Name: Ein Mikroplatten Assay Chemical Auswirkungen auf die RBL-2H3 Mastzelldegranulation bewerten: Effekte von Triclosan ohne Verwendung eines organischen Lösungsmittels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-01T19:45:00.000+00:00
Duration: 17 min 35 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie chemische Effekte auf die Mastzelldegranulation mit einem fluoreszenzbasierten Mikroplatten-Assay bewerten. Diese Methode zeigt die hemmenden Wirkungen von Triclosan auf RBL-2H3-Zellen ohne organisches Lösungsmittel.

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LMW und RHK werden von der Graduate School of Biomedical UMaine Science and Engineering (GSBSE) unterstützt; RHK wurde auch von der Maine Agricultural Experiment Station &amp; Wälder unterstützt. Zusätzliche Mittel wurde von der National Institute of General Medical Sciences (NIH P20-GM103423), die Maine Agricultural Experiment Station &amp; Wald (Grant Number ME08004-10, JAG), der University of Maine ADVANCE Rising Tide-Center (NSF Grant # 1008498) zur Verfügung gestellt und ein Forschungs-Starter Grant Pharmakologie / Toxikologie vom PhRMA Stiftung (JAG). Wir danken Drs.. David Holowka und Barbara Baird für das Antigen und Zellen. Wir sind dankbar, dass Hina Hashmi, Alejandro Velez und Andrew Abovian für die Hilfe bei Ausrüstung und Aufträge. Dies ist Maine Agricultural Experiment Station &amp; Wälder Veröffentlichung Nummer 3311.

Im Jahr 2004 entwickelte Naal et al. 1 ein Mastzellen Biosensor für das Hochdurchsatz-Tests Degranulation. Es ist ein robustes Assay, dass wir für unsere TCS Studien angepasst und detailliert in diesem Video. Vor der Naal et al. 1-Test, hatte Mastzelldegranulation routinemäßig über β-Hexosaminidase 59-61 beurteilen, aber diese frühen Verfahren verwendet Fluorometern in denen eine Probe zu einer Zeit gelesen wurde. Wichtig ist, Naal et al. gegründet direkte Übereinstimmung zwischen ...

Mastzellen sind sehr Immuneffektorzellen, die als Schlüssel dienen Mediatoren bei Asthma, Allergien, Parasiten Verteidigung und Krebsentstehung 13-16 granuliert. Sie in fast jedem vaskularisierten Gewebe 15 wohnen, wo sie sicher speichern allergischen und entzündlichen Mediatoren in zytoplasmatischen Granula bis aktiviert degranulieren. Degranulation der Exozytose von Membran-gebundenen Granulaten, was zur Freisetzung pharmakologisch aktiver Mediatoren, wie Histamin, Tryptase, Leukotriene und 15 ergibt. Dieses Verfahren führt bei der Initiierung von Typ I Überempfindlichkeitsreaktionen, die entscheidend bei der Montage Verteidigung gegen Parasiten sowie Initiierung Allergiker, Asthmatiker und krebserregend sind 15 Antworten. Mastzellen und Basophilen auszudrücken Fc &amp;egr; RI-Rezeptoren, die mit hoher Affinität Rezeptoren für Immunglobulin E (IgE) 17. Die Exposition gegenüber einem Allergen oder Antigen verursacht Aggregation mehrerer IgE-Rezeptoren gebundenen Fc &amp;egr; RI 17, und es ist diese so genannte &quot;Vernetzung&quot; von IgE-gebundenen Fc-Rezeptoren, die die Degranulation einleitet: eine Kaskade von Tyrosinphosphorylierung Ereignisse, die Aktivierung von Phospholipase C, Austausch von Calcium aus internen Speichern und Einstrom von Calcium in die Zelle 18. Das Calcium-Einstrom ist für Degranulation, und ferner Signale Granulat Fusion mit der Membran vor verursacht Granulat Exozytose 15. Experimentell kann ein Calcium-Ionophor zur Haltestelle Calcium direkt über die Zellmembran 19, die im wesentlichen umgeht alle Signaltransduktion Schritte vor der Calcium-Einstrom Schritt 20 verwendet werden, die die Identifizierung eines Weges vorbei durch einen Giftstoff als vor oder hinter Calcium-Signalgebung 20. Degranulation können schnell und effektiv durch die Überwachung der Freisetzung von β-Hexosaminidase in Zellüberstand, die linear aus dem Granulat neben Histamin freigesetzt 6 gemessen werden, aber ichs viel leichter zu detektieren unter Verwendung eines einfachen Enzym-Substrat-Reaktion und eines Mikroplatten-Lesegeräts zum Testen des fluoreszierenden Produkts. Diese Mikroplattenassay, wie im Protokoll Abschnitt beschrieben, ist auf einem robusten Verfahren ursprünglich von Naal et al. 1, die die Spaltung des fluorogenen Substrates 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid quantifiziert durch β-Basis Hexosaminidase. Wir haben den Test zu Test Wirkungen von Arzneimitteln und Giftstoffen Änderungsdatum, mit Triclosan hier hervorgehoben. Diese Methode zuverlässig quantifiziert Degranulation, ist eine kostengünstige Alternative zu z. B. Durchflusszytometrie basierende Nachweisverfahren 21 und hat das Potenzial, sich gut eignen, um High-Throughput-Screening von einer Vielzahl von Anti-Allergie-Medikamente sowie immunotoxische oder allergene Chemikalien. Dieser letzte Punkt ist besonders wichtig im Hinblick auf die 2007 National Research Council Bericht &quot;Toxicity Testing in das 21. Jahrhundert: Eine Vision und eine Stratgie &quot;( <a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970</a> ), die für die Entwicklung von High-Throughput-toxikologischen Tests, die Zellkultur zu nutzen, um den kostspieligen Einsatz von traditionellen Labortieren wie Mäusen reduzieren befürwortet. Die Degranulation Protokoll Naal et al. 1 entwickelt und modifiziert von uns 2, nutzt die RBL-2H3-Zelllinie, die ein gut akzeptiertes Modell homolog zu menschlichen Schleimhaut Mastzellen oder Basophilen 3-5 ist. (Methoden zur Kultivierung von RBL-2H3-Zellen werden in Hutchinson et al beschrieben. 22). Dieser Test könnte wahrscheinlich auf einem angeschlossenen Mastzellen Typ angepasst werden. Triclosan (TCS) ist ein Breitspektrum-Antibiotika, die für mehr als 30 Jahren in Krankenhäusern, Körperpflegeprodukte und Konsumgüter 23,24 verwendet. Die Wirkungsweise für die antimikrobielle Eigenschaft TCS ist die Hemmung der Fettsäure-Biosynthese, wahrscheinlich durch Hemmung der Enoyl-AcylCarrier-Protein-Reduktase 25,26. Es wird weltweit in einer breiten Palette von Konsumgütern wie Duschgel, Handcreme, Zahnpasta, Mundwasser, und in der Hand Seifen in Konzentrationen bis zu 0,3% oder 10 mM 24. Der flächendeckende Einsatz von TCS hat in nachweisbaren Mengen beim Menschen 27-29 und in Flüssen und Bächen 30 geführt. Eine Studie von Allmyr et al. Gezeigt, dass 27 TCS und seinen Metaboliten, die sowohl im Plasma und Milch von stillenden Müttern sind. Wichtig ist, dass TCS leicht in die Haut absorbiert 31-37. Queckenberg et al. Gefunden 37 ~ 10% Absorption eines ~ 70 mM TCS-Creme in die menschliche Haut innerhalb von 12 Stunden, was zu erheblichen Konzentration in der Haut, wo Mastzellen befinden. TCS wurde klinisch für die menschliche allergische Hautkrankheit 7-11 verwalten gezeigt, aber der Mechanismus, durch den TCS lindert allergische Hauterkrankungen ist unbekannt 38. Mit dem fluoreszierenden Mikroplattenassay detailed in diesem Video haben wir vor kurzem gezeigt, dass TCS in Konzentrationen so niedrig wie 2 um, deutlich dämpft Mastzellfunktion und Degranulation und bietet eine mögliche Erklärung für diesen klinischen Daten 2. Neben der Bereitstellung eine Erklärung für diesen klinischen Daten, unsere Erkenntnisse in Palmer et al. 2 legen nahe, dass TCS Signalmoleküle stromabwärts von Calcium-Einstrom zielt. Aufgrund der Bedeutung von Calcium-Signalisierung in vielen immunologischen und andere biologische Prozesse könnten TCS potentiell nachteilige Auswirkungen auf eine Vielzahl von biologischen Prozessen erforderlich. In der Tat zeigte Udoji et al., Dass 39 TCS menschliche natürliche Killerzellen lytische Aktivität unterdrückt, ein weiterer wichtiger angeborenen Immunfunktion. Jenseits sein Potenzial als therapeutische Hilfe bei allergischen Hauterkrankungen (oder umgekehrt, als immunotoxicant) kann TCS auch eine endokrine Disruptoren 40-49 sein. So ein klares Verfahren, wie diese Chemikalie in Lösung herzustellen is von Interesse Toxikologen. Da TCS ist ein kleines hydrophobes Molekül werden organische Fahrzeugen häufig verwendet, um es in Wasser löslich. In den meisten Toxizitätsstudien, wo TCS getestet wurde, wurde Herstellung Auflösung in Wasser mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels, wie Ethanol, Aceton oder Öl 2,50,51 beteiligt. Doch oftmals diese Lösungsmittel sind biologisch aktiv selbst erschweren dadurch Interpretation des Tests chemische Daten 51. In der Tat, nach Rufli et al. 52 und andere 53, empfiehlt es sich, Testlösungen für aquatische Toxizität Experimente werden unter Verwendung physikalischer Methoden auf chemische Verfahren, durch das Potenzial von chemischen Lösungsmitteln Toxizität Artefakte zu erstellen. Wir haben zuvor gezeigt, dass TCS in 0,24% Ethanol / Wasser (v / v) gelöst und 30 min mit Ultraschall behandelt dämpft RBL Mastzelldegranulation 2. Ethanol bei höheren Konzentrationen als 0,24% wurde gezeigt, dass Mastzellen Degra dämpfennulation 54,55-Beispiele für die möglicherweise verwirren Auswirkungen von organischen Lösungsmitteln auf Toxizität. Es ist nicht nur wichtig, um die Wirkung von Lösungsmitteln auf den Organismus oder Zellen zur Untersuchung verwendeten betrachten, sondern es ist auch wichtig, um die Wirkung von Lösungsmitteln aus der Prüfsubstanz selbst überwachen. Zum Beispiel Skaare et al. Fanden heraus, dass 51 Auflösen TCS in Polyethylenglykol (häufig in Zahnpasten und Mundwasser gefunden) geschwächt anti-bakterielle und anti-Plaque-Effekte bei gesunden weiblichen Frauen, während in Auflösung Öle verursacht einen vollständigen Verlust der Funktion. Daher ist die Fähigkeit von verschiedenen Lösungsmitteln zu modulieren Giftstoff und Arzneimittel, einschließlich TCS sollte Effekte in Assays berücksichtigt werden. Verwendung von Ölen oder Geschmack Additive können mit den Auswirkungen der TCS in verschiedenen Produkten 50,51 stören. In dem Bemühen, die Notwendigkeit der Verwendung organischer Lösungsmittel zu beseitigen, verbesserten wir auf unsere Methode zum Lösen TCS 2 durch den Wegfall der Verwendung eines organischen Solentlüften. In der vorliegenden Protokoll, wir lösen TCS Granulat direkt in wässrigem Puffer mit Wärme (≤ 50 ° C), und überprüfen Sie dann die Konzentration dieser TCS Lager durch UV-Vis-Spektroskopie. Diese Verbesserungen sind möglich, weil TCS löslich ist in Wasser bis zu 40 um ( <a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a> ) und es wurde gezeigt, um den Abbau zu widerstehen, wenn auf 50 ° C (erhitzt <a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http:// / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a> ) 56,57. Wir haben auch den zusätzlichen Vorteil der UV-Vis-Spektroskopie, wie TCS ist auch bekannt, bei 280 nm stark absorbieren 58 mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von 4200 L / mol / cm 12. Dieses Protokoll bietet eine einfache, aber effektive Möglichkeit, TCS Granulat in einen Puffer zu lösen, ohne die Hilfe eines organischen Lösungsmittels, einschließlich Low-Cost und schnelle ÜberprüfungKonzentration, beschreibt und eine leistungsfähige fluoreszierenden Mikroplattenassay zur Überwachung chemischer Effekte auf Mastzelldegranulation.

<table><tbody><tr><td> RBL-2H3 Cells </td><td>ATCC</td><<td>p align="center">CRL-2256</td><td> Die Zellen, die wir verwendet haben, waren ein Geschenk, aber sie sind auch bei ATCC erhältlich </td></tr><tr><td> Triclosan/Irgasan </td><td>Sigma</td><td>72779 CAS# 3380-34-5</td><td> Sollte in einer Umgebung mit geringer Luftfeuchtigkeit gelagert werden </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td>Gibco</td><td>25300-054 CAS# 3380-34-5</td><td> </td></tr><tr><td> EMEM </td><td>Lonza</td><td>12-611F</td><td> </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td> </td></tr><tr><td> Gentamycinsulfat </td><td>Lonza Biological Sciences</td><td>17-518</td><td> </td></tr><tr><td> Albumin, Bovine Serum </td><td>Calbiochem</td><td>12659 CAS# 9048-46-8 </td><td> </td></tr><tr><td> Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% Lösung) </td><td>Pierce</td><td>28314 CAS# 9002-93-1</td><td> </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>J.T Bäcker</td><td>4153-01 CAS# 75277-39-3</td><td> </td></tr><tr><td> Magnesiumchlorid </td><td>VWR</td><td>BDH0244-500G CAS# 7791-18-6</td><td> </td></tr><tr><td> D-(+)-Glukose </td><td>Biomedicals</td><td>152527 CAS# 50-99-7</td><td> </td></tr><tr><td> Kaliumchlorid-Kristall </td><td>J.T Baker</td><td>3046-01 CAS# 7447-40-7</td><td> </td></tr><tr><td> Calciumchloriddihyrdat </td><td>Acros Organics</td><td>207780010 CAS# 10035-04-8</td><td> </td></tr><tr><td> Glycin </td><td>Sigma</td><td>G8898 CAS# 56-40-6</td><td> </td></tr><tr><td> 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-&beta;-D-Glucosaminid (4-MU) </td><td>EMD Biosciences</td><td>474502-250MG CAS # 37067-30-4</td><td> Wrap in foil &ndash; ist lichtempfindlich </td></tr><tr><td> Anti-DNP Maus IgE </td><td>Sigma</td><td>D8406</td><td> Reagenz hat eine Konzentration von 1 mg/ml. Aliquot 25 &Mikro; l&nbsp; des Reagenzes in separate Mikrozentrifugenröhrchen und Parafilm. Lagern Sie Aliquots bei -20 > C, die nicht verwendet werden, und speichern Sie das Aliquot, das bei 2-8 μg verwendet wird; C nicht länger als 1 Monat. </td></tr><tr><td> DNP-BSA </td><td>Geschenk von Dr. David Holowka und Dr. Barbara Baird, Cornell University</td><td></td><td> Vorschlagen: Lebenstechnologien DNP-BSA Katalog# <a href="http://www.invitrogen.com/search/global/miniPDPAction.action?query=A23018">A23018</a> </td></tr><tr><td> Calcium-Ionophor A23187 </td><td>Sigma</td><td>C75-22-1mg</td><td> Ionophor wurde aus einem Pulver durch Zugabe von 400 &micro; l&nbsp; von frischem 100% DMSO in das Ionophor-Fläschchen und wird bei -20 & Grad aufbewahrt; C Hinweis: Wir haben das Ionophor nach seinem 3-monatigen Verfallsdatum erfolgreich verwendet </td></tr><tr><td> DMSO </td><td>Sigma</td><td>D2650 CAS# 67-68-5</td><td> </td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td>VWR</td><td>BDH3094-2 CAS# 64-19-7</td><td> </td></tr><tr><td> Wasserfreies Natriumcarbonat </td><td>Sigma</td><td>222321 CAS# 497-19-8</td><td> </td></tr><tr><td> Natriumchlorid </td><td>Sigma</td><td>71376 CAS# 7647-14-5</td><td> </td></tr><tr><td> Salzsäure </td><td>VWR</td><td>BDH3026 CAS# 7647-01-0</td><td> </td></tr><tr><td> Referenzpuffer, pH 7 </td><td>VWR</td><td>BDH5046</td><td> </td></tr><tr><td> Referenzpuffer, pH 10 </td><td>VWR</td><td>BDH5072</td><td> </td></tr><tr><td> Referenzpuffer, pH 4 </td><td>VWR</td><td>BDH5018</td><td> </td></tr><tr><td> pH-Elektrode Lagerlösung </td><td>VWR</td><td>14002-828</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">Ausrüstung:</td></tr><tr><td> DU 7500 Spektralphotometer </td><td>Beckmann</td><td>Nicht mehr verkauft</td><td> </td></tr><tr><td> Synergy 2 Plattenleser Verwendet die Gen5 Mikroplatten-Datenerfassungs- und Analysesoftware </td><td>BioTek</td><td>Modul S</td><td> </td></tr><tr><td> Hämatozytometer </td><td>Hausser Scientific</td><td> 3110</td><td> </td></tr><tr><td> 7 x&nbsp; 7 CER HOT/STIR 120 V Kombination Heizplatte/Magnetrührplatte </td><td>VWR</td><td>97042-634</td><td> </td></tr><tr><td> Zentrifuge </td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td> </td></tr><tr><td> Wasserbad für Gewebekulturen </td><td>VWR</td><td>Model# 89032-206</td><td> </td></tr><tr><td> Biologische Sicherheitswerkbank für Gewebekultur SafeGARD (TC-Haube) </td><td>The Baker Company</td><td>Modell# SG403A-HE</td><td> </td></tr><tr><td> Inkubator für Gewebekulturen </td><td>ThermoScientific</td><td>Model# 3598</td><td> </td></tr><tr><td> Pipetman </td><td>VWR</td><td></td><td> Bereich: P2-P1000 </td></tr><tr><td> Balance </td><td>Mettler Toledo</td><td>Model# AG204</td><td> </td></tr><tr><td> pH-Meter </td><td>Symphony/VWR</td><td>Modell# SB70P</td><td> </td></tr><tr><td> Pipet-Aid </td><td>Drummond Scientific<</td><td>p align="center">4-000-100</td><td> </td></tr><tr><td> Combitip dispenser </td><td>Eppendorf</td><td>4981 000.019</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">Rezepte:</td></tr><tr><td> Acetatpuffer, pH 4,4 </td><td>0,12 M Essigsäure herstellen und mit 10 N NaOH auf pH 4,4 titrieren. Dies sind 5,3 ml Eisessig in 1 l MilliQ Wasser: (1 L)*(0,12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1,37 g) = 5,3 ml, da die Dichte der Eiszeit 1,37 g/ml</td><td>Sterilfilter in autoklavierte Glasflasche</td><td></td></tr><tr><td> Substrat (4-MU) </td><td>Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) In -20&deg; C Bestand: 0,12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm auf 37 & Grad; C, Vortex, 10 Min. im Wasserbad-Ultraschallgerät mit warmem Wasser beschallen, erneut vortexen</td><td>Für jedes Experiment eine frische Lösung des Substrats in Acetatpuffer herstellen (100x Verdünnung), für eine Endkonzentration von 1,2 mM in Acetatpuffer</td><td></td></tr><tr><td> Glycincarbonat-Puffer, pH 10 </td><td>26,7 g Glycin 47,1 g wasserfreies Natriumcarbonat Deionisiertes Wasser für 1 L hinzufügen, und stellen Sie den pH-Wert auf 10</td><td>Sterilfilter in eine autoklavierte Glasflasche</td><td></td></tr><tr><td> Tyroden (2 L), pH 7,4 </td><td>135 mM NaCl: 15,78 g (oder 270 ml von 1 M) 5 mM KCl: 10 ml von 1 M Stamm 1,8 mM CaCl2: 7,20 ml von 0,5 M Stamm 1 mM MgCl2: 4,00 ml von 0,5 M Stamm 5,6 mM Glukose: 2,02 g (11,2 ml von 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml von 1 M Stamm Unter Verwendung von konzentriertem HCl-pH-Wert von ~9,7-7,4</td><td>Sterilfilter in autoklavierte Glasflasche</td><td></td></tr><tr><td> RBL Zellmedien </td><td>Auftauen von fötalem Rinderserum (FBS, gelagert bei -20 &de; C) für ca. 4 Stunden bei 37°; C-Wasserbad Befolgen Sie die sterile Standardtechnik Holen Sie mindestens 1 l essentielles Medium (MEM) mit L-Glutamin (mit Earle' Gießen Sie etwas MEM ab, um 800 ml MEM zu erhalten, fügen Sie 200 ml warmes FBS hinzu Geben Sie 1 ml Gentamicinsulfat-Antibiotikum mit einer sterilen Pipette zu 1 l Medium. Verwenden Sie nur Medienflaschen, die autoklaviert und nur für die Verwendung in Zellkulturen gekennzeichnet wurden.</td><td>Sterilfilter (0,2 mm) in autoklavierte Glasflasche<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Verwendetes Kunststoffmaterial:</td></tr><tr><td> 200 &micro; l&nbsp; Sterile Einweg-Pipettenspitzen mit Graduierung in 96 Rack </td><td>VWR</td><td>53509-009</td><td> Polypropylen </td></tr><tr><td> 1.000 &micro; l&nbsp; Sterile Aerosol-Pipettenspitzen mit HighRecovery </td><td>VWR</td><td>89003-420</td><td> Polyethylen </td></tr><tr><td> 10 &micro; l&nbsp; Micro Tip Low Binding steril </td><td>VWR</td><td>14217-704</td><td> Polypropylen </td></tr><tr><td> Einweg-/konische Mikrozentrifugenröhrchen für hohe G-Kräfte </td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td> Polypropylen </td></tr><tr><td> Einweg/graduiert/konisch/steril 50 ml&nbsp; Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschlüssen </td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td> Polypropylen </td></tr><tr><td> Einweg/graduiert/konisch/steril 15 ml&nbsp; Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschlüssen </td><td>VWR</td><td>21008-103</td><td> Polypropylen </td></tr><tr><td> CELLSTAR T-25 Kolben mit Filterkappe </td><td>Greiner Bio One</td><td>690175</td><td> Polystyrol </td></tr><tr><td> CELLSTAR T-75 Kolben mit Gewebekulturbehandlung mit Filterkappe </td><td>Greiner Bio One</td><td>658175</td><td> Polystyrol </td></tr><tr><td> CELLSTAR 10 ml&nbsp; Serologische Pipette aus Papier/Plastikfolie </td><td>Greiner Bio One</td><td>607180</td><td> Polystyrol </td></tr><tr><td> CELLSTAR 2 ml&nbsp; Serologische Pipette in Papier-/Plastikverpackung </td><td>Greiner Bio One</td><td>710180</td><td> Polystyrol </td></tr><tr><td> CELLSTAR 5 ml&nbsp; Serologische Pipette aus Papier/Plastikfolie </td><td>Greiner Bio One</td><td>606180</td><td> Polystyrol </td></tr><tr><td> CELLSTAR 25 ml&nbsp; Serologische Pipette aus Papier/Plastikfolie </td><td>Greiner Bio One</td><td>760180</td><td> Polystyrol </td></tr><tr><td> 1 cm Küvetten </td><td>N/A</td><td>N/A</td><td> Polystyrol </td></tr><tr><td> CELLSTAR, 96W Mikroplatte, Gewebekulturbehandelt, schwarz, mit Deckel 96-well Platte </td><td>Greiner Bio One</td><td>655086</td><td> Polystyrol </td></tr><tr><td> Combitips </td><td>Eppendorf</td><td> 022266501</td><td> Polypropylen/ Polyethylen </td></tr></tbody></table>

ein mikroplatten assay chemical auswirkungen auf die rbl-2h3 mastzelldegranulation bewerten: effekte von triclosan ohne verwendung eines organischen lösungsmittels

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mastzellen spielen eine wichtige Rolle bei allergischen Erkrankungen und Immunabwehr gegen Parasiten. Einmal aktiviert (z. B. durch ein Allergen), sie degranulieren, ein Prozess, dass die Ergebnisse in der Exozytose von allergischen Mediatoren. Modulation von Mastzelldegranulation durch Medikamente und Giftstoffe können positive oder negative Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit. Mastzellfunktion wurde im Detail unter Verwendung von Ratten-Basophilenleukämie Mastzellen (RBL-2H3), eine allgemein anerkannte Modell der menschlichen Schleimhaut Mastzellen 3-5 seziert. Mastzellen Granulat-Komponente und der allergischen Mediator β-Hexosaminidase, der linear zusammen mit Histamin aus Mastzellen 6 freigegeben, leicht und zuverlässig durch die Reaktion mit einem fluorogenen Substrat gemessen werden, was messbar Fluoreszenzintensität in einem Mikroplatten-Assay, der zugänglich ist, Hochdurchsatz-Studien 1. Zitat von Naal et al. 1 veröffentlicht, haben wir diese Degranulation Assay für das Screening o angepasstf Drogen und Giften und demonstrieren ihren Einsatz hier. Triclosan ist ein Breitspektrum-Antibiotikum, die in vielen Verbraucherprodukten ist und sich als ein therapeutisches Hilfsmittel in menschlichen allergischen Hauterkrankungen 7-11, obwohl der Mechanismus für diesen Effekt ist nicht bekannt. Hier zeigen wir einen Assay für die Wirkung von Triclosan auf Mastzellen Degranulation. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Triclosan wirkt sich stark auf Mastzellfunktion 2. In dem Bemühen, den Einsatz eines organischen Lösungsmittels zu vermeiden, wird Triclosan direkt in wässrigem Puffer mit Wärme und unter Rühren gelöst, und die daraus resultierende Konzentration die Bestätigung mit UV-Vis-Spektroskopie (mit ε 280 = 4,200 L / M / cm) 12. Dieses Protokoll hat das Potential, mit einer Vielzahl von Chemikalien verwendet werden, um ihre Wirkung auf Mastzellen Degranulation bestimmt, und im weiteren Sinne, deren allergenes Potential.

Beim Erwärmen auf 50 ° C für 90 min, erzeugt das UV-Vis-Absorptionsspektrum für TCS eine starke, glatte Kurve zwischen ~ 260 und 300 nm, mit einem Peak bei 280 nm, wie in Abbildung 1 gezeigt. UV-Vis-Spektroskopie ist daher ein wichtiges Instrument, das verwendet wird, um die Konzentration berechnet werden kann, da die veröffentlichte molaren Absorptionskoeffizienten bei 280 nm 4,200 l / mol / cm 12. Wir haben festgestellt, dass TCS nicht aus der Lösung während des Zeitrahmens der gesamten Degranulation Experiment...

Mastzelldegranulation, die Freisetzung von allergischen Mediatoren ist in Allergie, Asthma und Parasiten Verteidigung wichtig. Hier haben wir Techniken 1 für die Beurteilung Auswirkungen von Drogen und Giften auf Degranulation demonstrieren, Methodik kürzlich genutzt, um die leistungsfähige hemmende Wirkung von antibakteriellen Wirkstoff Triclosan 2 aufweisen.

Ein Mikroplatten Assay Chemical Auswirkungen auf die RBL-2H3 Mastzelldegranulation bewerten: Effekte von Triclosan ohne Verwendung eines organischen Lösungsmittels

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, mit einem Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Assay chemische Effekte auf die Mastzelldegranulation zu bewerten. In diesem Protokoll wird die hemmende Wirkung des antimikrobiellen Wirkstoffs Triclosan ohne Verwendung eines organischen Lösungsmittels nachgewiesen. Dies wird erreicht, indem die Mastzellen zunächst in eine 96-Well-Platte plattiert werden, damit sie sich über Nacht anlagern können, und Triclosan in einer wässrigen Lösung ohne den Einsatz organischer Lösungsmittel durch Erhitzen hergestellt wird.Die Konzentration der Trian-Lösung wird dann schnell mit Hilfe der ultravioletten sichtbaren Spektroskopie bestimmt. In einem zweiten Schritt werden die Zellen mit dem IgE-Slash-Antigen oder einem Kalziumionophor in Gegenwart oder Abwesenheit von Trian stimuliert, was die Freisetzung des Mastzell-Degranulationsmarkers Beta-Hexosaminidase in den Überstand bewirkt. Die Freisetzung von Beta-Hexosaminidase in den Zellüberstand wird mit Hilfe eines Beta-Hexosaminidase-Substrats quantifiziert, dessen Fluoreszenzprodukt in einem Mikroplatten-Reader quantifiziert wird.Um die Wirkung von Triclosan oder anderen Prüfchemikalien auf die Mas

a-microplate-assay-to-assess-chemical-effects-on-rbl-2h3-mast-cell

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video beschreiben wir eine in vitro Methode, um das allergische Potenzial eines Antigens zur Induktion der basophilen Degranulation zu bewerten. β-Hexosaminidase wird als Index für die Freisetzung chemischer Mediatoren verwendet, und die Enzymaktivität von β-Hexosaminidase wird mit einem fluorogenen Substrat gemessen.

Humanisierter Mediator-Enzym-Freisetzungsassay: Eine immunchemische Methode zum Screening des allergischen Potenzials von Testantigenen durch Überwachung der Basophilen-Degranulationsreaktion in vitro

Dieses Video zeigt einen kolorimetrischen Assay zur Bestimmung der Degranulationsaktivität von Mastzellen. Das von den Mastzellen freigesetzte Enzym hydrolysiert das Substrat und produziert ein farbiges Produkt. Die Degranulationsaktivität der Mastzellen wurde gemessen, da sich die prozentuale Freisetzung von Enzymen außerhalb der Zelle mit dem Gesamtenzymgehalt in der Zelle normalisierte.

Mastzell-Degranulationsassay zur Untersuchung der Wirkung einer Zielchemikalie

Dieses Video zeigt einen zellulären Assay mit Glioblastomzellen, die CXCR4-Chemokinrezeptoren exprimieren. Der Assay verwendet einen Kalzium-sensitiven Farbstoff, um Fluoreszenzänderungen bei Wirkstoffinteraktion zu messen, und bietet Einblicke in die zelluläre Signaldynamik.

Ein zellulärer Assay zur Identifizierung von CXCR4-interagierenden Wirkstoffen

Dieses Video zeigt einen Assay zur Überwachung der Neutrophilenaktivierung und der Granulatexozytose durch einen Degranulationsassay. Bei der Aktivierung durch proinflammatorische Verbindungen verschmelzen zytoplasmatische Granula in den Neutrophilen, die Gelatinase enthalten, mit der Zellmembran und entladen ihre Fracht. Das Vorhandensein von Gelatinase im Überstand wird durch die Hydrolyse eines Fluorophor-konjugierten Gelatinesubstrats beurteilt, wodurch die Aktivierung und Degranulation von...

Ein Degranulationsassay zur Überwachung der Neutrophilenaktivierung und der Gelatinasefreisetzung

Die Untersuchung der frühen Migration von Endothelzellen (EEC) ist wichtig, um die Pathophysiologie bestimmter Krankheiten zu verstehen und möglicherweise neue Strategien für therapeutische Interventionen zu identifizieren. Das folgende Protokoll beschreibt Techniken zur Beurteilung der Zellmigration, die für die Untersuchung von EEC angepasst wurden.

Bewertung der Endothelzellmigration nach der Exposition gegenüber toxischen Chemikalien

Hier präsentieren wir Protokolle zum schnellen Screening und zur Charakterisierung von Enzymen auf antimikrobielle Aktivität. Der Mikroschiebe-Diffusionsassay und der Farbstofffreisetzungsassay verwenden bakterielle Zielsubstrate für die qualitative und quantitative Bewertung der enzymatischen Aktivität.

Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu isolieren und kultivieren murinen peritonealen Mastzellen. Wir beschreiben auch zwei Protokolle für ihre funktionelle Charakterisierung: eine fluoreszierende Imaging der intrazellulären freien Ca2 + Konzentration und eine Degranulation Assay anhand der kolorimetrischen Quantifizierung der veröffentlichten β-Hexosaminidase.

Isolierung von Mastzellen Bauchfell abgeleitet und deren funktionelle Charakterisierung mit Ca2 +-imaging und Degranulation Assays

Wir haben eine Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zum Sondieren der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf bakterielle Infektion von adhärenten Zellen entwickelt. Dieser Assay ist kompatibel mit Durchflusszytometrie, Immunostaining und Traktion Rasterkraftmikroskopie, zulassend quantitative Messungen der biomechanischen Wechselwirkungen zwischen Zellen, extrazelluläre Matrix und Pathogene Bakterien.

Ein Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zur Untersuchung der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf die bakterielle Infektion von adhärenten Zellen

Hier stellen wir den Mediator-Release-Assay vor, bei dem eine basophile Leukämiezelllinie der Ratte verwendet wird, die mit dem menschlichen IgE-Rezeptor transfiziert ist, um die Degranulation von Effektorzellen zu simulieren, die typischerweise bei allergischen Reaktionen vom Typ 1 beobachtet wird. Diese Methode untersucht die biologische Aktivität von Allergenen hochempfindlich, reproduzierbar und passgenannt.

Humanized Mediator Release Assay als Ausleser für Allergenpotenz

Hier präsentieren wir ein verbessertes Chemotaxis-Assay-Protokoll. Ziel dieses Protokolls ist es, die Schritte und Kosten herkömmlicher bakterieller Chemotaxis-Methoden zu reduzieren und als wertvolle Ressource für das Verständnis von Pflanzen-Mikroben-Interaktionen zu dienen.

Ein verbesserter Chemotaxis-Assay zur schnellen Identifizierung von rhizobakteriellen Chemoattraktantien in Wurzelexsudaten

Erfahren Sie, wie Sie chemische Effekte auf die Mastzelldegranulation mit einem fluoreszenzbasierten Mikroplatten-Assay bewerten. Diese Methode zeigt die hemmenden Wirkungen von Triclosan auf RBL-2H3-Zellen ohne organisches Lösungsmittel.

Ein Mikroplatten Assay Chemical Auswirkungen auf die RBL-2H3 Mastzelldegranulation bewerten: Effekte von Triclosan ohne Verwendung eines organischen Lösungsmittels (Video) | JoVE Journal

Ein Mikroplatten Assay Chemical Auswirkungen auf die RBL-2H3 Mastzelldegranulation bewerten: Effekte von Triclosan ohne Verwendung eines organischen Lösungsmittels

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