Mit einem automatisierten 3D-Tracking-System werden Individuen und Schwärme von erwachsenen Zebrafischen erfasst

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die dreidimensionalen Bewegungsmuster von Zebrabärblingen oder anderen aquatischen Tieren zu untersuchen und deren kinematischen, räumlichen und sozialen Eigenschaften zu analysieren. Dies ermöglicht die Erkennung veränderter Verhaltensweisen, die durch genetische Mutationen oder chemische und umweltbedingte Faktoren hervorgerufen werden. Dies wird erreicht, indem zunächst das System kalibriert wird, wodurch gleichzeitig die erhebliche Bildverzerrung korrigiert wird, die durch Brechung verursacht wird.

Der zweite Schritt besteht darin, Videobilder mit relativ hoher zeitlicher Auflösung gleichzeitig aus mindestens zwei verschiedenen Blickwinkeln aufzuzeichnen. Anschließend rekonstruiert die Software die Trajektorien der Fische. Es werden fortschrittliche Algorithmen angewandt, um den Einfluss von Rauschen zu verringern und die Position eines Fisches während Verdeckung oder Gruppierung zu bestimmen.

Der letzte Schritt besteht darin, die Daten zu analysieren und eine statistische Auswertung für Geschwindigkeit, Beschleunigung, Drehwinkel, horizontale und vertikale Verteilung im Beobachtungsbehälter, interindividuelle Abstände und andere Parameter von Interesse durchzuführen. Letztendlich eignet sich das hochauflösende kalibrierte 3D-Tracking zur Untersuchung verhaltensbedingter Defizite bei mutierten Zebrafischen und der Wirkung von Wirkstoffen auf eine Vielzahl verhaltensrelevanter Systeme. Für die Wirkstoffforschung bietet das System den Vorteil, dass es die Untersuchung des Fischverhaltens in 3D ermöglicht.

Das ist wichtig, weil Fische sich natürlich in allen drei Dimensionen bewegen und bei gleichzeitiger Aufnahme mehrerer Fische eine 2D-Aufnahme irreführend sein kann, wenn die räumlichen Konfigurationen der Gruppe untersucht werden. Ein weiterer Vorteil des Systems besteht darin, dass es Lichtbrechung korrigiert, die, wenn sie nicht korrigiert wird, zu erheblichen Messfehlern führen kann. In der derzeitigen Konfiguration befindet sich der Beobachtungsbehälter mit den Zebrafischen in der Beobachtungskammer.

Die Kammer enthält außerdem eine Kamera, einen Spiegel, der in einem Winkel von etwa 45 Grad über dem Behälter angebracht ist, sowie LED-Lichtleisten. Vor der Aufnahme muss das System kalibriert werden, um die Position der Behälterwände und der Wasseroberfläche sowie den Maßstabsfaktor der aufgezeichneten Einzelbilder zu bestimmen, und um den durch die Lichtbrechung beim Übergang von Wasser zu Luft verursachten Fehler zu korrigieren. Nach Abschluss der Kalibrierung sollte ein Testlauf mit einem Dummy-Fisch durchgeführt werden.

Die Neukalibrierung sollte durchgeführt werden, wenn die Positionen des Spiegels oder der Kamera nicht stimmen oder wenn Probleme mit der Verfolgung auftreten. Um eine Aufnahmesitzung zu beginnen, stellen Sie den Beobachtungsbehälter, der bis zu den Markierungen mit Wasser gefüllt ist, in die Beobachtungskammer. Die Füße des Behälters sollten in die Ausrichtungslöcher eingesetzt werden.

Richten Sie die Behälter so aus, dass die halbtransparenten oder undurchsichtigen Wände von der Kamera aus gesehen zur Rückseite und zur rechten Seite zeigen. Schalten Sie anschließend die Beleuchtung im Fach ein, geben Sie die Fische in den Behälter und schließen Sie die Vorhänge. Öffnen Sie das Aufnahmemodul, und das Bild der Vorder- und Draufsicht des Behälters erscheint auf dem Bildschirm.

Anfangs ist das aufgenommene Bild möglicherweise nicht ideal und muss daher möglicherweise etwas angepasst werden, um einen ausreichenden Kontrast zwischen dem Fisch und dem Hintergrund zu erzielen. Um das Bild anzupassen, wählen Sie die Kamerasteuerung aus und deaktivieren Sie dann im sich öffnenden Fenster mit den allgemeinen Einstellungen die hier gezeigten Felder. Stellen Sie anschließend Verschlusszeit und Verstärkung so ein, dass das Bild nicht überbelichtet ist. Wählen Sie danach auf der linken Seite des Kamerasteuerungsfensters die Weißabgleichfarbe aus und deaktivieren Sie im neuen Fenster das Feld „Auto“. Passen Sie anschließend die Rot- und Blauwerte so an, dass sowohl in der Vorder- als auch in der Draufsicht der beste Farbkontrast erreicht wird.

Nach Abschluss der Einstellungen sind möglicherweise mehrere Anpassungen erforderlich. Wählen Sie im Hauptmenü des Aufnahmemoduls den Datenspeicherort aus, um einen Ordner zu erstellen oder auszuwählen. Jede Aufnahme sollte einen eigenen Ordner haben, der ein Unterordner des Experimentordners sein sollte.

Drücken Sie nun auf „Aufnahme starten“ und geben Sie eine ganze Zahl für die Dauer der Aufnahme in Minuten ein, dann bestätigen Sie mit „OK“ und die experimentelle Aufnahmesitzung beginnt. Sobald die Aufnahmen abgeschlossen sind, kopieren und fügen Sie die Datenordner des Tierbehälters und der Korrespondenzdaten aus dem Kalibrierungsordner in die zuvor erstellten Ordner während der Aufnahme. Um die Pfadrekonstruktion zu starten, öffnen Sie das Trajektorienmodul der Software. Drücken Sie dann auf „Datenort“, um den mit dem Aufnahmemodul erstellten Ordner auszuwählen.

Drücken Sie als Nächstes zuerst die System-Setup-Taste, um das Parameterfenster zu öffnen, und stellen Sie die Farbschwellen für die obere und untere Ansicht ein. Ein guter Startwert ist 1000. Wählen Sie danach die Größenschwellen für die obere und untere Ansicht aus.

Eine gute Ausgangsgröße für einen mittelgroßen Zebrafisch beträgt 10, verwenden Sie 20 für einen großen Fisch und 5 für einen kleinen Fisch. Je höher diese Schwellenwerte sind, desto unwahrscheinlicher ist es, dass die Software Rauschen erfasst. Bei zu hohen Werten könnte sie jedoch möglicherweise den Fisch nicht mehr erkennen.

Es kann notwendig werden, diese Schwellenwerte im weiteren Verlauf des Experiments erneut anzupassen. Für die obere Größenschwelle ist ein Wert von 3000 gewöhnlich ausreichend. Für die spezifische Länge behalten Sie den voreingestellten Wert von 220 bei.

Die Anzahl der Fische bezieht sich auf die Zahl der Fische im Beobachtungsbecken. Die maximale Anzahl an Punkten bezieht sich auf die Gesamtanzahl der Einzelbilder; notieren Sie sich diese Zahl und klicken Sie auf „Okay“. Wählen Sie anschließend „Hintergrund aufnehmen“.

Im nächsten Fenster werden Sie aufgefordert, die Felder „von“ und „bis“ auszufüllen. Nachdem der Hintergrund geladen wurde, passen Sie die drei roten Boxen mithilfe der Maus an; diese markieren die Bereiche, in denen die Software nach den Fischen sucht. Verkleinern Sie die Box auf der linken Seite.

Da die Seitenansicht nur zur Kalibrierung verwendet wird, drücken Sie nun die Schaltfläche „Trajektorien generieren starten“, und die Pfadrekonstruktion beginnt. Im Idealfall sollte das Tag auf dem Bild des Fisches platziert werden; falls es häufig falsch platziert wird, öffnen Sie das Informationsfenster. Hier sehen wir einen idealen Fall, bei dem nur die Umrisse des Fisches sichtbar sind.

Im Falle von übermäßigem Rauschen drücken Sie im Hauptmenü auf „Stop“ und wählen Sie neue Farb- und Größenschwellenwerte. Prüfen Sie außerdem, ob die roten Rahmen leicht verkleinert werden können. Zum Beispiel oben, um das durch Wasserbewegungen verursachte Rauschen auszuschließen; beobachten Sie hierzu die Bahn auf dem 3D-Bildschirm.

Durch einen Rechtsklick mit der Maus kann der Forscher zwischen Rotation und Translation der 3D-Konfiguration wählen. Um mit der Datenverarbeitung zu beginnen, öffnen Sie das Datenverarbeitungsmodul, wählen Sie Projekt in der Symbolleiste aus und anschließend im Dropdown-Menü Neu aus, und geben Sie einen Experimentnamen ein. Danach wählen Sie Projekt bearbeiten aus.

Danach zum Projekt hinzufügen, gefolgt von einer neuen Gruppe, und einen Namen für die Versuchsgruppe eingeben. Wählen Sie nun die Versuchsgruppe im rechten Fenster aus. Beachten Sie, dass sich die Symbolleiste ändert.

Wählen Sie „Gruppe bearbeiten“, dann „Zur Gruppe hinzufügen“ und anschließend „Neue Messungen“. Dadurch wird ein Browserfenster geöffnet. Öffnen Sie danach den während der Aufnahme erstellten Ordner und wählen Sie den Unterordner „Trajektorien“ sowie anschließend die geglättete Punktedatei aus.

Im hier dargestellten Beispiel für Gruppe A wurden sechs Dateien geladen und für Gruppe B vier Dateien. Um die Analyse zu beginnen, wählen Sie die geglättete Datei im rechten Fenster aus. Wählen Sie anschließend Datenverarbeitung und Einzelwert-Endpunkte aus dem Dropdown-Menü.

Zur Veranschaulichung wählen Sie die Dauer der Bewegungsunfähigkeit (Freezing). Ein Fenster öffnet sich, in dem Sie das Freezing anhand von Geschwindigkeitsschwelle und Dauerschwelle definieren können, um sich mit dem Programm vertraut zu machen. Probieren Sie weitere Beispiele aus, wie beispielsweise die Verteilung der zurückgelegten Distanz über die Tiefe, mit der man die Anzahl der Tiefenstufen und die Burst-Frequenz bestimmen kann.

Bei Auswahl dieser Option wird die Stapelverarbeitung mit einem Standard-Schwellenwert von etwa 200 Endpunkten in diesem Kontext berechnet. Standard bedeutet, dass Trennwerte festgelegt wurden. Beispielsweise wird die Tiefenverteilung aktuell für drei Tiefenstufen und die Winkelverteilung für vier Abschnitte berechnet.

Nachdem die Parameter generiert wurden, öffnet sich ein neues Fenster, in dem der Speicherort und der Name der zu erstellenden Datei angegeben werden müssen. Diese werden im CSV-Format gespeichert und können in andere Software importiert werden. Abbildung A zeigt hier ein typisches Beispielbild für die Kontrolle.

Zebrafische, während Abbildung B einen typischen Beispielrahmen für Zebrafische zeigt, die mit MK 801 behandelt wurden, beide während einer Morgensitzung aufgezeichnet. Beachten Sie, dass sich die kontrollierten Zebrafische nahe am Boden und dicht beieinander befanden. Im Gegensatz dazu hielten sich die mit MK 801 behandelten Zebrafische nahe der Wasseroberfläche auf und schwammen in beträchtlichem Abstand zueinander.

Hier werden zwei repräsentative Trajektorien für kontrollierte Zebrafische und Zebrafische, die mit 10 Mikromolar MK 801 behandelt wurden, für eine Morgensitzung und eine Nachmittagssitzung dargestellt. In dieser Abbildung sind die durchschnittlichen sozialen Distanzen für die Kontrollgruppe und für Fische, die mit 10 Mikromolar MK 801 behandelt wurden, für beide Sitzungen aufgeführt, und hier werden die Zeitverläufe der durchschnittlichen interindividuellen Distanzen für beide Gruppen gezeigt.

Hier in Abbildung A sehen wir die Verteilung der Zebrabärte über 10 gleich große Tiefenstufen für die Morgensitzung und in B die Verteilung für die Nachmittagssitzung. Die zeitliche Verteilung über die vier radialen Zonen der Versuchsgruppen ist hier dargestellt. Der Ausschnitt zeigt die Lage dieser Zonen von der Mitte bis zum Rand, und hier sehen wir die zeitliche Verteilung über die vier Quadranten der Versuchsgruppen.

Die Einlage zeigt die Position der Quadranten. Doppelte Linien stellen weiße Wände dar, einfache Linien stellen transparente Wände dar. Die Kamera befindet sich links neben der Einlage IE, am nächsten zu den Quadranten eins und vier.

Schwarze Sternchen kennzeichnen den Vergleich zwischen den Gruppen aus der Morgensitzung und graue Sternchen die aus der Nachmittagssitzung. Schließlich werden hier die X-, Y- und Z-Komponenten der zurückgelegten Distanz der Zebrafische während der Morgen- und Nachmittagssitzungen dargestellt. Mittelwert und Standardfehler des Mittelwerts sind angegeben.

Wenn Sie mit dem System arbeiten, bedenken Sie, dass die Daten nur so gut sind wie die Aufnahme. Stellen Sie daher sicher, dass das System gut kalibriert ist und die Kameraeinstellungen optimal eingestellt sind. Der Rest ist einfach und erfordert lediglich, dass Sie sich mit den verschiedenen Schritten vertraut machen.