Name: Mit einem automatisierten 3D-Tracking-System werden Individuen und Schwärme von erwachsenen Zebrafischen erfasst (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-05T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 3 s
Description: Entdecken Sie ein automatisiertes 3D-Tracking-System zur Analyse von Bewegungsmustern und sozialem Verhalten bei erwachsenen Zebrafischen. Diese Methode korrigiert Lichtbrechung und erfasst kinematische Parameter präzise.

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Die Autoren haben keine Danksagungen.

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Hans Maaswinkel, Liqun Zhu und Wei Weng sind Mitarbeiter von xyZfish, Ronkonkoma NY, die das in diesem Artikel verwendete Tracking-System herstellen.

Das hier gezeigte experimentelle Verfahren ermöglicht die Erfassung von einzelnen Zebrafischen, Zebrafischpaaren (z.B. zur Untersuchung von Paarungen oder Aggressionen) und Zebrafischschwärmen (wie im repräsentativen Beispiel gezeigt). Das System eignet sich besonders zur gleichzeitigen Gewinnung von Informationen über die 3D-Verteilung (vertikal und horizontal), kinematische Eigenschaften (z.B. Geschwindigkeit, Beschleunigung, Drehwinkel) und soziale Parameter (z.B. sozialer Zusammenhalt). Im Folgenden listen wir einige wichtige Punkte auf, die bei der Planung von Experimenten zu beachten sind.
Je nach experimentellem Vorgehen können unterschiedliche Verhaltenssysteme untersucht werden. Um zum Beispiel Neophobie (d.h. Angst vor neuen Umgebungen) zu erforschen, sollte die Aufnahme sofort nach dem Einführen des Zebrafisches in das Beobachtungsbecken gestartet werden (nachdem man nur ein paar Sekunden gewartet hat, bis sich das Wasser beruhigt hat, um den Lärm zu verringern), ohne vorherige Gewöhnung11,17,37. Auf der anderen Seite könnten einige Forschungsthemen eine gute Gewöhnung des Zebrafisches erfordern, z. B. bei der Untersuchung der Wirkung von Alarmpheromonen16. Bei der Untersuchung von Gruppen von Zebrafischen sollte sich der Experimentator darüber im Klaren sein, dass die Software zwar das Umschalten der Tags minimiert, es aber derzeit nicht möglich ist, einzelne Zebrafische vollständig zu verfolgen. Dies ist auch nicht wichtig für Schwarmstudien, bei denen der Schwerpunkt auf dem sozialen Zusammenhalt liegt, wäre aber entscheidend für die Erforschung von Aggression oder Paarung. Die manuelle Neuzuweisung von Tags ist eine Option, kann aber sehr zeitaufwändig sein.
Die Farbe der Wände des Beobachtungsbehälters und der Beobachtungskammer kann einen großen Einfluss auf das Verhalten des Zebrafisches haben. Zum Beispiel wurde beschrieben, dass weiße Wände Aversionsreaktionen hervorrufen36, 37. Wenn Sie verschiedene Farben ausprobieren, sollten Sie zwei Dinge beachten: 1) Es ist wichtig, dass die Vorderwand (d.h. die Wand, die der Kamera am nächsten ist) transparent bleibt und dass ein Deckel (falls einer verwendet wird) ebenfalls transparent sein muss; 2) Wenn Sie eine noch nie verwendete Farbe auswählen, ermitteln Sie zunächst, ob der Kontrast zwischen Zebrafisch und Hintergrund für die Aufnahme geeignet ist. Führen Sie einen Testlauf durch. Das Ändern der Kameraeinstellungen für die Aufnahme (Verstärkung, Verschluss, Rot und Blau, wie in den Schritten 2.5 und 2.6 beschrieben) und der Einstellungen für die Trajektorienrekonstruktion (z. B. Farb- und Größenschwellenwerte, wie in den Schritten 3.3, 3.5, 3.11 und 3.12 beschrieben) kann einen großen Unterschied machen. Auch hier wird die Erfahrung mit dem System einen großen Einfluss darauf haben, was möglich ist.
Je nach Zweck des Experiments kann eine Lichtquelle mit unterschiedlichen Eigenschaften (z.B. Spektrum, Intensität) wünschenswert sein. Die LED-Leisten können einfach ausgetauscht werden. Stellen Sie sicher, dass das Licht jeden Teil des Behälters erreicht.
Wenn das Experiment erfordert, dass der Zebrafisch mehrere Stunden im Beobachtungsbehälter verbleibt, stellen Sie sicher, dass er belüftet wird. Ein Luftschlauch kann mit einem Clip an der hinteren rechten Ecke befestigt werden. Überprüfen Sie auf dem Computerbildschirm, ob der Clip die Aufnahme nicht beeinträchtigt, d.h. dass der Zebrafisch zu keiner Zeit dem Blick verborgen bleibt. In den Abbildungen 2A und 2B ist der schwarze Clip in der Draufsicht zu sehen. Idealerweise sollte die Belüftung vor oder zwischen den Aufnahmen erfolgen, aber nicht während der Aufnahme, um Lärm zu vermeiden. Beachten Sie auch, dass das Ein- oder Ausschalten der starken Belüftung den Zebrafisch erschrecken kann.
Wenn das Experiment erfordert, dass der Zebrafisch über Nacht im Behälter gehalten wird, ist es sinnvoll, die Beobachtungskammer mit einem durchsichtigen Deckel abzudecken, um zu verhindern, dass der Zebrafisch herausspringt (was sehr häufig vorkommt). Wenn die Abdeckung vor der Aufnahme nicht entfernt wird (um den Zebrafisch nicht zu stören), beachten Sie die folgenden zwei Punkte: 1) Stellen Sie sicher, dass die Spiegelbilder der Lichtquellen die Aufnahme nicht behindern (z. B. durch Verschieben der Lichtquellen oder durch Wahl eines Deckels, der das Licht nur minimal reflektiert); 2) Beachten Sie, dass der Deckel bei Verwendung über Nacht beschlagen werden kann, zumal in diesem Fall auch für eine Belüftung gesorgt werden muss; Eine Möglichkeit, dies zu reduzieren, besteht darin, einen Deckel mit kleinen Löchern zu wählen.
Für einige Experimente kann es wichtig sein, das Ausgangsverhalten des Zebrafisches zu bestimmen, bevor ein Medikament verabreicht wird. In diesem Fall kann das Medikament zwischen den Sitzungen über einen Schlauch hinzugefügt werden (ähnlich wie der oben besprochene Belüftungsschlauch).
Obwohl hier der Fokus auf der Erfassung von Zebrafischen (Danio rerio) lag, können natürlich auch andere Fischarten mit dem System erfasst werden. Es wurde verwendet, um das Verhalten von (juvenilen) Goldfischen (Carassius auratus), Tigerbarben (Barbus tetrazona) und Grünen Schwertträgern (Xiphophorus helleri) zu untersuchen.
Abschließend sei noch angemerkt, dass andere Abmessungen der Beobachtungsbecken prinzipiell möglich sind. Dies würde jedoch eine Neukonfiguration des Systems und eine gute Balance zwischen räumlicher und zeitlicher Auflösung erfordern, wenn viel größere Beobachtungscontainer verwendet werden. Darüber hinaus muss die Form des Behälters quaderförmig sein. Die Anzahl der Zebrafische oder anderer Versuchspersonen ist theoretisch unbegrenzt; Das Tag-Swapping nimmt jedoch mit der Anzahl der Motive zu.

Zebrafisch ist zu einem wichtigen Modell für die biologische und pharmakologische Forschunggeworden 1-3. Die Verfolgung von Bewegungs- und räumlichen Verteilungsmustern einzelner Zebrafische und von Zebrafischschwärmen ist von unschätzbarem Wert. Ältere Studien wenden eine manuelle Quantifizierung auf der Grundlage von aufgezeichneten Bildernan 4. Heute werden häufig automatische 2D-Video-Tracking-Systeme verwendet5. Da sich Zebrafische und viele andere Wasser- und Nichtwassertiere jedoch in einem dreidimensionalen Raum bewegen, wächst das Interesse an 3D-Systemen6. Das beschriebene 3D-System wurde erstmals im Jahr 2007veröffentlicht 7. Technische Details und Vergleiche mit anderen Systemen finden Sie unter8. Der grundlegende Vorteil dieses Systems im Vergleich zu anderen Systemen besteht darin, dass es zwei (optional drei) synchrone und unabhängige Ansichten mit Hilfe eines Spiegelungssystems erhält und ein zweistufiges Kalibrierungsprotokoll verwendet. Im ersten Schritt wird die 3D-Geometrie des Stereosystems (bestehend aus der Kamera und den Spiegeln) kalibriert. Im zweiten Schritt werden die durch die Lichtbrechung verursachten nichtlinearen Fehler korrigiert. Bei der Untersuchung von Wassertieren können die Auswirkungen der Lichtbrechung beträchtlich sein, wenn sie nicht korrigiert werden. Andere bisher veröffentlichte Systeme (auch neuere Entwicklungen9) verzichten auf das zweistufige Kalibrierverfahren. Für technische Details zur Objektidentifikation, Okklusion mit Multi-Objekt-Tracking, Jigging-Noise etc. Der Leser wird auf die Originalpublikationenverwiesen 8,9. Das System wurde für die Untersuchung von angstähnlichen Verhaltensreaktionen10,11, Schwarmreaktionen8,11,12 und in einer Vorstudie für antagonistisches Verhalten bei Zebrafischen13 validiert. Es wurde auch auf andere Fischarten (Goldfisch8, Schwertträger, Tigerbarbe) und auf Mäuse9 getestet.
Im Folgenden werden die Protokolle zur Kalibrierung und zur Verwendung des Systems beschrieben und die Ergebnisse eines Experiments, das die Auswirkungen des NMDA-Rezeptor-nichtkompetitiven Antagonisten MK-801 auf schwärmende Zebrafische testete, als repräsentatives Beispiel vorgestellt, um die Art von Daten zu demonstrieren, die mit dem System gewonnen werden können.
Sowohl in der natürlichen Umgebung als auch in Aquarien schwimmt der Zebrafisch normalerweise in Schwärmen14. Die Präferenzen für das Schwärmen scheinen von mehreren Faktoren abzuhängen, wie z. B. Aufzucht, Geschlecht und Nahrungsverfügbarkeit14,15. Interessanterweise wird der Abstand zwischen einzelnen Zebrafischen in einem Schwarm kleiner, wenn Signale für eine potenzielle Gefahr vorhanden sind, wie z. B. Alarmpheromone16 oder Neuheit11. Das Shoaling-Paradigma wird daher auch zur Erprobung von Anxiolytika herangezogen17. Dominanzhierarchien18 und soziales Lernen19 sind faszinierende Aspekte des Verhaltens von Zebrafischen. Aufgrund seines hoch entwickelten sozialverhaltensbezogenen Charakters sind Zebrafische auch für die Autismusforschung interessant geworden20,21.
Es wurde berichtet, dass MK-801 das Sozialverhalten bei Zebrafischenverändert 5,22,23, was an seine Auswirkungen auf Säugetiere erinnert24. MK-801 hat aber auch viele andere Auswirkungen auf andere Verhaltensweisen (wie z.B. Schwimmverhalten, inhibitorische Vermeidung und Ortspräferenz25-27). Daher ist es entscheidend, in ersten Experimenten so viele Informationen wie möglich aus grundlegenden Beobachtungen zu gewinnen. Dies wird die Grundlage für die Gestaltung gezielterer Experimente bilden.
Übersicht über das Aufnahmegerät und die Software
In seiner aktuellen Konfiguration befindet sich der Beobachtungsbehälter (25 cm x 25 cm x 18 cm, L x B x H), in dem sich der Zebrafisch befindet, in der Beobachtungskammer (91 cm x 46 cm x 56 cm, L x B x H). In der Kammer befinden sich außerdem eine Kamera, ein Spiegel, der in einem Winkel von ca. >45° über dem Behälter aufgehängt ist, und LED-Lichtleisten. Abbildung 1 zeigt ein vereinfachtes Diagramm. Die Kamera zeichnet sowohl die Vorderansicht als auch die Draufsicht (Spiegel) auf, um die 3D-Flugbahnen des Zebrafisches zu konstruieren, indem sie seine x-, y- und z-Koordinaten bestimmt. Zur Orientierung werden die Koordinatenvektoren in der linken vorderen Ecke des Beobachtungscontainers (Position relativ zur Kamera) dargestellt, was den Vektoren entspricht, die in den 3D-Ansichten (z. B. Abbildung 15) dargestellt werden, die vom Path Reconstruction Module generiert wurden (siehe weiter unten). Die Abtastrate hängt von der Kamera und dem Computer ab. In unseren Experimenten liegt sie bei etwa 40 Bildern/sec (fps). Die räumliche Auflösung der aufgenommenen Bilder beträgt 640 x 480 Pixel (diese Konfiguration wurde gewählt, um ein optimales Gleichgewicht zwischen räumlicher und zeitlicher Auflösung zu gewährleisten). Windows XP oder höher ist erforderlich.
Vor der ersten Aufnahme muss das System kalibriert werden, um die Positionen der Wände des Behälters und der Wasseroberfläche zu bestimmen, um den Skalierungsfaktor der aufgenommenen Bilder zu bestimmen und um den beträchtlichen Fehler zu berücksichtigen, der durch die Brechung des Lichts beim Übergang vom Wasser in die Luft erzeugt wird. Grundsätzlich muss die Kalibrierung nur bei der Erstinstallation und nach dem Verschieben oder Austausch von Teilen des Setups, wie Kamera oder Spiegel, durchgeführt werden. Dennoch empfiehlt es sich, von Zeit zu Zeit zu überprüfen, ob die Kalibrierung noch korrekt ist, und gegebenenfalls neu zu kalibrieren.
Die Software besteht aus drei Modulen. Das Aufzeichnungsmodul zeichnet die Frames auf (zwei Beispiel-Frames sind in Abbildung 2 dargestellt). Das Trajectory Module rekonstruiert die Pfade für jeden Zebrafisch. Das Data Processing Module berechnet eine Reihe von kinematischen und räumlichen Standardparametern. Zum Zwecke der weiteren Analyse können die Daten in Tabellenkalkulationen oder Statistiksoftware importiert werden.

<table><tbody><tr><td>AABT-3D Tracking Hardware</td><td>xyZfish</td><td>AABT II</td><td>Inklusive Kamera, Grafikkarte, Beobachtungsfach mit Spiegel und Beleuchtung</td></tr><tr><td>AABT-3D Kalibriergerät</td><td>xyZfish</td><td>Kaliber</td><td>Enthält Kalibriertafel und Seitenspiegel</td></tr><tr><td>AABT-3D Beobachtungsbehälter</td><td>xyZfish</td><td>Würfel</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>AABT-3D-Tracking-Software</td><td>xyZfish</td><td>v.1.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Computer</td><td>optional</td><td>N/A</td><td>Windows XP oder höher</td></tr><tr><td>(+)-MK-801 Wasserstoffmaleat</td><td>Sigma</td><td>M107</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Luftpumpe</td><td>Fusion</td><td>500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Luftschlauch 3/16"</td><td>Lee' s Aquarien- und Heimtierprodukte</td><td>14508</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mittlere Bindeklammern</td><td>OfficeDepot</td><td>561339</td><td>Zur Befestigung der Fluggesellschaft an einem Beobachtungsbehälter</td></tr></tbody></table>

mit einem automatisierten 3d-tracking-system werden individuen und schwärme von erwachsenen zebrafischen erfasst

Using an Automated 3D-tracking System to Record Individual and Shoals of Adult Zebrafish

Wie viele Wassertiere bewegt sich auch der Zebrafisch (Danio rerio) in einem 3D-Raum. Es ist daher vorzuziehen, ein 3D-Aufzeichnungssystem zu verwenden, um sein Verhalten zu untersuchen. Das vorgestellte automatische Video-Tracking-System erreicht dies durch die Verwendung eines Spiegelsystems und eines Kalibrierungsverfahrens, das den erheblichen Fehler korrigiert, der durch den Übergang von Licht vom Wasser in die Luft entsteht. Mit diesem System ist es möglich, sowohl einzelne als auch Gruppen von erwachsenen Zebrafischen zu erfassen. Vor dem Einsatz muss das System kalibriert werden. Das System besteht aus drei Modulen: Aufzeichnung, Pfadrekonstruktion und Datenverarbeitung. Es werden die Schritt-für-Schritt-Protokolle für die Kalibrierung und die Verwendung der drei Module vorgestellt. Je nach Versuchsaufbau kann das System zur Testung von Neophobie, weißer Abneigung, sozialem Zusammenhalt, motorischen Beeinträchtigungen, Erkundung neuartiger Objekte usw. verwendet werden. Es ist besonders vielversprechend als erstes Werkzeug, um die Auswirkungen von Medikamenten oder Mutationen auf grundlegende Verhaltensmuster zu untersuchen. Das System liefert Informationen über die vertikale und horizontale Verteilung des Zebrafisches, über die xyz-Komponenten kinematischer Parameter (wie Fortbewegung, Geschwindigkeit, Beschleunigung und Drehwinkel) und liefert die Daten, die zur Berechnung von Parametern für den sozialen Zusammenhalt bei der Prüfung von Schwärmen erforderlich sind.

Die Verwendung eines automatischen 3D-Videosystems, das einzelne und Gruppen von Zebrafischen verfolgen kann, wird beschrieben. Als Anwendungsbeispiel untersuchen wir die Auswirkungen des NMDA-Rezeptor-Antagonisten MK-801 auf Zebrafischschwärme.

Mit einem automatisierten 3D-Tracking-System werden Individuen und Schwärme von erwachsenen Zebrafischen erfasst

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die dreidimensionalen Bewegungsmuster von Zebrabärblingen oder anderen aquatischen Tieren zu untersuchen und deren kinematischen, räumlichen und sozialen Eigenschaften zu analysieren. Dies ermöglicht die Erkennung veränderter Verhaltensweisen, die durch genetische Mutationen oder chemische und umweltbedingte Faktoren hervorgerufen werden. Dies wird erreicht, indem zunächst das System kalibriert wird, wodurch gleichzeitig die erhebliche Bildverzerrung korrigiert wird, die durch Brechung verursacht wird.Der zweite Schritt besteht darin, Videobilder mit relativ hoher zeitlicher Auflösung gleichzeitig aus mindestens zwei verschiedenen Blickwinkeln aufzuzeichnen. Anschließend rekonstruiert die Software die Trajektorien der Fische. Es werden fortschrittliche Algorithmen angewandt, um den Einfluss von Rauschen zu verringern und die Position eines Fisches während Verdeckung oder Gruppierung zu bestimmen.Der letzte Schritt besteht darin, die Daten zu analysieren und eine statistische Auswertung für Geschwindigkeit, Beschleunigung, Drehwinkel, horizontale und vertikale Verteilung im Beobachtungsbehälter, interindividuelle Abstände und andere Parameter von Interesse durchzuführen. Letztendlich eignet sich das hochauflösende kalibrierte 3D-Tracking zur Untersuchung verhaltensbedingter Defizite bei mutierten Zebrafischen und der Wirkung von Wirkstoffen auf eine Vielzahl verhaltensrelevanter Systeme. Für die Wirkstoffforschung bietet das System den Vorteil, dass es die Untersuchung des Fischverhaltens in 3D ermöglicht.Das ist wichtig, weil Fische sich natürlich in allen drei Dimensionen bewegen und bei gleichzeitiger Aufnahme mehrerer Fische eine 2D-Aufnahme irreführend sein kann, wenn die räumlichen Konfigurationen der Gruppe untersucht werden. Ein weiterer Vorteil des Systems besteht darin, dass es Lichtbrechung korrigiert, die, wenn sie nicht korrigiert wird, zu erheblichen Messfehlern führen kann. In der derzeitigen Konfiguration befindet sich der Beobachtungsbehälter mit den Zebrafischen in der Beobachtungskammer.Die Kammer enthält außerdem eine Kamera, einen Spiegel, der in einem Winkel von etwa 45 Grad über dem Behälter angebracht ist, sowie LED-Lichtleisten. Vor der Aufnahme muss das System kalibriert werden, um die Position der Behälterwände und der Wasseroberfläche sowie den Maßstabsfaktor der aufgezeichneten Einzelbilder zu bestimmen, und um den durch die Lichtbrechung beim Übergang von Wasser zu Luft verursachten Fehler zu korrigieren. Nach Abschluss der Kalibrierung sollte ein Testlauf mit einem Dummy-Fisch durchgeführt werden.Die Neukalibrierung sollte durchgeführt werden, wenn die Positionen des Spiegels oder der Kamera nicht stimmen oder wenn Probleme mit der Verfolgung auftreten. Um eine Aufnahmesitzung zu beginnen, stellen Sie den Beobachtungsbehälter, der bis zu den Markierungen mit Wasser gefüllt ist, in die Beobachtungskammer. Die Füße des Behälters sollten in die Ausrichtungslöcher eingesetzt werden.Richten Sie die Behälter so aus, dass die halbtransparenten oder undurchsichtigen Wände von der Kamera aus gesehen zur Rückseite und zur rechten Seite zeigen. Schalten Sie anschließend die Beleuchtung im Fach ein, geben Sie die Fische in den Behälter und schließen Sie die Vorhänge. Öffnen Sie das Aufnahmemodul, und das Bild der Vorder- und Draufsicht des Behälters erscheint auf dem Bildschirm.Anfangs ist das aufgenommene Bild möglicherweise nicht ideal und muss daher möglicherweise etwas angepasst werden, um einen ausreichenden Kontrast zwischen dem Fisch und dem Hintergrund zu erzielen. Um das Bild anzupassen, wählen Sie die Kamerasteuerung aus und deaktivieren Sie dann im sich öffnenden Fenster mit den allgemeinen Einstellungen die hier gezeigten Felder. Stellen Sie anschließend Verschlusszeit und Verstärkung so ein, dass das Bild nicht überbelichtet ist. Wählen Sie danach auf der linken Seite des Kamerasteuerungsfensters die Weißabgleichfarbe aus und deaktivieren Sie im neuen Fenster das Feld „Auto“. Passen Sie anschließend die Rot- und Blauwerte so an, dass sowohl in der Vorder- als auch in der Draufsicht der beste Farbkontrast erreicht wird.Nach Abschluss der Einstellungen sind möglicherweise mehrere Anpassungen erforderlich. Wählen Sie im Hauptmenü des Aufnahmemoduls den Datenspeicherort aus, um einen Ordner zu erstellen oder auszuwählen. Jede Aufnahme sollte einen eigenen Ordner haben, der ein Unterordner des Experimentordners sein sollte.Drücken Sie nun auf „Aufnahme starten“ und geben Sie eine ganze Zahl für die Dauer der Aufnahme in Minuten ein, dann bestätigen Sie mit „OK“ und die experimentelle Aufnahmesitzung beginnt. Sobald die Aufnahmen abgeschlossen sind, kopieren und fügen Sie die Datenordner des Tierbehälters und der Korrespondenzdaten aus dem Kalibrierungsordner in die zuvor erstellten Ordner während der Aufnahme. Um die Pfadrekonstruktion zu starten, öffnen Sie das Trajektorienmodul der Software. Drücken Sie dann auf „Datenort“, um den mit dem Aufnahmemodul erstellten Ordner auszuwählen.Drücken Sie als Nächstes zuerst die System-Setup-Taste, um das Parameterfenster zu öffnen, und stellen Sie die Farbschwellen für die obere und untere Ansicht ein. Ein guter Startwert ist 1000. Wählen Sie danach die Größenschwellen für die obere und untere Ansicht aus.Eine gute Ausgangsgröße für einen mittelgroßen Zebrafisch beträgt 10, verwenden Sie 20 für einen großen Fisch und 5 für einen kleinen Fisch. Je höher diese Schwellenwerte sind, desto unwahrscheinlicher ist es, dass die Software Rauschen erfasst. Bei zu hohen Werten könnte sie jedoch möglicherweise den Fisch nicht mehr erkennen.Es kann notwendig werden, diese Schwellenwerte im weiteren Verlauf des Experiments erneut anzupassen. Für die obere Größenschwelle ist ein Wert von 3000 gewöhnlich ausreichend. Für die spezifische Länge behalten Sie den voreingestellten Wert von 220 bei.Die Anzahl der Fische bezieht sich auf die Zahl der Fische im Beobachtungsbecken. Die maximale Anzahl an Punkten bezieht sich auf die Gesamtanzahl der Einzelbilder; notieren Sie sich diese Zahl und klicken Sie auf „Okay“. Wählen Sie anschließend „Hintergrund aufnehmen“.Im nächsten Fenster werden Sie aufgefordert, die Felder „von“ und „bis“ auszufüllen. Nachdem der Hintergrund geladen wurde, passen Sie die drei roten Boxen mithilfe der Maus an; diese markieren die Bereiche, in denen die Software nach den Fischen sucht. Verkleinern Sie die Box auf der linken Seite.Da die Seitenansicht nur zur Kalibrierung verwendet wird, drücken Sie nun die Schaltfläche „Trajektorien generieren starten“, und die Pfadrekonstruktion beginnt. Im Idealfall sollte das Tag auf dem Bild des Fisches platziert werden; falls es häufig falsch platziert wird, öffnen Sie das Informationsfenster. Hier sehen wir einen idealen Fall, bei dem nur die Umrisse des Fisches sichtbar sind.Im Falle von übermäßigem Rauschen drücken Sie im Hauptmenü auf „Stop“ und wählen Sie neue Farb- und Größenschwellenwerte. Prüfen Sie außerdem, ob die roten Rahmen leicht verkleinert werden können. Zum Beispiel oben, um das durch Wasserbewegungen verursachte Rauschen auszuschließen; beobachten Sie hierzu die Bahn auf dem 3D-Bildschirm.Durch einen Rechtsklick mit der Maus kann der Forscher zwischen Rotation und Translation der 3D-Konfiguration wählen. Um mit der Datenverarbeitung zu beginnen, öffnen Sie das Datenverarbeitungsmodul, wählen Sie Projekt in der Symbolleiste aus und anschließend im Dropdown-Menü Neu aus, und geben Sie einen Experimentnamen ein. Danach wählen Sie Projekt bearbeiten aus. Danach zum Projekt hinzufügen, gefolgt von einer neuen Gruppe, und einen Namen für die Versuchsgruppe eingeben. Wählen Sie nun die Versuchsgruppe im rechten Fenster aus. Beachten Sie, dass sich die Symbolleiste ändert.Wählen Sie „Gruppe bearbeiten“, dann „Zur Gruppe hinzufügen“ und anschließend „Neue Messungen“. Dadurch wird ein Browserfenster geöffnet. Öffnen Sie danach den während der Aufnahme erstellten Ordner und wählen Sie den Unterordner „Trajektorien“ sowie anschließend die geglättete Punktedatei aus.Im hier dargestellten Beispiel für Gruppe A wurden sechs Dateien geladen und für Gruppe B vier Dateien. Um die Analyse zu beginnen, wählen Sie die geglättete Datei im rechten Fenster aus. Wählen Sie anschließend Datenverarbeitung und Einzelwert-Endpunkte aus dem Dropdown-Menü.Zur Veranschaulichung wählen Sie die Dauer der Bewegungsunfähigkeit (Freezing). Ein Fenster öffnet sich, in dem Sie das Freezing anhand von Geschwindigkeitsschwelle und Dauerschwelle definieren können, um sich mit dem Programm vertraut zu machen. Probieren Sie weitere Beispiele aus, wie beispielsweise die Verteilung der zurückgelegten Distanz über die Tiefe, mit der man die Anzahl der Tiefenstufen und die Burst-Frequenz bestimmen kann.Bei Auswahl dieser Option wird die Stapelverarbeitung mit einem Standard-Schwellenwert von etwa 200 Endpunkten in diesem Kontext berechnet. Standard bedeutet, dass Trennwerte festgelegt wurden. Beispielsweise wird die Tiefenverteilung aktuell für drei Tiefenstufen und die Winkelverteilung für vier Abschnitte berechnet.Nachdem die Parameter generiert wurden, öffnet sich ein neues Fenster, in dem der Speicherort und der Name der zu erstellenden Datei angegeben werden müssen. Diese werden im CSV-Format gespeichert und können in andere Software importiert werden. Abbildung A zeigt hier ein typisches Beispielbild für die Kontrolle.Zebrafische, während Abbildung B einen typischen Beispielrahmen für Zebrafische zeigt, die mit MK 801 behandelt wurden, beide während einer Morgensitzung aufgezeichnet. Beachten Sie, dass sich die kontrollierten Zebrafische nahe am Boden und dicht beieinander befanden. Im Gegensatz dazu hielten sich die mit MK 801 behandelten Zebrafische nahe der Wasseroberfläche auf und schwammen in beträchtlichem Abstand zueinander.Hier werden zwei repräsentative Trajektorien für kontrollierte Zebrafische und Zebrafische, die mit 10 Mikromolar MK 801 behandelt wurden, für eine Morgensitzung und eine Nachmittagssitzung dargestellt. In dieser Abbildung sind die durchschnittlichen sozialen Distanzen für die Kontrollgruppe und für Fische, die mit 10 Mikromolar MK 801 behandelt wurden, für beide Sitzungen aufgeführt, und hier werden die Zeitverläufe der durchschnittlichen interindividuellen Distanzen für beide Gruppen gezeigt.Hier in Abbildung A sehen wir die Verteilung der Zebrabärte über 10 gleich große Tiefenstufen für die Morgensitzung und in B die Verteilung für die Nachmittagssitzung. Die zeitliche Verteilung über die vier radialen Zonen der Versuchsgruppen ist hier dargestellt. Der Ausschnitt zeigt die Lage dieser Zonen von der Mitte bis zum Rand, und hier sehen wir die zeitliche Verteilung über die vier Quadranten der Versuchsgruppen.Die Einlage zeigt die Position der Quadranten. Doppelte Linien stellen weiße Wände dar, einfache Linien stellen transparente Wände dar. Die Kamera befindet sich links neben der Einlage IE, am nächsten zu den Quadranten eins und vier.Schwarze Sternchen kennzeichnen den Vergleich zwischen den Gruppen aus der Morgensitzung und graue Sternchen die aus der Nachmittagssitzung. Schließlich werden hier die X-, Y- und Z-Komponenten der zurückgelegten Distanz der Zebrafische während der Morgen- und Nachmittagssitzungen dargestellt. Mittelwert und Standardfehler des Mittelwerts sind angegeben.Wenn Sie mit dem System arbeiten, bedenken Sie, dass die Daten nur so gut sind wie die Aufnahme. Stellen Sie daher sicher, dass das System gut kalibriert ist und die Kameraeinstellungen optimal eingestellt sind. Der Rest ist einfach und erfordert lediglich, dass Sie sich mit den verschiedenen Schritten vertraut machen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Das Video beschreibt die Vermeidung und den Thigmotaxis-Assay von Zebrafischlarven. Das Video untersucht das Verhalten von Zebrafischlarven als Reaktion auf visuelle aversive Reize.

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