Eine Einführung in die Transfektion

An Introduction to Transfection

JoVE Science Education
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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JoVE Science Education Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

An Introduction to Transfection

2.2: Gel Purification

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07:28 min

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February 01, 2013

Overview

Eine Transfektion ist der Prozess durch den man genetisches Material, wie zum Beispiel DNA oder doppelsträngige RNA, in Säugerzellen einfügt. Die Einfügung des Gens ermöglicht die Expression von Proteinen durch die zelleigene Maschinerie, wohingegen RNA in einer Zelle genutzt wird um die Expression eines Proteins durch das Hemmen der Translation zu verhindern. Die transfizierte RNA ist hauptsächlich im Zytoplasma aktiv, wohingegen die DNA für eine effiziente Transfektion in den Nukleus transportiert werden muss. Dort kann die DNA dann entweder transient (also für eine kurze Zeit) exprimiert werden, oder in die genomische DNA eingefügt werden und dadurch an Tochterzellen weitergegeben werden.

Dieses Video beschreibt die Grundlagen, die hinter der chemischen Transfektionen stehen, und behandelt einige der am häufigsten verwendeten Reagenzien, einschließlich elektrisch geladener Liposomen, Polymeren und Calcium-Phosphat. Wir beschreiben jeden Schritt wie man Zellen für eine Transfektion vorbereitet bis zu wie man die Transfektionseffizienz bestimmt. Zusätzlich beschreibt der Anwendungsteil des Videos alternative Methoden für die Transfektion, wie zum Beispiel Elektroporation und biolistische Transfektion. Es wird außerdem eine fortgeschrittenen Technik beschrieben, in der man siRNA und DNA in einen Zelle gleichzeitig einfügt, um ein zelleignes Protein zu hemmen und dann die Funktion eines mutierten Proteins zu untersuchen.

Procedure

Eine Transfektion ist der Prozess mit dem man genetisches Material, wie zum Beispiel DNA oder doppelsträngige RNA, in Säugerzellen einbringt. Diese Einbringung der DNA ermöglicht die Expression oder Produktion von Proteinen mit der zelleigenen Maschinerie der Zellen. Die Einfügung von doppelsträngiger RNA wird benutzt um die Produktion eines Proteins auszuschalten, in dem dessen Translation gehemmt wird. Dieses sehr nützliche Werkzeug erlaubt es Forschern die Funktion von Genen, Proteinen und genetischen Mutationen zu untersuchen.

Es gibt keine Transfektionsreagenz, die für alle verschiedenen Zellarten gleich gut funktioniert. Glücklicherweise wurden jedoch in den letzen Jahrzehnten Methoden und Reagenzien entwickelt um die Transfektion für viele Zelltypen zu ermöglichen. Diese Methoden können in zwei Gruppen unterteilt werden: chemische und physikalische Transfektion.

In diesem Video konzentrieren wir uns auf die verschiedenen chemischen Transfektionssysteme, da sie in den letzten Jahren immer häufiger angewendet werden. Diese Methoden schließen unter anderem Methoden die auf Liposomen basieren, Calcium-Phosphat Transfektionen und die Benutzung von kationischen Polymeren ein.

Das Grundprinzip jeder chemischen Transfektion ist ähnlich. Sie beruhen alle auf positiv geladenen Trägermolekülen, die einen Komplex mit den Nukleinsäuren bilden um sie für die Transfektion zu verpacken. Diese Trägermoleküle schaffen es die negative Ladung der Zellmembran zu überqueren, so dass sie ihren Inhalt in das Innere der Zelle bringen können.

Bei Lipofektionen formen kationische Lipide ein Liposom, das sich mit den Nukleinsäuren verbindet und so einen Transfektionskomplex bildet. Calcium-Phosphat auf der anderen Seite verdichtet nur die DNA und gibt ihr eine positive Ladung. Kationische Polymere, wie zum Beispiel Polyethelenimin, verdichten die DNA zu positiv geladenen Partikeln.

Der nächste Schritt in einer chemischen Transfektion ist die Anlagerung der positiv geladenen Komplexe an die negativ geladene Zellmembran durch einfache elektrostatische Anziehung.

Dann wird der Komplex in die Zelle durch Endozytose aufgenommen – also einem Prozess, bei dem ein Molekül in die Zelle durch ein membrangebundenes Vesikel gelangt.

Wenn sie erstmal in der Zelle sind, müssen Nukleinsäuren wieder aus den Endosomen austreten. Dieser Prozess ist bisher allerdings nicht bekannt. Wenn die Nukleinsäuren außerhalb des Endosoms sind, befinden sie sich erst im Zytoplasma der Zelle und dann im Zellkern, wo die zelleigene Maschinerie erst mRNA und dann Proteine davon herstellt. Die kleinen small interfering RNAs (siRNAs) wirken hauptsächlich im Zyotplasma in dem sie die Herstellung des Proteins durch das Hemmen der Translation verhindern.

Transfizierte DNA kann entweder stabil oder temporär in die Zelle eingebracht werden. Stabile Transfektionen treten auf wenn die DNA in das Genom der Zelle eingefügt wird und daher erhalten bleibt wenn sich die Zelle teilt. Transiente Transfektionen passieren wenn die DNA nicht in das Genom integriert wird und die Expression des Proteins daher zwischen 24-96h nachlässt.

Die Effizienz der DNA Transfektion wird normalerweise mit einem Reportersystem gemessen, das an das eingefügte Gen gekoppelt wurde. Diese Systeme können entweder einfach durch direktes Beobachten des Reporterproteins (beispielsweise des grün fluoreszierenden Proteins) erkannt werden, oder durch das Messen der enzymatischen Aktivität durch farbmetrische Verfahren, wie zum Beispiel bei Luziferase Reportern.

Um zu messen ob die siRNA erfolgreich war, kann das Expressionsniveau des Zielproteins durch Western Blot bestimmt werden. Eine erfolgreiche siRNA Transfektion verringert die Expression des Zielproteins in der Zelle, während Gene wie GAPDH (also ein Haushaltsgen) nicht betroffen sind.

Um die Transfektionseffizienz zu maximieren sollten Zellen bei der Transfektion in der logarithmischen Phase der Wachstumskurve sein, also bei einer Konfluenz zwischen 40-80%. Um das zu erreichen werden die Zellen am Tag davor geerntet, gezählt und in einer Multiwellplatte neu angesetzt. Die Konzentration wird so gewählt das die richtige Konfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion erreicht ist.

Dann werden die chemischen Reagenzien und die Nukleinsäuren vermischt damit sich die Nukleinsäure-Reagenzkomplexe bilden. Für jede chemische Methode muss die spezifische Konzentration jeder Komponente optimiert werden.

Die Nukleinsäure-Reagenzkomplexe werden dann zu den Zellen hinzugefügt und über Nacht inkubiert, damit ausreichend Zeit vorhanden ist um sich an die Zellen anlagern und die Transfektion durchzuführen. Nach 24 Stunden sollte das Medium entfernt und mit frischem Medium aufgefüllt werden.

Es gibt viele Variationen and Anwendungen der Transfektion. Eine Co-Transfektion ermöglicht es Forschern den Effekt einer Mutation für die Funktion eines Proteins zu untersuchen. Hier wurde eine RNAi in HeLa Zellen transfiziert, um das zelleigene BRCA1 Protein zu hemmen, was zu einer Verminderung der GFP positiven Zellen führt. Zur gleichen Zeit wurde ein mutiertes BRCA1 Protein in die Zelle transfiziert, welches nun von der Zelle hergestellt wird. Wenn das mutierte Protein funktionieren würde, sollte man wieder viele GFP positive Zellen sehen, wenn aber die Mutation sich negativ auf die Funktion ausübt bleibt die Zahl der GFP positiven Zellen niedrig.

Als Alternative zu chemischen Transfektionsmethoden können Forscher auch, wie hier zu sehen ist, eine biolistische Genkanone benutzen, die Goldpartikel die mit DNA bedeckt sind, auf die Zellen in Kultur schießt. Zellen mit kleinen DNA Kugeln in ihrem Zytoplasma haben eine gute Chance transfiziert zu sein.

Eine weitere alternative Methode zur Transfektion ist die Elektroporation. Bei der Elektroporation benutzt man einen elektrischen Strom, um die Zellmembran zu beschädigen und dadurch DNA und RNA in die Zelle zu lassen in der kurzen Zeit bevor die Zelle den Schaden reparieren konnte. Hier werden Elektroden in einem Maushirn platziert um kurze Pulse von Elektrizität durch das Gehirn zu leiten, damit die injizierten RNAi Moleküle in der blauen Lösung ex vivo transfiziert werden. Die Effekte des Ausschaltens eines Gens werden dann im sich entwickelnden Kortex untersucht.

Das war das Video über die Transfektion von JoVE. Wie immer- danke für eure Aufmerksamkeit.

Transcript

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA enables the expression, or production, of proteins using the cells own machinery. Whereas insertion of double-stranded RNA is used to shut down the production of a specific protein by stopping translation. This powerful tool has allowed researchers better study gene function and expression, protein function, and genetic mutations.

No single transfection reagent or method works for all cell types. Fortunately, many methods and reagents have been developed in the past few decades to facilitate transfection of a wide variety of cells. These methods can be separated into two main groups: chemical and physical transfections.

In this video, we will focus on the different chemical delivery systems, as they have become increasingly common in recent years. These methods include lipid-based approaches, calcium phosphate mediated transfection, and the use of cationic polymers to name a few.

The underlying principle of all the chemical transfection methods are similar. They all make use positively charged carrier molecules that complex with nucleic acids to package them for cellular delivery. These carrier molecules overcome the negative charge of the cell-membrane barrier which allows them to pass through the membrane to deliver their contents.

In lipid transfection, cationic lipids form a liposome which then combines with nucleic acids to form a “transfection complex”. Whereas calcium phosphate simply condenses the DNA and gives it a net positive charge. Additionally, cationic polymers such as polyetheleneimine condense the DNA into positively charged particles.

The next step in chemical mediated transfection is attachment of the positively charged complexes to the negatively charged cell membrane through simple electrostatic attraction.

Then, the complex enters the cell via endocytosis – a process by which molecules enter the cell via membrane-bound vesicles called endosomes.

Once inside the cell, the nucleic acids must escape from the endosome by a process that is still unknown. Once outside the endosome, the nucleic acids will find themselves in the cell’s cytoplasm and then ultimately the nucleus, where the cell’s machinery is able to make mRNA and then protein from it. The cytoplasm is the site of action for the small interfering RNA, or siRNA where it reduces the production of protein by interfering with a part of the cell’s protein producing machinery.

Transfected DNA can exist either stably or transiently. Stable transfections occur when transfected DNA is introduced into the genome and therefore persists as the cell divides. Transient transfections occur where the DNA is not incorporated into the genome and expression of the coded protein is lost during a span of about 24-96 hours.

The efficiency of DNA transfection is typically measured through reporter systems that are tethered to the inserted gene. These are systems that can be easily detected either by directly observing the reporter protein itself, such as in the case of green fluorescent protein, or by its measuring its enzymatic activity using a colorimetric assay, as in the case of a luciferase enzyme reporter. Stable DNA transfection is best measured by genomic analysis such as RT-PCR.

To measure the success of siRNA silencing, the targeted protein levels in each sample can be determined by Immunoblot. Successful siRNA transfection should decrease the expression of the target protein within the cells while levels of the housekeeping gene, GAPDH, remain stable.

To maximize transfection efficiency, cells should be maintained in log phase growth and be between 40 and 80% confluent, at the time of transfection. In order to accomplish this, cells in culture should be harvested the day before… counted… and seeded into a multi-well plate at a concentration that will yield the correct level of confluencey at the time of transfection.

Next, the chemical reagents and nucleic acids are mixed and given time to form the nucleic acid-reagent complexes. For each chemical delivery system the specific concentrations of each component must be optimized.

The nucleic acid-reagent complexes are then added to the plated cells and incubated often overnight to give plenty of time for the complexes to attach to the cells and mediate transfection. After 24 hours, the media should be removed and replaced with fresh culture media.

Many variations and applications of transfection exist. Co-transfection can allow a researcher to study the effect of missense mutations on the function of cellular proteins. Here, RNAi was transfected into HeLa cells in order to down-regulate the endogenous BRCA1 protein, which causes a reduction in the number of GFP positive cells. At the same time a mutant BRCA1 protein was also transfected and produced by the cell. If the mutated protein was fully functional it caused a recovery in the number of GFP positive cells, but if the mutation negatively affected function, then the number of GFP positive cells stayed low.

As an alternative to chemical transfection methods, a researcher, shown here, uses a gene gun to fire gold particles laced with DNA at cells in culture. Cells that end up with the small DNA coated bullets within their cytoplasm have a good chance for becoming transfected.

Another alternative method for transfection is electroporation. Electroporation is the use of electrical current to damage the cell’s membrane allowing DNA or RNA to enter the cell for a short time before the cells have time to repair. Here, tweezer electrodes are placed around a mouse brain and short pulses of electricity are passed through the brain to initiate ex-vivo transfection of the injected RNAi molecules within the blue solution. The effects of gene silencing on the structure of the developing cortex is then observed.

You’ve just watched JoVE’s video on transfection. As always, thanks for watching!