Rapid-Protokoll für die Herstellung von Elektrokompetente Escherichia coli Und Vibrio cholerae

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, kompetente Bakterien schnell und bequem noch am selben Tag zu erzeugen. Sie werden für die Transformation benötigt. Dazu werden die Bakterien zunächst auf LB-Agar plattiert und vier bis sechs Stunden lang inkubiert.

Als nächstes wird der Bakterienrasen vorsichtig von der Oberfläche des Agars geerntet und das Pellet in sterilem kaltem Wasser oder Puffer resuspendiert. Dann wird das Bakterienpellet dreimal bei vier Grad Celsius gewaschen und in 40 Mikrolitern wieder suspendiert. Schließlich werden die zuständigen Zellen in Gegenwart von DNA elektroporiert.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die ein Ausmaß der bakteriellen Transformation aufweisen, das mit dem der traditionellen Methode vergleichbar ist, die beträchtliche Geräte, große Mengen an Bakterienkulturen und sterile Puffer erfordert. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass frische, kompetente Bakterien praktisch am selben Tag, an dem die Umwandlung geplant ist, aus jedem Laborstamm hergestellt werden können, ohne dass große Zentrifugen, Rotoren oder Leiter von sterilen Puffern und Kulturen erforderlich sind. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, keine großen Schwierigkeiten haben, da dies nur eine Abkürzung der Techniken ist, die üblicherweise in bakteriologischen Laboratorien eingesetzt werden. Der Urheber dieses Protokolls kann nicht identifiziert werden, da es im Laufe der Zeit von zahlreichen Forschern verwendet und optimiert wurde.

Die hier vorgestellte Methode wird seit fast zwei Jahrzehnten in unseren Labors eingesetzt, und es ist unser Ziel, dieses nützliche Protokoll mit unseren Kollegen zu teilen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist für einen Schritt wichtig. Insbesondere das Sammeln von Bakterien aus dem Rasen auf der Schnecke, denn es braucht ein erfahrenes Auge, um das Wachstum auf der Platte zu beurteilen.

Und das lässt sich am besten visualisieren. Das Verfahren wird von Theresa Brooks, einer Forschungsassistentin aus dem Labor von Dr. Te Koski an der University of Alberta in Edmonton, Kanada, demonstriert. Um am späten Nachmittag mit der Vorbereitung der Bakterienkultur zu beginnen, verwenden Sie eine kleine Menge E. coli oder V-Coray, um ein bis fünf Milliliter LB-Bouillon im Autoklaven in sterilen Bo-Silikatglas-Reagenzgläsern zu impfen.

Legen Sie die inokulierten Reagenzgläser in eine Rolltrommel und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius und hoher Geschwindigkeit. Bereiten Sie aus einem Glasstab einen Zellverteiler in Form eines Hockeyschlägers vor, indem Sie die Mitte des Stabes in der Flamme eines Bunsenbrenners erhitzen, bis das Glas weich wird. Richten Sie dann mit einer Pinzette oder Zange die Biegung vorsichtig in einen 135-Grad-Winkel.

Erhitzen Sie den Stab noch einmal in der Mitte zwischen dem Ende und der ersten Biegung und biegen Sie ihn in einem 45 Grad Winkel nach innen. Bereiten Sie lb belüftete mit und ohne Antibiotika vor und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Am nächsten Morgen.

100 Mikroliter Übernachtkultur auf jede LB-Agarplatte auffüllen. Inkubieren Sie die Platte mit dem Zellverteiler bei 37 Grad Celsius für vier bis sechs Stunden oder bis ein dünner Rasen mit Bakterienwachstum sichtbar wird. Mit einer Impfschlaufe wird eine Bakterienmasse mit einem Durchmesser von etwa zwei Millimetern von der Platte entnommen und in einem Milliliter eiskalter Nahrung aufgehängt.

Zwei Millimolare Calciumchloride. Bei Verwendung von v-coray oder sterilem, doppelt destilliertem Wasser für E. coli unter Verwendung einer gekühlten Zentrifuge bei vier Grad Celsius die Suspension fünf Minuten lang bei 5.000 g schleudern. Nachdem Sie den letzten Überstand entfernt haben, suspendieren Sie das Pellet in 40 Mikrolitern Calciumchlorid oder doppelt destilliertem Wasser und bewahren Sie es auf Eis auf.

Um eine Umwandlung durchzuführen, fügen Sie der 40-Mikroliter-Bakteriensuspension bis zu einem Mikrogramm Plasma-DNA hinzu und überführen Sie die Mischung in einen vorgekühlten, sterilen Spalt von 0,2 Zentimetern. Vete, setzen Sie das Vete in die Elektroporationskammer des Impulssteuergeräts ein und essen Sie bei 1,8 Kilovolt und 25 Mikrophs. Die Zeitkonstante sollte etwa 5,0 Millisekunden betragen und es sollte kein Lichtbogen auftreten.

Die Zellen schnell in einem Milliliter LB-Brühe resuspendieren und in ein zuvor im Autoklaven gehaltenes Reagenzglas aus Brannglas überführen. Lassen Sie die Zellen sich erholen, indem Sie unter belüfteten Wachstumsbedingungen bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten ohne Antibiotikaauswahl inkubieren. Die Bakterien mit Antibiotikum auf LB-Ager-Platten auflegen und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Wie hier gezeigt, haben wir eine Reihe von Transformationen mit e coli und V co array durchgeführt, um die Transformationseffizienz unserer schnellen Methodik mit einer Adaption der traditionellen Methode zu vergleichen, die ursprünglich von Doer et al. für die Herstellung elektrokompetenter Bakterien beschrieben wurde. Die Transformantenausbeute lag innerhalb von 10 der sechsten bis 10 der siebten KBE pro Mikrogramm DNA-Bereich in drei Replikationsexperimenten für e coli und v coray. Mit der traditionellen Methode für Elektrokompetenz.

Bei der Zellvorbereitung schien die Transformantenausbeute in drei Replikationsexperimenten für e coli und v coray mit der Schnellmethode auf 10, auf das fünfte und auf 10 bis zum sechsten KBE pro Mikrogramm DNA zu verzehnfachen. Aus diesem Grund haben wir den Prozentsatz der transformierten Bakterien bestimmt, indem wir die transformierten KBE durch die Anzahl der KBE dividierten, die aus Scheintransformationen aus ansonsten identischen Chargen kompetenter Zellen gewonnen wurden. Der Prozentsatz der transformierten Bakterien lag innerhalb eines Logarithmus.

Unabhängig von der Zubereitungsmethode und der umgewandelten Spezies. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Effizienz der Schnellmethode mit der des traditionellen, langwierigeren Verfahrens zur Präparation kompetenter Zellen vergleichbar ist und dass die repräsentativen Stämme von IEO, Coray und Esia coli gleichermaßen für das Schnellverfahren geeignet sind. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von fünf bis sechs Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Bakterien während ihrer logarithmischen Wachstumsphase zu ernten, sie in steriler, frisch zubereiteter und vorgekühlter Pufferwasserlösung zu waschen und kalt zu halten, bis sie nach der Elektroporation wieder in LB suspendiert sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie in Ihrem Labor schnell elektrokompetente Bakterienstamm-spezifische Zellen generieren können, indem Sie sie auf dem ersten Rasen kultivieren, sie während der logarithmischen Wachstumsphase sammeln und dann in kaltem Puffer waschen, um sie für die Elektroporation vorzubereiten.