Führen Prüfungen auf Reinheit und Stabilität in Serum und PBS bei 4 ° C und 37 ° C durch SEC-HPLC-Analyse. Verwenden Polystyrensulfonat als Moledere Gewichtsstandards. Messen Nanogrößenverteilung und Zeta-Potentiale. Verwenden kommerzielle Systeme. </li><li> In den 320 &amp;mgr; l-Probe 160 ul 10% (w / v) Hydroxylammoniumchlorid und 160 ul 10% (w / v) NaOH. Nach 10-15 min mischen mit 160 ul 5% (w / v) Fe (III) Cl 3 in 12% (v / v) HCl und lesen 540 Hydroxamat / Fe (III). Berechnet unter der Annahme PMLA 1 mg / ml PMLA entspricht 2,5 A 540. </li><li> Hydrolysieren die Nano Medikament über Nacht in 2 M HCl bei 110 ° C und Assay-Äpfelsäure auf Reversed Phase Chromatographie mit Bezug auf Proben gespickt mit Apfelsäure-Standards. Spalten das Medikament nano mit 100 mM Dithiothreitol und messen Morpholino-AON durch quantitative Umkehrphasen-HPLC gegen Morpholino AON-Standards. </li><li> Nehmen Sie nano Medikament ohne Spaltung und messen mit Hilfe eines Antikörper-Protein-Assay-Kit. Quantifizieren mPEG, indem die Reaktion mit Ammonium ferrothiocyanate, extrahieren Sie dann mit Chloroform und Extinktion bei 510 nm Wellenlänge 10 </sup&gt;. </li><li> Führen ELISA mit 5 ul von Nano-Arzneimittel (1-10 ug mAb) pro Bohrlochtests und Antikörperaktivität Colligation. Verwenden Sie 0,5 ug / Well Transferrin-Rezeptor und HER2 jeweils als Platte beschichtete Antigene und Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörper. </li><li> Berechnung erzielt% für AON, MPEG und mAb hinsichtlich Äpfelsäure (100%) und Vergleichen mit dem% nach Design bestimmt (siehe Beispiele Tabelle 1 und Tabelle 2). </li></ol> 4. In-vitro-Tests <ol><li> Inkubieren Sie die nano Medikament mit kultivierten Krebszellen und Maßnahme überlebenden Zellen im Laufe der Zeit durch ihre Tätigkeit auf gelb Reagenz [3 reduzieren - (4,5-2-yl) -5 - (3-Carboxymethoxyphenyl) -2 - (4-Sulfophenylgruppe )-2H-Tetrazolium, inneres Salz] (MTS) zu einem blauen Farbstoff und lesen relativer Absorption mit einem Photometer. Folgen Sie den Anweisungen von der Ausrüster. </li><li> Bereiten Zellextrakten in vitro oder ex vivo für Western-Blot. Verwenden eiskalten Extraktions bUffer, die SDS und Protease-Inhibitor-Cocktail enthält. Getrennte Proteine ​​durch reduzierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. </li><li> Tun Western Blotting von Proteinen von Interesse in der Probenextrakte. Verwenden Sekundärantikörper konjugiert an alkalische Phosphatase. </li><li> Verwenden Sie die konfokale Mikroskopie, um die Zellaufnahme und Co-Lokalisation von Nano-Arzneimittelpolymerplattform, AON und Endosomen demonstrieren mit Fluoreszenzmarkierung. Bringen Alexa Fluor 680 in den Nano-Konjugat-Plattform-und Lissamin zu AON als Fluoreszenzmarkierungen. Verwenden Sie ein Mikroskop 5X spektrale Scanner und lebenden Krebszellen, um die Verteilung der markierten Moleküle sichtbar </li><li> Stain Endosomen-Membranen mit Styryl Red Fluoreszenzfarbstoff und zeigen Endosomen Kolokalisation oder Freigabe. </li></ol> 5. In-vivo-Tests <ol><li> Bereiten Sie den menschlichen HER2-positiven Brustkrebs-Mausmodell (Nacktmaus-Tac: Cr: (MCR)-Foxnnm). Legen Sie eine 0,72 mg 17β-Estradiol-freisetzenden Pellets (90-Tage Mitteilung) subcutaneously in den Hals einer jeden Maus. </li><li> Dann spritzen 1 x 10 7 BT-474 Tumorzellen subkutan in die rechte Flanke und ließ den Tumor wachsen. </li><li> Beginn der Behandlung, wenn die Tumore 120 mm 3 in der Größe durch Injektion in die Schwanzvene 150 &amp;mgr; l Konjugat Nano enthaltend 2,5 mg / kg AON-und / oder 4,5 mg / kg von jedem Antikörper. Für die Behandlung spritzen zweimal pro Woche, insgesamt sechs mal. </li><li> Messen der Tumorgröße mit Sättel zweimal die Schwachen und Volumen berechnen mit Hilfe der Formel (Länge x Tiefe x Breite) x (π / 6). Euthanize Tieren 2 Wochen nach der letzten Injektion und nach Sedierung mit einer Lösung von Ketamin und Dexmedetomidin durch Genickbruch folgte. </li><li> Isolieren Tumoren und Fleck Abschnitte mit H &amp; E für die morphologische Beurteilung. </li><li> Zur Beurteilung der Verteilung von Medikamenten an einem Tier Skala, mit einem Fluoreszenz-Imaging-System. Spritzen Sie die Alexa Fluor 680 markiert nano Drogen-und Bild 24 und 48 Stunden. </li><li> Euthanize das Tier und erfassen die Fluorescence in isolierten und perfundierten Tumoren und Organen. </li></ol>

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Die Autoren Julia Y. Ljubimova, Keith L. Schwarz, und Eggehard Holler sind Aktionäre der Arrogene Technology Inc.

Die experimentelle Weg zur Herstellung von Nano Medikamente aus einem biologisch abbaubaren natürlichen Polymeren vorgestellt, die bei der Synthese der personalisierte Medizin verwendet werden kann. Die Beschreibung beginnt mit der kontrollierten Produktion und Reinigung von Polyäpfelsäure, die eine vielseitige Plattform für Nano-Wirkstoffsynthese ist. Verwendung reproduzierbaren Verfahren wird das Polymer mit hohem Molekulargewicht und in extremen Reinheit für pharmazeutische Synthesen erhalten. Die Synthese wird zur Nano-Medikament, das gezeigt wird HER2-positiven Brustkrebs effizient behandeln beschrieben. Die Beschreibung kann in den meisten anderen Synthesen von Nano Arzneimittel für die Behandlung von Krebs übersetzt werden. Targeting beinhaltet Antikörper wie Herceptin, die ein tumorspezifisches Antigen, wie HER2-Protein oder andere Tumormarker, die effizient internalisiert binden. Die Nano Medikament liefert eine Auswahl von Antisense-Oligonukleotiden und Chemotherapeutika, die wirksam das Wachstum des Krebses zu inhibieren unter treatment. Im Beispiel Herceptin Bindung an HER2 und spezifische Antisense-Oligonukleotid Glühen mit HER2-kodierende mRNA führte zu anhaltenden Sperrung des HER2-Signalgebung und starken Reduzierung von HER2-positivem Brustkrebs. Basierend auf dem Prinzip der Tumor-Targeting und Hemmung der Genexpression durch Antisense-Oligonukleotide, haben wir aktuell mehrere andere nano Drogen und erfolgreich gehemmt präklinischen menschlichen Glioblastom-und triple-negativen Brustkrebs 11,14-18 synthetisiert. Das synthetische Arbeit beginnt mit der Herstellung von hochreinem nano Drogen Plattform, die Polyäpfelsäure aus dem Kulturüberstand von Physarum polycephalum (eine Art der &quot;Schleimpilz&quot;-Familie) ist. Die Herstellung betont hohen Molekulargewichten des Polymers im Prinzip die Anbringung zahlreicher Antikörpern, Peptiden, Oligonukleotiden und anderen Molekülen funktioniert im aktiven Arzneimittelabgabe und Hemmung des Tumorwachstums. Following der kontrollierten Kultivierung und Reinigung hat reproduzierbare Qualität des Polymers in vorhersehbare Erträge produziert. Das Polymer wird unter angenehmen Bedingungen für alle Zeit gespeichert. Die Synthese der Konjugate PMLA Nano beginnend mit der chemischen Aktivierung der Polymer-Anhänger Carboxylate erfolgt in wenigen Syntheseschritten durchgeführt. Zwischen den Schritten kann die Synthese gegebenenfalls auf Eis ermöglicht Herstellung von beliebigen Mengen von Zwischenprodukten angeordnet werden und somit kann in bis Skalierung verwendet werden. Der Fortschritt der Synthese wird durch TLC und HPLC-sec, und sowohl der Zusammensetzung und Aktivität der Nano Arzneimittel durch gruppenspezifische quantitative chemische Assays, ELISA und einer Vielzahl von physikalischen Messungen gesteuert. Unsere Erfahrung ist, dass diese Synthesen reibungslos und reproduzierbar mit sehr guten Ausbeuten und Reinheit fortgeschritten ist. Durch die Wahl der Spezifität der Antikörper und Antisense-Oligonukleotide jede Variante des Nano Medikament positiv synthetisiert, wie in pe benötigtrsonalized Medizin. Die Modalitäten für die erfolgreiche Behandlung von menschlichen HER2-positiven Brustkrebs sind gültig Vertreter für die Vorbereitung der Maus Krebsmodellen, die Anwendung von Nano-Medikamente, Imaging und Analyse des Tumorwachstums. Die Ergebnisse der in-vitro-Vitalitätstests sind nützlich bei der Auswahl der Zelllinie und die führende Medikament im Tierversuch eingesetzt werden. In-vivo-Bildgebung Xenogens bestätigt, dass die Nano-Medikament ist in der Tat in den Tumor geliefert. Ergebnisse der Western-Blot zeigt, ob das Niveau von bestimmten Proteinen reagierte in der vorhergesagten Weise während der Krebsbehandlung. Die Messung der Tumorgröße informiert über den Erfolg der Behandlung, dh eine Hemmung, Rezession oder Regression. Das beschriebene Beispiel spiegelt unsere Erfahrungen mit anderen Polyäpfelsäure-basierten Nano Drogen, die einen hohen Grad an Vorhersagbarkeit, Reproduzierbarkeit und bemerkenswerte Abwesenheit von Toxizität. Neuere Ergebnisse über die Toxizität und Wirksamkeit von mehreren targeted Polyäpfelsäure Konjugate für triple-negativen Brustkrebs-Behandlung sind in starke Unterstützung dieses Begriffs 18. Ein wesentliches Merkmal ist, dass unsere nano Medikament ist in der Lage, Bio-Barrieren durchdringen: die endotheliale Barriere durch Extravasation in den Tumor interstitielle, die Tumorzelle Membran durch Endosomen Aufnahme und Endosommembran Störung durch die Wirkung der Leucin-Ethylester oder Trileucin Gruppen. Extravasation und Endosomen-Aufnahme werden zuverlässig durch die spezifischen Antikörper in den Nano-Medikament befestigt erreicht. Anti-Maus-Antikörper, Transferrin-Rezeptor vermittelt effiziente Zustrom in den Tumor transzytotisch, wahrscheinlich, weil der Rezeptor auf den meisten Tumorgefäßsystem überexprimiert. Eine andere Antikörper auf den gleichen nano Konjugatmolekül Funktionen speziell die Leitung der Nano Medikament in den Empfänger Tumorzelle angebracht. Die Anwesenheit beider Antikörper, der eine für Transzytose und die andere für Endosom Aufnahme, die für eine optimale Funktion. Quantitative Analyse von malic Säure und Antikörper wird empfohlen, um die optimale Zusammensetzung der Nanodrogenkontrolle empfohlen. Abschließend sei darauf hingewiesen, dass die all-in-one kovalente Nano Droge liefert Medikament in Form chemisch gebunden auf dem Weg über den Host-Gefäßsystem in den Empfänger Tumorzelle werden. Chemische Anbindung macht die meisten Medikamente inaktiv (Prodrugs), bis sie als freie Arzneimittel durch Spaltung aus dem nano-Konjugat-Plattform an der Zielstelle rekonstituiert werden. Dies ist wichtig, weil die Reaktivierung Modalität bietet ein hohes Maß an Sicherheit bei der Lieferung und eine minimale Chance, um schädliche Nebenwirkungen hervorzurufen. Vielseitigkeit, Wirksamkeit und Sicherheit sind unverzichtbare Attribute des guten personalisierten Medizin.

In der post-genomischen Ära, in der Genome von Krebs wurden aufgeklärt (National Center for Biotechnology und The Cancer Genome Atlas), zukünftige Behandlung von Krebs wird für die genetische Vielfalt von Tumoren oft innerhalb der gleichen Tumor 4.1 zu berücksichtigen. Bioinformatik und schnell, nicht teuer DNA-Sequenzierung ermöglicht die Erfassung von malignen Gene / Mutationen auf einer persönlichen Ebene 2,4,5. Sobald die Gene identifiziert wurden, werden die Patienten mit der personalisierten Medizin zu ändern oder zu Schweigen ihrer Expression von Genen malignen 6 behandelt werden. Die Notwendigkeit, die gezielt Krebszellen und liefern Medikamente in diese Zellen fordert polyfunktionellen Delivery-Systeme. Offensichtlich kann diese Anforderung nano Drogen 7 erfüllen. In einer wogenden Welle von Entdeckungen haben Nanopartikel geeignet, Nutzlasten von Chemotherapeutika, Proteinen und / oder genetisch aktives Material, um Krebszellen zu bringen bewährt. Bleiben jedoch negative Auswirkungen auf die Anzeige seingekleidet. Einer von ihnen auf die Abwesenheit der biologischen Abbaubarkeit Zusammenhang kann die Abscheidung von Material in gesunden Geweben und Organen verursachen, die Wahrscheinlichkeit zu Krankheiten hervorrufen. Um die Abscheidung zu minimieren, haben wir nicht toxisch und nicht immunogen Polyäpfelsäure, die mikrobiellen Ursprungs und biologisch abbaubar ist, um H 2 O und CO 2 8. Wir verwenden das Polymer, All-in-One-kovalente Art von Nanodrogen synthetisieren. Es enthält chemisch gebunden Chemotherapeutika wie Temozolomid, Doxorubicin oder Antisense-Oligonukleotide und Funktionsgruppen dienen Extravasation, Gewebe-Targeting, endosomolytischen Lieferung. Die Medikamente sind untrennbar von der Nano-Plattform gespalten, als sie ankamen in der gezielten Tumorzelle, wodurch ihre volle pharmazeutische Aktivität regenerieren. Wir beschreiben das Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Polymernano Plattform, ihre Reinigung und die chemische Synthese eines Nano Medikament, Trastuzumab (Herceptin) für Krebs enthältTargeting und ein Antisense-Oligonukleotid zur Hemmung von HER2 Über. Bei der Anwendung der Nano-Medikament zur xenogenen menschlichen Her2-positivem Brustkrebs auf Nacktmäuse zeigen wir, eine hohe Wirksamkeit der Krebsbehandlung. Die Prinzipien der Tumor Targeting-und Gen-Silencing für Polyäpfelsäure Nano Drogen hier eingeführt wird, kann in der Behandlung von anderen Krebserkrankungen eingesetzt werden.

<table><tbody><tr><td>2-Mercapto-1-ethylamin (Cysteamin; 2MEA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30078-25G</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Vector Laboratories, Burlingame, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>90-Tage-Freisetzung 17&beta;-Estradiol-Pellet&nbsp;</td><td>Innovative Forschung Amerikas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 C2 Maleimid</td><td>Invitrogen</td><td>A20344</td><td></td></tr><tr><td>Amberlite IR 120H</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6428</td><td></td></tr><tr><td>Antifoam Y-30 Emulsion</td><td>Sigam-Aldrich</td><td>A5758</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Laminin-411 Kette mAbs</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-59980</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pAkt mAb</td><td>Zellsignalisierung</td><td>9271S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PARB mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>556494</td><td></td></tr><tr><td>Anti-von-Willebrand-Faktor-Antikörper&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>AB6994</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Hefeextrakt</td><td>Bacto, Dickinson/Sparks, MD</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Aktin-Zell-Signalisierung</td><td></td><td>3700</td><td></td></tr><tr><td>BT-474&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-20</td><td></td></tr><tr><td>Calciumcarbonat</td><td>Alfa Aesar</td><td>36337</td><td></td></tr><tr><td>Zellproliferations-Assay-Kit</td><td>Promega, Madison, WI, USA</td><td>PR-G3580</td><td></td></tr><tr><td>Centriplus 100&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>4414</td><td></td></tr><tr><td>Dicyclohexylcarbodimid</td><td>Fluka</td><td>36650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Cardinal Health</td><td>S7439-4</td><td></td></tr><tr><td>Galardin (MMP-Inhibitoren)</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-994</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Zell-Signalgebung&nbsp;</td><td>2118</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxilin</td><td>Cardinal Health</td><td>S7439-3</td><td></td></tr><tr><td>Hemin aus Schweinefleisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51280</td><td></td></tr><tr><td>Herceptin</td><td>Genentech</td><td>15534</td><td></td></tr><tr><td>Herceptin (Western Blotting)</td><td>Zellsignalisierung</td><td>2165S</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a-Kappa, murines Malignom</td><td>Sigma</td><td>M77695X5m</td><td></td></tr><tr><td>Immun-Star AP Substratpaket</td><td>Biorad</td><td>170-5012</td><td></td></tr><tr><td>Immun-StarTM AP Substratpaket</td><td>Biorad</td><td>170-5012</td><td></td></tr><tr><td>LAL Reagenz Wasser&nbsp;</td><td>Lonza, MD</td><td>W50-1000</td><td></td></tr><tr><td>Laminin-411 mAbs</td><td>Abcam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leucin-Ethylester (LOEt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61850-10G-F</td><td></td></tr><tr><td>Limulus Amöbozyten-Lysat (LAL) PYROGENT-5000 testet</td><td>Cambrex BioScience</td><td>N384</td><td></td></tr><tr><td>Lissamin-Morpholino AON</td><td>Genwerkzeuge</td><td>Maßgeschneiderte</td><td></td></tr><tr><td>L-Apfelsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6413</td><td></td></tr><tr><td>Malat-Dehydrogenase&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2634</td><td></td></tr><tr><td>mal-PEG-mal</td><td>Laysan</td><td>mal-PEG-mal-3400</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354248</td><td></td></tr><tr><td>Milch, fettfrei, pulverisiert&nbsp;</td><td>Proteomik</td><td>M203-10G</td><td></td></tr><tr><td>Morpholino-Oligonukleotide&nbsp;</td><td>GeneTools</td><td>kundenspezifisches</td><td></td></tr><tr><td>mPEG5000</td><td>Lysan</td><td>mPEG-NH2-5000</td><td></td></tr><tr><td>N-Hydroxysuccinimd (NHS) &nbsp;</td><td>ACROS Organics</td><td>15727100</td><td></td></tr><tr><td>Ninhydrin</td><td>Merck</td><td>1.06762.0100</td><td></td></tr><tr><td>Nitrozellulose-Membran-Filterpapier-Sandwich</td><td>Invitrogen</td><td>LC2001</td><td></td></tr><tr><td>Nitrozellulose-Membran-Filterpapier-Sandwich, 0,45 &; Mikro; M&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>LC2001</td><td></td></tr><tr><td>Novex & reg; Tris-Glycin-Transferpuffer (25x)</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>Nacktmäuse [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm]&nbsp;</td><td>Taconic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,2 10x</td><td>Gibco</td><td>10010-49</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,2 1x</td><td>Gibco</td><td>70013</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Entsalzungssäulen</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851</td><td></td></tr><tr><td>Physarum polycephalum M3CVII</td><td>ATCC</td><td>204388</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Protease-Inhibitor-Cocktail</td><td>Roche</td><td>1.18362E+11</td><td></td></tr><tr><td>Proteindetektor-ELISA-Kit</td><td>KPL</td><td>54-62-18</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 superfein</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0031</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-75&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0050</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex-LH20&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0090</td><td></td></tr><tr><td>SKBR-3&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td></td></tr><tr><td>SPDP</td><td>Proteochem&nbsp;</td><td>C1116</td><td></td></tr><tr><td>Streamline-DEAE</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0994</td><td></td></tr><tr><td>Styrylrot FM 1-43&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>T-3163</td><td></td></tr><tr><td>TBS 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6435</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>TLC, siliziumbeschichtete Aluminiumbleche</td><td>Merck, Darmstadt, DE</td><td>60F254</td><td></td></tr><tr><td>Trileucin (LLL)</td><td>Bachem</td><td>H-3915</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-114&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X114</td><td></td></tr><tr><td>Tween&reg; 20&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20&nbsp;</td><td>VWR</td><td>14005-302</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dexmedetomidin</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atipamezol</td><td>Pfizer Carfiren</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Foster und Smith, Wisconsin</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

polyäpfelsäure-basierten nano biopolymere für targeting mehrerer tumormarker: eine chance für die personalisierte medizin?

Polymalic Acid-based Nano Biopolymers for Targeting of Multiple Tumor Markers: An Opportunity for Personalized Medicine?

Tumoren mit ähnlichem Grad und ähnlicher Morphologie sprechen aufgrund von Unterschieden in der molekularen Profilierung oft unterschiedlich auf die gleiche Behandlung an. Um dieser Vielfalt Rechnung zu tragen, wird eine personalisierte Medizin entwickelt, um malignitätsassoziierte Gene zum Schweigen zu bringen. Nanomedikamente erfüllen diese Anforderungen, indem sie auf Tumore abzielen und Antisense-Oligonukleotide zur Stilllegung von Genen liefern. Da Medikamente zur Behandlung oft wiederholt verabreicht werden, sind das Fehlen von Toxizität und eine vernachlässigbare Immunantwort wünschenswert. In dem hier vorgestellten Beispiel wird ein Nanomedikament aus der biologisch abbaubaren, ungiftigen und nicht-immunogenen Plattform Polyäpfelsäure durch kontrollierte chemische Ligation von Antisense-Oligonukleotiden und tumorgerichteten Molekülen synthetisiert. Die Synthese und Behandlung wird am Beispiel des humanen Her2-positiven Brustkrebses anhand eines experimentellen Mausmodells veranschaulicht. Der Fall kann auf die Synthese und Behandlung anderer Tumoren übertragen werden.

Die Hemmung des menschlichen HER2-positivem Brustkrebs durch Schweigen HER2-Rezeptor-Expression und Sperr HER2-Signalgebung 12 Strategie Unter den verschiedenen Formen von menschlichem Brustkrebs, HER2-positiven Tumoren haben die schlechtesten klinischen Ergebnis. Wir präsentieren die erfolgreiche Behandlung von HER2-Überexpression menschlichen Brustkrebs in der Nacktmaus-Modell. Die Strategie beinhaltet die Nano Droge sowohl in der unmittelbaren Silencing des HER2-Signalweg Einsatz Herceptin und HER2-spezifischen AON zum Blockieren des HER2-mRNA-Synthese in Abhängigkeit des Rezeptors (Abbildung 1) aktiv. Die Bleinano Konjugat, das Herceptin und Anti-HER2 AON enthält, ist in Fig. 3 zusammen mit zwei Kontrollen, die frei von entweder Herceptin oder AON gezeigt. Die Bleiverbindung enthalten anti-MsTfRmAb aktive Extravasation transzytotisch thro erreichenugh Bindung an TfR der Tumorgefäße Endothelzellen. Viel geringer Aufnahme in den Tumor wurde in Abwesenheit des Antikörpers wurde notiert und die Tumor abhängig EPR-Effekt 13 zurückzuführen. Leuchtstoffversionen der Nano Konjugate, die Alexa Fluor 680 wurden für die bildgebenden Studien synthetisiert. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50668/50668fig1highres.jpg" width="500" /> . Abbildung 1 Mechanismus der AON Lieferung in HER2-positiven Brustkrebszellen und Tumorwachstumshemmung Linke obere Ecke:. Nano-Konjugat aus 3 angepasst. Linke untere Ecke: Maus exprimieren Tumorgefäße TfR auf der Oberfläche. Die Nano Medikament an den Rezeptor bindet und in den Tumor durch Transzytose. Darüber hinaus ist ein gewisser Grad von Zugriff auf den Tumor durch die ungeordneten Schichten Endothelzellen, die in Tumor teilnehmen abhängig wodurch die Aufnahme und retenti möglichauf (EPR) 13. Weiter bindet das nanodrug HER2 exprimiert auf den menschlichen Krebszellen und in frühe Endosomen internalisiert. Binding blockiert auch HER2-Signalweg. Nach der Reifung der Endosomen und ihre Versauerung wird die Endosomen Escape-Mechanismus der Nano Medikament aktiviert. Nanodrug in das Zytoplasma von Nano Plattform durch reduktive Spaltung der Disulfid-Abstands freigesetzt und bindet an HER2-mRNA blockieren HER2-Synthese. Blockierung der Synthese erstreckt Sperrung von HER2-Signalgebung und induziert Hemmung des Tumorwachstums. Mikrobielle Produktion der Polyäpfelsäure Plattform Die Nano-Konjugat-Plattform, Polyäpfelsäure (PMLA) wurde durch kultivierte microplasmodia von Physarum polycephalum und aus der Brühe nach dem Protokoll beschrieben und in Fig. 2 dargestellt gereinigten hergestellt. Herstellung und Reinigung waren glatt und reproduzierbar. Es war wichtig, cont<html> rol Zeit, pH-Wert und Temperatur auf die spontane Spaltung des Polymers zu vermeiden. Sorgfältiges Waschen und Elution der DEAE-Säule, um die DNA, Kohlenhydrate, Toxine und farbigen Materials zu entfernen empfohlen. Extreme Reinheit wurde nach Lösen in wasserfreiem Aceton und Entfernen von unlöslichen Material erhalten. Gesamtbetrag der produzierten PMLA war 5 ± 1 g pro Kampagne. Mengen von 1,5 ± 0,5 g hochgereinigten PMPLA von M w 80.000-100.000 wurden reproduzierbar, wenn Sie die 10-l-Bioreaktor erreicht. SEC-HPLC-Elutionsprofile waren symmetrisch. Dynamische Lichtstreuungsanalyse nach Anzahlverteilung zeigte einen einzelnen Peak, der einem hydrodynamischen Durchmesser von 8 ± 1 nm und einem Polydispersitätsindex PDI = 0,10 ± 0,02, von der Gerätesoftware übernommen für kugelförmige Partikel berechnet wird. Zetapotential betrug -22 ± 2 mV (pH 7.5). / 50668/50668fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; 2. Herstellung und Reinigung von Polymaleinsäure aus kultivierten Mikro Plasmodien von Physarum polycephalum (von Lee et al. 9 angepasst). Polyäpfelsäure (PMLA) von Plasmodien Physarum polycephalum in einem Bioreaktor hergestellt und aus dem Kulturüberstand durch Bindung an Anionenaustauscher (DEAE) gesammelt. Das Elutionsmittel wird als Calciumsalz in Ethanol ausgefällt. Lösungen des Calciumsalzes sind über Sephadex-G25-Mw fraktioniert. PMLA haltigen Fraktionen werden aus dem Ca-Salz in die Säure über Amberlite IR-120H + umgewandelt. Die kostenlose PMLA schließlich gefriergetrocknet, um trockenes, weißes Pulver erhalten. Chemische Synthese des Leiternano Konjugat P / mPEG 5000 (5%) / Loet (40%) / AON (2,5%) / Herceptin (0,2%) / a<html> nti-MsTfRmAb (0,2%) Die schematischen Strukturen des Leiternano Medikament und von zwei Vorläufer nano-Konjugate sind in Abbildung 3 dargestellt. Das Blei enthält alle Bestandteile, während die Vorläufer wurden entwickelt, um entweder AON HER2 oder den Antikörper Herceptin fehlt. Neben AON und mAbs, die Verbindungen enthalten Polyethylenglykol, mPEG 5000, Bindung an Plasmaproteinen zu minimieren, Freigabe durch die retikuloendothelialen Systems (RES) und dem Abbau durch enzymatische Spaltung. Das Antisense-Sequenz 5&#39;-CAT-GGT-GCT-CAC-TGC-GGC-TCC-GGC-3 &#39;war komplementär zu mRNA Her2 und wurde sorgfältig in vitro auf mehreren HER2-exprimierenden Zelllinien getestet, um eine hohe Spezifität zu blockieren HER2 erhalten Synthese und nicht zeigen, Off-Target-Effekte. 8/50668fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Abbildung 3. Nano-Konjugate für die menschliche Behandlung von HER2-positivem Brustkrebs zu behandeln. Führende Drogen nano (oben Struktur) enthält zwei Medikamente (Herceptin, AON HER2). Versionen 2 und 3 enthalten nur eines der Medikamente. Aufnahme von 1 und 2 in menschlichen HER2-überexprimierende Tumorzellen wird durch die Bindung von Herceptin verwaltet. Nano-Konjugat 3, die nicht Herceptin enthält, erhalten Anti-HuTfRmAb für Endosomen Aufnahme durch die menschlichen Zellen. Die Konjugation mit Alexa Fluor 680 war optional zur Bildgebung. Der rote Balken stellt die Nano Konjugat-Plattform-PMLA / Loet (40%). % Gibt den Anteil der Äpfelsäurereste an der Bindung der angegebenen Liganden (Gesamtmenge der Äpfelsäurereste in der nanodrug = 100%) verzehrt. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50668/50668fig4highres.jpg" width="500" /> 4. Chemische Synthese von NanoKonjugate P / Loet / AON HER2 / anti-MsTfR/Herceptin Von oben nach unten: Synthese von PMLA-N-Hydroxy succinimidylester (PMLA-NHS) der Anhänger Carboxylate (chemische Aktivierung).. Ersatz von NHS durch Amidbildung mit 2-Mercapto-1-Aminoethan (2-MEA), Methyl-PEG 5000-Amin (mPEG 5000-NH 2), Trileucin (LLL) oder Leucin ethylester (Loet). Diese &quot;preconjugate&quot; legt mAb-Mal-PEG-Mal durch Thioether Bildung und AON durch Bildung von Disulfidbrücken spaltbar. Leftover 2-MEA wird verschlossen Bildung amidoethyl-Dithio-Propionsäure. Nur Anbringung eines einzigen mAb gezeigt. Mehrere Anhänge werden durch Verwendung von Mischungen von mAb verwaltet. Prozentual% bedeutet Fraktionen von Carboxylaten zu verschiedenen Liganden (100% kostenlos PMLA) gebunden. Die Nano-Konjugate wurden synthetisiert, wie in Abbildung 4 dargestellt. Das berechnete Molekulargewicht des LeitungsKonjugat war 719.000. Die Gesamtausbeute der Synthese betrug 45 ± 5% bezüglich der Äpfelsäure-Gehalt. Im Durchschnitt der 862 Malyl Einheiten (= 100%) der 100 kDa PMLA Plattform ausgeführt Loet 40%, 5% mPEG, 2% AON 2%, 0,2% und 0,2% Herceptin Anti MsTfR mAb. Die Menge für jeden Antikörper entsprach durchschnittlich 1,7 Moleküle pro Molekül des PMLA Plattform. Die% ausgelegt und die% von Gruppe-Analyse verifiziert waren die gleichen, innerhalb von ± 5%. Ein Beispiel ist die in Tabelle 1 für die Berechnung der experimentellen Gehalt an Äpfelsäure, AON-mAb und MPEG 5000 und in Tabelle 2 zeigt den Vergleich mit dem Inhalt von Auslegungsfall. Die hohe Reinheit nach den Kriterien in Abschnitt 3 wurde auf der Grundlage der hohen Reaktionsausbeuten und effiziente Trennung durch Größenausschluss (z. B. freie mAb und mAb-nanoconjugate werden von 1 min auf s-HPLC) und selektive Löslichkeit in Lösungsmitteln gelöst. Die Aktivität der monoklonalen Antikörper war<html> gezeigt, während Nanowirkstoffsynthese zurückgehalten werden, und es wurde bestätigt, dass die beiden Arten von Antikörpern sind auf dem gleichen Polymerplattform montiert. Das Ergebnis der atypischen ELISA-Experiment ist in Abbildung 5 dargestellt. Im Allgemeinen waren die Assays für die quantitative Analyse Gruppe Äpfelsäure, AON, Protein und PEG für ELISA robust, wodurch reproduzierbare Ergebnisse, wenn sie von unterschiedlichem Personal und Instrumente nicht nur im Fall der beschriebene Synthese durchgeführt wird, sondern auch, wenn für die Analyse verwendet andere Nanokonjugate synthetisiert. <img alt="Tabelle 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50668/50668table1.jpg" width="600" /> Tabelle 1. Berechnung der nanodrug Zusammensetzung mit Bezug zu Apfelsäuregehalt. 668table2.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Tabelle 2. Vergleich von experimentellen Nano-Wirkstoffzusammensetzung mit entworfen Zusammensetzung. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50668/50668fig5highres.jpg" width="500" /> Figur 5 ELISA. Zur Messung der Antikörperaffinität nach der chemischen Synthese, und zur Demonstration der Bindung von mehreren verschiedenen Antikörpern. Die Nano Medikament enthält Antikörper mAb (A) und dem Antikörper mAb (B) gegen die Antigene A und B sind. ELISA-Platten mit Antigen (A) beschichtet. Kostenlose mAb (A), freie mAb (B), und Nanodrogen werden ELISA-Platten aufgebracht. Nach dem Waschen werden die sekundären Antikörper mit Peroxidase-gekoppelten mAb spezifisch für entweder (A) oder mAb (B)-Antikörper getestet, und nur mAb (A) wird an das Antigen (A) gebunden. Es ist ersichtlich, dass der freie und Nano Arzneimittel konjugiert mit mAb (A) und indirekt konjugierten mAb (B) der gleichen nano Wirkstoffmolekül, aber nicht frei mAb (B), Auf der Platte gehalten. Die Konzentrationsabhängigkeit zeigt vergleichbare Bindungsaffinitäten für freie und konjugierte mAb (A), was darauf hinweist, dass die chemische Konjugation hatte keinen Einfluss auf Antikörper-Bindungsaktivität. Auch die Co-Ligation von mAb (B) mit mAb (A) auf der gleichen physischen Einheit (Nano-Plattform) zu Antikörper mAb (B) Detektion. Die hier gezeigten Versuchsergebnisse beziehen sich auf Anti-Human TfRmAb (A) und anti-Maus-TfRmAb (B). Ähnliche Ergebnisse wurden für andere Antikörper-Paare getestet, wie Anti MsTfR mAb und Anti-HER2-mAb (Herceptin) gezeigt. Die physikalisch-chemischen Untersuchung zeigte hydrodynamischen Durchmesser von 22,1 ± 2,3 nm für P / mPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / Herceptin (0,2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) (Blei, das Zwei Arzneimittel-Version), 20,1 ± 2,4 nm für P / mPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) / anti-HuTfRmAb (0,2%) (der AON Medikament Version) , und 15,1 ± 1,2 nm für P / mPEG (5%) / Loet (40%) / Herceptin (0,2%) (die Droge Herceptin Version). Zeta-Potential bei pH 70,5 waren in dieser Reihenfolge -5,2 ± 0,4 mV, -5,7 ± 0,6 mV und -4,1 ± 0,4 mV. Es sollte erwähnt werden, dass der gemessene hydrodynamischen Durchmesser von Nano-Konjugate nicht folgen Additivität der Durchmesser für freie Komponenten gemessen. Lieferung von Nano-Arzneimittel durch die Tumor Zellmembran und Freisetzung in das Zytoplasma nach 0 h und 3 h r Die Lieferung von Nano Arzneimittels durch die Zellmembran durch Endosom Aufnahme ist in Abbildung 6 gezeigt, nach 0 Stunden und 3 Stunden. Fluoreszenz-Etiketten werden in den Nano-Wirkstoffplattform (Alexa Fluor 680, grün) und AON (Lissamin, rot) angebracht. Deren Überlagerung in Platten D und L zusammen mit der Fluoreszenz des markierten Endosomen (blau) in Platten G &amp; O. gezeigten Pearson-Korrelationskoeffizienten (R (r) wurden von den Bildern über die Co-Lokalisierung der Plattform / Endosomen, AON / Endosomen-Plattform / AON für 0 h und 3 Stunden. T berechneter 3 Stunden angegeben Bildmitteilung von Endosomen in das Zytoplasma und Dissoziation von AON von der Nano-Medikament von Glutathion-abhängigen Disulfid-Spaltung im Zytoplasma. <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50668/50668fig6highres.jpg" width="500" /> Abbildung 6. Konfokale Mikroskopie für Nano-Konjugat-Aufnahme durch die Zielzellen (von Ding et al. 11 angepasst). Zellen wurden 30 min bei 37 ° C mit Nano Medikament, wurde doppelt mit Alexa Fluor 680 (grün) in der Polymerplattform und mit Lissamine (rot) markiert AON angebracht war, inkubiert. Darüber hinaus wurden Endosomen mit FM1-43 (blau) gefärbt. Der Ort ist nach 0 h (A) und 3 h (B) Inkubation gezeigt. Felder A, ab, &amp; B, ij Show Färbung durch die Nano-Konjugat Fluorophore allein, undihre Co-Lokalisation in A, cd &amp; B, kl. Zusätzlich wird Färbung von Endosomen in den Feldern A, E &amp; B, m und die Co-Lokalisation von Nano-Konjugat und endosomesin Platten A, gezeigt fg &amp; B, nein. Panels A, h &amp; B, S. Show Phasenkontrast für die jeweiligen Panels. (C) Pearson-Korrelationskoeffizienten R (r) für die Co-Lokalisation von Plattform-Endosomen, AON-Endosomen, Plattform-AON für 0 h und 3 h berechnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50668/50668fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Hemmung der humanen Brustkrebs in vitro und in vivo In-vitro-Wachstumshemmung von HER2-Überexpression Zelllinie BT-474 in comVergleich mit niedrig exprimierenden Zelllinie MDA-MB-231 ist in Abbildung 7 dargestellt. Grad der Hemmung 50% und 30%, bzw. von der Leitung Nano Konjugat P / MPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / Anti MsTfRmAb. Inhibition von anderen Verbindungen weniger, aber höher für BT-474 als für MDA-MB-231-Zellen. BT-474-Zelllinie wurde für die Behandlung von Brustkrebs xenogenen Maus gewählt. <img alt="Fig. 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50668/50668fig7highres.jpg" width="500" /> Figur 7. In vitro Wachstumshemmung von HER2-überexprimierenden BT-474-Brustkrebszellen und niedrig exprimierenden MDA-MB-231-Zellen. Vergleich der Wachstumshemmung für HER2 überexprimieren, BT-474-Brustkrebszelllinie (von Inoue et al. 12 angepasst) ( links) und von HER2 exprimieren niedrige Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 (rechts). TfR (n) bezeichnet Anti-MsTfRmAb und TfR (Hu / Frau) bezeichnet Anti-HuTfRmAb &amp; Anti-MsTfRmAb. Das Blei nano Droge, P / MPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / TfR (Ms) und nano frei von Drogen entweder Herceptin oder AON HER2 werden mit PBS, Herceptin und AON HER2 verglichen. In Abwesenheit von Herceptin, Anti MsTfRmAb wurde konjugiert an Endosom Aufnahme durch die Tumorzellen bereitzustellen. Konzentrationen waren 40 ug / ml im Hinblick auf Antikörper, 4 &amp;mgr; M im Hinblick auf die AON HER2, 4 uM endoporter (Anwendung von AON). Bedeutung von * bezeichnet, P &lt;0,05: ** p &lt;0,02: *** p &lt;0,003 im Vergleich mit PBS. Die Ergebnisse der in vivo-Behandlung in 8 Mäusen, die für BT-474 Her2-überexprimierenden humanen Brustkrebs dargestellt. Das Wachstum wurde durch die Führung nanodrug enthält Herceptin und HER2-spezifischen AON im Vergleich zu Kontrollen nur mit PBS (Abb. Abbildung 8) behandelt gehemmt&gt; 95%. Hemmung60% oder weniger mit Herceptin allein, P / MPEG / Loet / Herceptin oder P / MPEG / Loet / AON / anti-MsTfRmAb / anti-HuTfRmAb. Western-Blot-Analyse von Tumorextrakten zeigte Hemmung sowohl HER2-Synthese und Akt Phosphorylierung, aber keine Änderung der Gesamt Akt und Hauswirtschaft Enzym GAPDH. PARP wurde in Übereinstimmung mit einem erhöhten Niveau der Apoptose gespalten. Bilder von Tumor nach der Behandlung und Gewebeschnitte mit H &amp; E-gefärbten Tumorregression Veranschaulichung sind in Abb. Abbildung 9 dargestellt. <img alt="Fig. 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50668/50668fig8highres.jpg" width="500" /> Figur 8. Tumorgröße und Proteine ​​während der Behandlung mit Blei-und Vorläufernano Drogen (von Inoue et al. 12 angepasst). A. Tumorgröße für die verschiedenen Behandlungen (Tag 21 bis Tag 42, insgesamt 8 Injektionen). Die Balken zeigen StandardAbweichungen vom Mittelwert. Das Blei mit Anti-Her2 AON und Herceptin konjugiert überlegen war, entweder allein oder Herceptin einziges Medikament mit Nano-Konjugate. B. Wirkung der verschiedenen Behandlungen auf die Expression von HER2, phosphoryliert Akt, Gesamt Akt, PARB, gespalten PARB und GAPDH durch Western-Blot gezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50668/50668fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50668/50668fig9highres.jpg" width="500" /> Abbildung 9. Behandlung von HER2-positivem BT-474 menschlichen Brustkrebs auf Nacktmäusen. Tumorrückbildung und Nekrose / Apoptose in Gewebeschnitten (von Ionue et al. 12 angepasst). Obermaterial: Schrumpfung des Tumors (rote Pfeile). Anzeige der Östrogen-Pellet, das Tumorwachstum (blauer Pfeil) unterstützen. Lower: Hämatoxilin &amp; Eosin (H &amp; E)-Färbung von Tumorschnitte. Proliferierende Tumor wird durch die dichte Packung von Tumorzellen gezeigt. Nekrotischen Gewebes ist zu sehen, wo Tumorzellen eliminiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50668/50668fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Ein Beispiel für ein Medikament, das auf Nano Polymaleinsäure ist auf das rationale Design personalisierte Medizin, die für Krebs ist dargestellt. Es beschreibt die Synthese von Nano Medikament Her2-positiven menschlichen Brustkrebs in einer Nacktmaus zu behandeln.

Polyäpfelsäure-basierten Nano Biopolymere für Targeting mehrerer Tumormarker: Eine Chance für die personalisierte Medizin?

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this ...

Das übergeordnete Ziel besteht darin, eine nanoskalige Plattform zu etablieren, die eine universelle Methode zur Synthese individualisierter Medikamente auf der Grundlage des genetischen Profils der Erkrankung einer Person ermöglicht, insbesondere bei Krebs. Zunächst wird Poly-malicsäure aus dem Mikroorganismus *Physarum polycephalum* hergestellt und gereinigt, gefolgt von einer chemischen Aktivierung der gereinigten PMLA an ihren Seitenketten. Carboxygruppen werden aktiviert, um durch Substitution kleine funktionelle Gruppen und den Linker MEA anzukoppeln; anschließend werden die nicht verwendeten aktiven Gruppen durch Hydrolyse wieder in Carboxygruppen zurückverwandelt.Fügen Sie anschließend die Antikörper und Antisense-Moleküle über die Sulfhydrylgruppen des Spacers, MEA und Cap hinzu. Der ungenutzte Spacer wird durch Reaktion mit PDP nach Abschluss des Tests auf Zusammensetzung und Funktion der Leitstruktur überprüft. Nanomedikamente ergeben sich aus einem Tiermodell wie Mäusen, die aggressives menschliches Gewebe tragen.HER2-positive Brustkrebs kann die Wirksamkeit der Behandlung bestimmen und auch, ob die Behandlung ohne unerwünschte Nebenwirkungen erfolgt. Der Hauptvorteil der Bioproduktion gegenüber bestehenden synthetischen Methoden wie der Zopf-Polymerisation besteht darin, dass das Biopolymer volle optische Reinheit behält und nicht mit Nebenprodukten verunreinigt ist. Diese Familie von PolyPhen-Nanoarzneimitteln kann beliebige Zelltypen basierend auf spezifischer Zielgerichtetheit ansprechen und die Proteinausprägung regulieren.Im Allgemeinen ist die Krebsbehandlung mittels PHE-Nanoarzneimitteln bei mehreren Tiermodellen sehr effizient, insbesondere bei primären Gehirn- und Brustkrebserkrankungen. Unsere ursprüngliche Idee bestand darin, diese Methode zur Hemmung der Synthese glioblastom-spezifischer Lamine in Isoformen zu nutzen, und später konnten wir nachweisen, dass gezielt die HER2-Proteine sowie Proteine des triple-negativen Brustkrebses inhibiert werden können, um das Tumorwachstum zu verhindern. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur Krebsdiagnose mittels optischer und magnetresonanzbasierter Bildgebung.Poly-Nano-Arzneimittel können Erkenntnisse zur Arzneimittelabgabe bei der Krebsbehandlung liefern. Sie können auch bei anderen pathologischen Zuständen wie Infektionskrankheiten, Schmerzlinderung und neurologischen Erkrankungen angewendet werden. Nach dem Anzüchten einer Impfkultur des Plasmodiums von Spial auf Auger werden 100 Milliliter Basalkulturmedium beimpft und die Kultur bei 25 Grad Celsius kultiviert.Der Thermos-Inkubator erzeugt eine bestimmte Menge an gravitativ gepacktem Mikroplasma-Modium unter Lichtausschluss. Um eine Sporulation in einem 10-Liter-Bioreaktorbehälter zu vermeiden, lösen Sie 80 Gramm Calciumcarbonat in acht Litern Basalmedium auf, überführen Sie anschließend das gepackte Mikroplasma-Modium in den montierten Reaktionsbehälter und führen Sie den Bioprozess für 75 Stunden bei 25 Grad Celsius mit einem Luftstrom von 10 Litern pro Minute und einer Rührgeschwindigkeit von 150 U/min mittels Segmentrührer durch.Wenn die Kulturbrühe einen pH-Wert von 4,8 aufweist, stoppen Sie die Kultur, um die Produktion von Poly-Maleinsäure zu messen. Kühlen Sie die Brühe nun auf 17 Grad Celsius ab, lassen Sie die Zellen durch Schwerkraft sedimentieren und entfernen Sie das Kulturüberstand aus dem Reaktor. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,5 ein.Pumpen Sie nun das Supernatant von der Unterseite durch eine 1,5-Liter-DEAE-Zellulose-Säule, die mit 20 Millimolar Tris-Hydrochlorid, pH 7,5, bei fünf Grad Celsius equilibriert wurde. Danach lassen Sie drei Säulenvolumina Waschpuffer mit 0,3 Molar Natriumchlorid von der Unterseite zur Oberseite der Säule laufen und eluieren die PMLA in Gegenwart von 0,7 Molar Natriumchlorid. Stellen Sie die eluierte PMLA-Fraktion auf 0,1 Molar Calciumchlorid ein und geben Sie 80 % eiskalten Ethanol hinzu, um das PMLA-Calcium zu fällen. Führen Sie anschließend eine Größenausschlussfraktionierung des PMLA-Calciums mit Cidex G 25 und Wasser durch.Schließlich wird jede Fraktion über eine Amber-Licht-Säule geleitet und der Durchfluss sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren, anschließend lyophilisiert und bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Zur Aktivierung der Carboxylgruppen von PMLA werden ein Millimol Mala-Einheiten von P-M-L-A-H in einem Milliliter wasserfreiem Aceton und jeweils ein Millimol Hydroxy-CIN-Aid und Cylo-Heyl-Carboid in zwei Millilitern Dimethylformamid gemischt. Nach dreistündiger Rührung bei 20 Grad Celsius werden 0,05 Millimol Methyl-Pega-Min in einem Milliliter DMF sowie 0,05 Millimol Triethylamin zugegeben.Danach 0,4 Millimol Leucinethylester tropfenweise zugeben und nach einer Stunde das Reaktionsende durch eine negative Hyn-Reaktion in der Dünnschichtchromatographie überprüfen. Ebenso 0,1 Millimol 2-Mercapto-1-ethylamin und 0,5 Millimol TEA zugeben. Den überschüssigen NHS-Ester durch spontane Hydrolyse mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung entfernen.Desalzierung über eine PD-10-Säule durchführen und lyophilisieren, um ein weißes Pulver zu erhalten; diesen Prä-Konjugat trocken bei minus 20 Grad Celsius lagern. Als Nächstes 30 Milligramm Antikörper in 4,5 Milliliter 150 Millimolar Natriumchlorid in 100 Millimolar Natriumphosphat, pH 5,5, zugeben. Die Disulfidbindungen mit fünf Millimolar Tris, zwei Carboxyethylphosphin-Hydrochlorid reduzieren und über eine PD-10-Säule reinigen.Lösen Sie nun das IDE PEG IDE in zwei Millilitern des oben genannten Puffers, jedoch bei pH 6,3, auf. Geben Sie den reduzierten Antikörper hinzu und rühren Sie eine Stunde lang bei 20 Grad Celsius. Konzentrieren Sie die Lösung auf 2,5 Milliliter über AVEVA spin 20 mit 30 Kilodalton Ausschluss und reinigen Sie anschließend über cidex G 75.Überprüfen Sie nun das Produkt mittels SEC-HPLC. Messen Sie die Menge bei 280 Nanometern und bestätigen Sie zusätzlich das Fehlen von Verunreinigungen bei anderen Wellenlängen. Als Nächstes mischen Sie 50 Milligramm des Prä-Konjugats mit 200 MLEs des Antikörper-PEG-IDE-Konjugats in fünf Millilitern Puffer mit pH 6,3.Stellen Sie die Konzentration von Sulfhydrol auf zwei Millimolar ein und inkubieren Sie bei 20 Grad Celsius für drei Stunden. Um eine 98 % Ausbeute an löslichem Produkt zu erhalten, lassen Sie das drei-Ende-amin-modifizierte Antisense-Oligonukleotid mit einem Volumen SPDP reagieren, reinigen das A-O-N-P-D-P über Sephadex LH-20 in Methanol, verdampfen anschließend das Methanol, lösen das Produkt in Wasser auf und lyophilisieren es. Inkubieren Sie danach 800 Nanomol des aktivierten AOS mit dem Antikörper-PEG-Vorkonjugat zu MEA-SH über Nacht. Sobald die Disulfid-Austauschreaktion beendet ist, koppeln Sie den fluoreszierenden Farbstoffblock an, blockieren die überschüssigen Sulfhydrolgruppen mit PDP und reinigen über Sephadex G-75.Lagern Sie das endgültige auf Poly-Milchsäure basierende Nanomedikament bei minus 20 Grad Celsius. Um den Gehalt an Poly-Milchsäure während der Herstellung zu bestimmen, verfahren Sie wie folgt: Geben Sie zu 320 Mikrolitern Probe 160 Mikroliter 10%iger Hydroxylammoniumchloridlösung und 160 Mikroliter 10%iger Natriumhydroxidlösung hinzu. Nach 10 bis 15 Minuten versetzen Sie die Mischung mit 160 Mikrolitern 5%iger Eisen(III)-chloridlösung und beobachten die Bildung einer dunkelvioletten Färbung bei 540 Nanometern. Anschließend hydrolysieren Sie das Nanomedikament über Nacht in zwei molarer Salzsäure bei 110 Grad Celsius unter Verwendung einer versiegelten Ampullenprobe und weisen Maleinsäure mittels umgekehrter Phasenchromatographie nach.Unter Verwendung von Proben, die mit Standardsäure Maleinsäure versetzt wurden. Spalten Sie nun das Nanomedikament mit 100 Millimolar Dihi-Drei-Etol und messen Sie die morph-Antisense-Oligonukleotide mittels quantitativer umgekehrter Phasen-HPLC gegen morpho-ein-ON-Standards. Bestimmen Sie unter Verwendung des gespaltenen Nanomedikaments den Antikörpereinsatz mit einem Protein-Assay-Kit, um den Malik-PEG-Gehalt zu quantifizieren.Zunächst mit Ammoniumthiocyanat umsetzen, anschließend mit Chloroform extrahieren und die Extinktion bei 510 Nanometern messen. Testen Sie die Antikörperaktivität und Co-Ligation mittels ELISA unter Verwendung von fünf Mikrolitern Nanodroge pro Mulde und 0,5 Mikrogramm pro Mulde von HER2 als plattengebundenem Antigen. Berechnen Sie schließlich den erreichten Prozentsatz für Antisense-Oligonukleotid, EG und Antikörper in Bezug auf Maleinsäure.Vergleichen Sie dies mit dem durch das Arzneimitteldesign angestrebten Prozentsatz. Dieser bimodale strategische Ansatz beim Nanomedikament verwendet Herceptin, um den HER2-Signalweg und HER2-spezifische Antisense-Oligonukleotide (aON) zur Blockade der Transkription des HER2-Rezeptors zu hemmen; Antikörper ermöglichen die Transzytose über den endothelialen TFR der Tumorgefäße. Die nanostrukturierte Konjugatplattform aus Poly(maleinsäure) wurde durch kultivierte Mikroplasmodien erzeugt und durch Aktivierung der carboxylieren Gruppen des PMLA gereinigt, wodurch die Synthese des Prä-Konjugatgerüsts erleichtert wurde.Und schließlich der Blei-Nano-Konjugat. ELISA-Analysen zeigten den Erhalt aktiver monoklonaler Antikörper während der gesamten Nano-Wirkstoff-Synthese. Mit beiden Antikörpern, die auf der gleichen Polymerplattform angeordnet waren, wurde die zelluläre Aufnahme des Nano-Wirkstoffs mittels fluoreszenzkonfokaler Mikroskopie verfolgt.Die überlagerten Bilder von null und drei Stunden wurden gemeinsam mit den markierten Endosomen analysiert. Die Pearsonschen Korrelationskoeffizienten für die Kolokalisation deuten auf eine Freisetzung des Nanomedikaments aus den Endosomen in das Zytoplasma sowie auf eine Abspaltung einer ON vom Nanomedikament durch eine glutathionabhängige Disulfidspaltung im Zytoplasma hin. In vitro hemmte das führende Nanomedikament das Wachstum am wirksamsten in der HER2-überexprimierenden Zelllinie.In vivo-Experimente an Mäusen mit BT 4 74, HER zwei überexprimierendem menschlichem Brustkrebs, zeigten eine Wachstumshemmung von mehr als 95 % durch das führende Nanomedikament, das Herceptin enthält. Und HER zwei-spezifische A ON-Untersuchungen mittels Western Blot ex vivo wiesen auf eine Hemmung sowohl der HER zwei-Synthese als auch der Phosphorylierung von a KT und einer Spaltung von PARP hin, was auf Apoptose schließen lässt. Die Tumorremission als Reaktion auf die Medikamentenbehandlung zeigt sich in der Tumorschrumpe und der Verringerung der Tumorzellen bei histologischer Untersuchung.Sie sollten nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine biokompatible Nano-Plattform nutzt, um eine wirksame personalisierte Therapie ohne Nebenwirkungen zu erreichen und ein Nano-Arzneimittel mit kontrollierter Zusammensetzung und nachgewiesenen funktionellen Aktivitäten herzustellen. Sobald diese Methode beherrscht ist, können diese Sensoren nach der Entwicklung mit hoher Reproduzierbarkeit durchgeführt werden. Diese Technik, die eine poly saure Nano-Plattform für die gezielte Abgabe von Antisense-Oligonukleotiden verwendet, ebnet Forschern auf dem Gebiet der personalisierten Nano-Medizin den Weg, Tumortherapien zu erforschen, die auf spezifische molekulare Tumormarker abzielen, die durch personalisierte genetische Analysen identifiziert wurden. Pharmakologisch können Wirkstoffe und Zellen äußerst gefährlich sein.Es sollten stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen einer Maske und von Handschuhen beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

polymalic-acid-based-nano-biopolymers-for-targeting-multiple-tumor

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

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