Name: Rapid-Protokoll für die Herstellung von Elektrokompetente Escherichia coli Und Vibrio cholerae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-08T18:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Lernen Sie ein schnelles Protokoll zur Herstellung elektrokompetenter Escherichia coli und Vibrio cholerae Zellen für die DNA-Transformation. Diese Methode ermöglicht die Zellvorbereitung am selben Tag mit vergleichbarer Effizienz.

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Die Autoren danken den Kollegen und Mitarbeiter von Gegenwart und Vergangenheit Laboratorien, die die Entwicklung dieser Technik unterstützt haben. SP Labor wird von der kanadischen Institut für Gesundheitsforschung unterstützten Betriebskostenzuschuss der MOP-84473 und Alberta Innovates-Health Solutions (von der Alberta Heritage Foundation for Medical Research Stiftungsfonds finanziert). DP wurde von National Institutes of Health gewährt MD001091-01 und GM068855-02.

1. Vorbereitung von Bakterienkulturen, Tools und Reagenzien (TAG 1, Nachmittag) <ol><li> Am späten Nachmittag, impfen 1-5 ml LB-Medium autoklaviert in sterilen (zum Beispiel 100 x 13 mm) Borosilikat-Glasröhrchen mit einem kleinen Aliquot der Bakterien (E. coli oder V. cholerae). </li><li> Stellen Sie die geimpft Reagenzgläser in einem Bandage bei 37 ° C Temperatur (warmen Raum oder Inkubator) untergebracht ist, schalten Sie die Bandage mit hoher Geschwindigkeit, und Inkubation O / N. </li><li> Vorbereitung eines Zellverteilers in Form eines &quot;Hockeyschläger&quot; aus einem Glasstab durch Erwärmen der Mitte des Stabs in die Flamme eines Bunsenbrenners, bis das Glas weich wird und dann direkt die Kurve sanft mit einer Pinzette oder Zange in einem 135 °-Winkel . Erwärmen die Stange noch einmal in der Mitte zwischen dem Ende und der ersten Biegung und biegen in einem 45 ° Winkel nach innen (in die entgegengesetzte Richtung der ersten Biegung). </li><li> Bereiten LB-Agar ohne Antibiotika und in Petrischalen gießen in Vorbereitung derelectrocompetence Protokoll, und LB-Agarplatten mit den entsprechenden Antibiotika (entsprechend dem Resistenzmarker auf dem Vektor elektroporiert werden), und bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie einen Filter sterilisiert 2 mM CaCl 2-Lösung für V. cholerae oder Autoklaven ddH2O für E. coli, und bei 4 ° C </li></ol> 2. Das Wachstum der Elektrokompetente Bakterien (Tag 2, Morgen) <ol><li> Geben Sie 100 ul der O / N Bakterienkultur auf jedes LB-Agar-Platte, kann gefrorenen Glycerin Aktien auch verwendet und direkt auf die Platte geliefert werden. </li><li> Tauchen Sie den Hockeyschläger-förmige Zelle Treuer in 100% EtOH, kurz abtropfen lassen und verbrennen die restlichen EtOH, um es vor der Verwendung und Verbreitung zu sterilisieren. Verbreiten Sie die 100 ul O / N Bakterienkultur gleichmäßig mit der sterilen Glaszelle Treuer was sicher nicht zu (Pause) die Agar-Oberfläche stören. </li><li> Die Platte bei 37 ° C für 4-6 Stunden, oder bis ein dünner Rasen des Bakterienwachstums seinkommt zu unterscheiden. Zellen sind kompetentesten, wenn aktiv wachsenden. </li></ol> 3. Herstellung von Elektrokompetente Bakterienzellen (DAY 2, Nachmittag) <ol><li> Ernten Sie die Bakterien mit einer sterilen Impföse was sicher nicht zu durchbohren oder brechen die Oberfläche des Agar. Ein 2 mm Durchmesser Bakterienmasse ist ausreichend für eine einzige Transformation. Typischerweise erfordert dies, Abkratzen der Oberfläche des dünnen Rasen mit der Impföse zwei-oder dreimal. Mehrere Proben (typischerweise zwischen 4-6) aus der gleichen Platte gesammelt werden. </li><li> Resuspendieren Sie das Bakterienmasse in 1 ml eiskaltem 2 mM CaCl 2 (für V. cholerae) oder sterilem ddH 2 O (für E. coli) und gut mischen, bis keine Klumpen sichtbar sind, auf Eis zu halten. </li><li> Centrifuge jeder Bakteriensuspension für 5 min bei 5.000 xg in einer Kühlmikro auf 4 ° C oder in einer Mikro in einem kalten Raum auf 4 ° C eingestellt gespeichert sind </li><li> Überstand verwerfen, resuspEnde der Bakterienpellet im gleichen Volumen eiskaltem 2 mM CaCl 2 oder sterile ddH 2 O, und wiederholen den Zentrifugationsschritt wie vor noch zweimal für insgesamt drei Waschungen durchgeführt. </li><li> Überstand entfernen, resuspendieren und dann lösen Sie die Bakterienpellet gründlich in 40 ul eiskaltem 2 mM CaCl 2 oder sterilen ddH2O und auf Eis zu halten. </li></ol> 4. Die Transformation der elektro Bakterien (Tag 2, Nachmittag) <ol><li> Fügen Sie bis zu 1 pg Plasmid-DNA (in bis zu 1 ul Wasser oder Tris-EDTA-Puffer) an die 40 ul Bakteriensuspension und übertragen Sie diese Mischung in eine vorgekühlte, sterile 0,2 cm Abstand Küvette. Die Salzkonzentration in der DNA-Probe ist ein niedrig sein, da es zu Lichtbogenbildung des Impulses in der nächsten Stufe bei. </li><li> Setzen Sie die Küvette in die Elektroporation Kammer des Impulssteuermodul und Elektroporation bei 1,8 kV, 25 uF. Die Zeitkonstante sollte ~ 5,0 ms sein und keine Lichtbogenbildung auftreten. </li><li> Erholen sich schnell die Zellsuspension durch Resuspendieren in 1 ml LB-Medium übertragen und in vorher autoklaviert Borosilikatglas Reagenzglas. </li><li> Lassen Sie die Zellen durch Inkubation unter belüfteten Wachstumsbedingungen (in einem Rollentrommel) bei 37 ° C für 30 min ohne antibiotische Selektion zu gewinnen. </li><li> Platte, die Bakterien auf die zuvor vorbereiteten LB-Agar-Platten in Gegenwart der entsprechenden Selektionsmittel (Antibiotikum), und bei 37 ° CO / N. Wenn Bakterien werden mit einer hohen Konzentration von gereinigten Vektor (0,1-1 ug supercoiled Plasmid) transformiert, liefern 10 ul der Bakterienkultur auf den Rand des LB-Agar-Platte und mit einer sterilen Impföse Serie für isolierte Kolonien mit dem Quadranten Streifen-Methode. Wenn ein Ligationsgemisch transformiert, liefern 100 ul der Bakterienkultur auf jede Agar-Platte und gleichmäßig verteilt es mit der sterilisierten Glaszelle Treuer. </li></ol> a Wenn die Zeitkonstante ist kurz (seinniedrigen 3,5 msec) oder Pulsieren führt zu Lichtbögen, dann wieder fällt das DNA-Probe, waschen mit 70% EtOH zweimal, um Salze zu entfernen und vor dem Trocknen in TE-Puffer resuspendiert.

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</ol>

Keine Angaben gelten.

Transformationseffizienz ist Gegenstand einer Vielzahl von Faktoren ab, unabhängig von der verwendeten, um kompetente Zellen herzustellen Verfahren. Analog Variablen gelten für diese Verfahren, muss darauf geachtet werden, dass, wenn die Zellen von der Agar-Platte, so dass sie bei einer konstanten kalten Temperatur (nicht höher als 4 ° C) gehalten wird geerntet. Der Bakterienrasen muss aktiv wachsenden werden zum Zeitpunkt der Sammlung; Zellen müssen in mittleren logarithmischen Phase des Wachstums sein. Qualität der DNA (dh Verschmutzung der Salze) beeinflusst Transformationseffizienz. Insbesondere bei Verwendung dieses Verfahrens der Agar nicht gebrochen wird, wie Agar-Fragmente in der Küvette wird der Pulsschlag verursachen. Die meisten Probleme bei dieser Technik angetroffen werden, mit zwei Problemen verbunden ist; Sammeln der Bakterien während der richtigen Zeitfenster von der Agar-Platte, wenn sie aktiv wächst. Sammeln sie zu früh unzureichend Zellzahlen ergeben und führt zum Erlöschen derAbschaben der LB-Agar-Platte frustrierend, weil die &quot;pellicule&quot; bilden sie ist schwer zu heben Sie die Oberfläche der Platte. Sammeln Bakterien zu spät, werden ihre Kompetenz drastisch verringern. Das Zeitfenster wird natürlich in Abhängigkeit von der Dichte des Inokulums auf den LB-Agarplatten variieren. Der zweite entscheidende Schritt ist, um die Bakterien aus dem Moment, wo sie von der Agar-Platte angehoben werden und in CaCl 2 oder ddH2O suspendiert, bis sie auf der LB-Agar plattiert sind folgende Transformation kaltem (4 ° C) zu halten. Die Mikrozentrifugenröhrchen, die die Bakterien, Küvetten und Puffer sollte vorgekühlt sein und auf Eis gehalten, zu allen Zeiten, bis die Bakterien überzogen sind. Allerdings können zusätzliche Probleme entstehen, wenn die sterile ddH2O oder CaCl 2 enthalten oder Niederschlag verunreinigt sind. Aus diesem Grund empfehlen wir, dieses Reagenz frisch zubereiten. Fehlerbehebung Transformation wird durch die auch Kontrollen bei der Transformation ba erleichtertcteria kompetent gemacht mit keiner Methode. Eine negative Kontrolle, die aus einer Charge von nicht-transformierten kompetenten Bakterien auf einem LB-Agar-Platte, die den Selektionsmarker ausplattiert schnell zu bestimmen, ob das Antibiotikum auf der Platte wirksam ist. Eine positive Kontrolle Transformation mit einem Plasmid bekannt Herstellung von guter Qualität und Quantität beherbergen die gleiche selektive Marker als Versuchsprobe wird bei der Bestimmung, ob die Bakterien zuständig sind, sondern auch, ob die transformierten experimentellen DNA war in ausreichender Menge oder Qualität hilfreich sein. Die Vorteile dieser Technik sind mehrere, kann das Verfahren in dem selben Tag, eine Transformation geplant durchgeführt werden. Wir haben festgestellt, dass gefrorene Bakterien Glycerin Lager direkt auf der LB-Agar ohne Verlust an electrocompetence plattiert werden, wir haben dies in &quot;Notfall&quot;-Situationen getan (nach vergessen, den Tag vor der Nacht der Kultur beginnen). Zwar konnten wir nicht testen, eBelastung sehr bekannt ist, keine E. coli oder V. Cholera-Stamm, die durch Elektroporation transformiert werden können, ist in unseren Händen zugänglich zu diesem Protokoll. Das Verfahren ist schnell, effektiv und Ausbeuten Transformationseffizienz vergleichbar mit denen von Herstellung elektro Bakterien Anwendung traditioneller Verfahren erhalten. Das Verfahren beseitigt das Erfordernis für Hochgeschwindigkeitszentrifuge und zugehörigen Rotoren, einem Orbitalschüttler Inkubator und sterile Zentrifugenbehälter (Container), und große Mengen von Puffer autoklaviert. Obwohl die Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte ist recht umfassend, werden die meisten Labore, durchführen Elektroporation meisten, wenn nicht alle, dieser Materialien bereits verfügbar. Vielleicht am wichtigsten ist, kann die Technik ohne weiteres angewendet werden, um elektrospezifische Laborstämme mit Mutantenhintergründe schnell zu generieren. Wir wissen nicht, irgendwelche Einschränkungen dieser Technik, wie es die traditionelle Methode der Herstellung von Elektro ersetzttrocompetent Bakterien in unserem Labor. Die Ergebnisse der hier gezeigten Experimente wurden mit frischem elektrokompetente Zellen, die mit dem herkömmlichen Verfahren, die bei -80 ° C über 1 Woche lang gelagert worden waren, nicht mehr hergestellt werden durchgeführt. Allerdings, gefroren elektro Zelle Aktien verlieren Kompetenz und Lebensfähigkeit oder über längere Lagerung. Unsere gekürzte Protokoll erlaubt am selben Tag die Transformation ohne Bedenken über das Alter der Aktie, die zu einer verminderten Trans Ausbeute führen kann plante die Zubereitung frischer elektroZellen. Wir haben versucht Speicherung elektro Zellen hergestellt durch das Schnellverfahren zur Verwendung an einem anderen Tag, da dies nicht notwendig war. Wenn dies hier nicht dargestellt ist, die Effizienz der elektro Zellen unter Verwendung unserer schnelles Verfahren ist ausreichend für Ligationsgemische. Die für Nicht-O1 V. berichtet Transformationen cholerae in einem kürzlich erschienenen Artikel von Unterweger et al.17 wurden unter Verwendung von elektro Bakterien durch das hier beschriebene (mit Ausnahme der durch Konjugation durchgeführt)-Methode hergestellt wurde. Diese Technik bietet Forschern, Stämme mit mutierten Hintergründe schnell und effektiv, ohne große Chargen von Zellen herzustellen verwandeln. Diese schnelle Herstellung von elektro Bakterien Methode könnte zu anderen Prokaryoten, die gezeigt wurden Elektroporation zugänglich zu sein, wie das Prinzip der Herstellung und die Elektroporation Einstellungen gehen, um die gleichen wie die der traditionellen Protokolle sein angepasst werden.

Seit seiner &quot;Gründung in den frühen 1980er Jahren ein, hat der Elektroporation zu einem integralen Molekularbiologie Technik, wahrscheinlich die häufigste eingesetzt, um / Transfektion lebende Zellen mit kreisförmigen oder linearen Nukleinsäuren Transformationsmethode. Ursprünglich für die Transfektion von eukaryotischen Zellen 1 entwickelt wurde Elektroporation anschließend für die Transformation von E. angepasst coli, 2, 3. In Bakteriologie, hat Elektroporation werden die Laborstandard und wurde modifiziert, um ein breites Spektrum von Bakterien, einschließlich gramnegativen Pseudomonas 4, 5 Salmonellen, Vibrionen 6, Serratiae, Shigellen und 7 zu verwandeln, Gram-positive Clostridien 8, 9 Bazillen, Laktobazillen 10 und Enterokokken 11. Sogar einige Archaebakterien haben durch Elektroporation für eine Transformation erwiesen, einschließlich Methanococcen </em&gt; 12 und Sulfolobus 13 Arten. Eine umfassende Übersicht finden Sie Aune und Aachmann 14 verweisen. Effizienz der Transformation durch Elektroporation ist angeblich 10 bis 20-fach höher als chemische Kompetenz oder Hitzeschock-2. Doch ähnlich wie die Vorbereitung Bakterien für die chemische Kompetenz als von Douglas Hanahan in den 1980er Jahren 15 optimiert, Zellen müssen auch bereit, um elektro sein. Elektroporation ist ein schnelles und wirksames Mittel zur bakteriellen Transformation, erfordern elektro Bakterien, gereinigte DNA, ein Pulssteuermodul, das den elektrischen Impuls liefert, und eine Kammer, die kleine Einweg-Küvetten, die als Elektrode fungiert aufnimmt. Kurz gesagt, werden kalt, kompetente Bakterien mit Plasmid-DNA, um einen Hochspannungsimpuls in einer Küvette unterzogen, in Wachstumsmedium resuspendiert, bei 30-37 ° C für 30-45 min inkubiert und dann auf halbfestem Medium (Nähragar ausplattiert Platten) mit ca.opriate selektive Antibiotikum. Im Gegensatz zu dem pulsierenden Schritt der Herstellung elektrokompetenter E. coli bleibt ein mehrteiliges Verfahren, das traditionell in großen Mengen durchgeführt wird. Kurz gesagt, wird eine Übernachtkultur von Bakterien in einen Erlenmeyerkolben mit 100 ml auf 1 Liter Luria Broth (LB), den mittleren logarithmischen Wachstumsphase (OD 600 von &lt;1,0) gezüchtet, und die Serien Waschen mit einem sterilen nicht unterworfen inokuliert ionischen Puffer oder doppelt destilliertem Wasser (ddH 2 O) in abnehmender Mengen bei 4 ° C. Muss mit großer Sorgfalt getroffen werden, um die Zellen zu kalt während des gesamten Verfahrens zu halten und verhindern, dass Verunreinigungen sein. Dies erfordert die Verwendung von Autoklaven Zentrifugation Eimer und nichtionischen Puffer oder ddH 2 O, einem Schüttler-Inkubator, eine große Menge Hochgeschwindigkeits-Kühlzentrifuge und einen Satz von Rotoren. Bakterien werden schließlich in einem kleinen Volumen Puffer mit 10% Glycerin resuspendiert und in ~ 40 &amp;mgr; l Volumina, wh aliquotiertICH werden bei -80 ° C bis zur Verwendung gelagert. Tieftemperatur-Speicher führt oft zu einer verringerten Transformationseffizienzen durch den Verlust der Lebensfähigkeit über die Zeit. Elektrobakterienzellen sind von einer Vielzahl von kommerziellen Quellen, aber nur für eine begrenzte Anzahl von (oft Rekombinations-defizient) E. verfügbaren coli-Stämmen, die herkömmlich als Gastgeber eine breite Palette von Plasmiden zu propagieren. Als Ergebnis Forscher verlassen sich auf in-house Methoden, um ihre eigenen Stämme / Mutanten für die Transformation vorzubereiten. Eine alternative, schnelle und effiziente Protokoll für die Herstellung von elektrokompetenten E. coli im Einsatz von ein paar molekulare Bakteriologie Labors seit einiger Zeit und hat zusätzliche Gram-negative Bakterien erweitert, in unserem Fall V. cholerae. Der Urheber der Protokoll kann nicht identifiziert werden, da er von anderen Forschern über die Zeit optimiert. Das hier vorgestellte Verfahren wurde in unserer laborator verwendeties seit fast zwei Jahrzehnten, und es ist unser Ziel, diese nützliche Protokoll mit unseren Kollegen teilen.

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser Modul</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2668</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Küvettenkammer</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2669</td><td></td></tr><tr><td>Elektroküvetten (0,2 cm Abstand)</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2082</td><td></td></tr><tr><td>13 x 100 mm Pyrex Randlose Kulturröhrchen </td><td>Corning</td><td>70820-13 13</td><td></td></tr><tr><td>mm Kulturröhrchenverschlüsse </td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04500-00</td><td></td></tr><tr><td>6 x 250 mm Glasstab</td><td>Lab Source</td><td>11381D</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Petrischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Walzentrommelmotorbaugruppe</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1053-4004</td><td></td></tr><tr><td>Walzentrommel für 13 x 100 mm Kulturröhrchen</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1053-0306</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma Chemikalien</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, wasserfrei/vergällt</td><td>Sigma Chemicals</td><td>227649</td><td></td></tr><tr><td>Impfschleife</td><td>Decon Labs</td><td>MP182-5</td><td></td></tr> gekühlte <tr><td>Mikrozentrifuge 5451 R</td><td>Eppendorf</td><td>22621425</td><td></td></tr><tr><td>Bunsenbrenner</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-917Q</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon MILLER</td><td>EMD</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>bakteriologischer Agar</td><td>Fisher Wissenschaftlich</td><td>S25127</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid-protokoll für die herstellung von elektrokompetente<em&gt; escherichia coli</em&gt; und<em&gt; vibrio cholerae</em

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Die Elektroporation hat sich ein weit verbreitetes Verfahren zur schnellen und effizienten Einführung fremder DNA in eine Vielzahl von Zellen. Elektrotransformation hat sich die Methode der Wahl für die Einführung von DNA in Prokaryonten, die nicht natürlich kompetent sind. Elektroporation ist eine schnelle, effiziente und optimierte Transformationsmethode, die, zusätzlich zu DNA gereinigt und kompetente Bakterien erfordert kommerziell erhältlichen Gen Impulscontroller und-Küvetten. Im Gegensatz zu dem pulsierenden Schritt ist die Herstellung von elektrokompetenten Zellen zeitaufwendig und arbeitsintensiv das wiederholte Runden Zentrifugation und Waschen in abnehmender Mengen von sterilen, Kaltwasser, oder nicht-ionische Puffer, der große Mengen der Kulturen mittleren logarithmischen Phase gezüchtet Wachstum. Aufwand kann durch den Erwerb elektro Zellen aus kommerziellen Quellen gespeichert werden, aber die Auswahl beschränkt sich üblicherweise verwendeten E. coli Laborstämme. Wir werden hiermit eine schnelle Verbreitung undeffizientes Verfahren zur Herstellung von elektrokompetenten E. coli, das in Gebrauch ist bakteriologisch Laboratorien für einige Zeit, bis V können angepasst werden cholerae und anderen Prokaryoten. Wir können zwar nicht festzustellen, wem sie Kredit für die Entwicklung der ursprünglichen Technik werden wir hiermit zur Verfügung zu der wissenschaftlichen Gemeinschaft.

Wir führten eine Reihe von Transformationen mit E. coli und V. cholerae, um Transformationseffizienz von unserer schnellen Methodik mit einer Anpassung des (traditionellen)-Methode ursprünglich von Dower et al. 2 für die Herstellung von elektro Bakterien beschrieben vergleichen. Zur Durchführung der traditionellen Herstellung von kompetenten Zellen wurden 500 ml LB in einem 2-L-Erlenmeyerkolben mit 500 ul-Nacht-Kultur von E. geimpft coli DH5a oder V. cholerae O395, in einem Orbitalschüttler (215 Upm bei 37 ° C) inkubiert und bei OD 600 von 0,5-1,0 geerntet. Der Kolben wurde auf Eis gekühlt und die Kulturen in ein vorgekühltes Rotor zentrifugiert bei 4000 g für 10 min bei 4 ° C. Die Zellpellets wurden gründlich in 500 ml eiskaltem 2 mM CaCl 2 resuspendiert V. cholerae und ddH2O für E. coli und erneut unter denselben Bedingungen zentrifugiert. Folgerunden Aufwirbelung eind Zentrifugation wurden in abnehmender Mengen von 200 und 100 ml Volumen machen, dass die Kultur blieb bei 4 ° C gekühlt durch Schließlich wurde eine Resuspendierung und Zentrifugation in einem 10 ml Volumen mit 10% Glycerin durchgeführt. Das endgültige Pellet wurde in 2 ml 10% Glycerin resuspendiert und 40 ul Aliquots wurden bei -80 ° C eingefroren und nicht länger gespeichert als eine Woche vor der Elektroporation. Elektroporation Bedingungen einschließlich Pulseinstellungen und Küvettengröße waren unabhängig von Verfahren zur Herstellung von kompetenten Zellen für beide Bakterienarten in allen electroporations. Der einzige Unterschied war, dass wir durchgeführt, die wäscht in kaltem ddH2O für E. coli-und Kalt 2 mM CaCl 2 für V. cholerae. Tabelle 1 zeigt Ergebnisse von Bakterien durch Elektroporation kompetent gemacht identisch, aber entweder mit dem schnellen Protokoll oder mit dem herkömmlichen Verfahren transformiert. Wir beschäftigten Stamm O395 und DH5a als gemeinsamely verwendet, repräsentative Stämme von V. cholerae und E. coli sind; können ähnliche Ergebnisse mit anderen Stämmen der gleichen Spezies erhalten werden (wenn auch nicht jeder Stamm wurde getestet) und andere Gram-negative Bakterien und wahrscheinlich außerhalb angepasst wahrscheinlich. Um sicherzustellen, dass gleiche Zellzahlen in jeder Charge gepulst anwesend waren, wurden elektro Bakterien erzeugt die Nutzung der Schnellmethode bei Abholung gebündelt, gemischt, gehalten homogen suspendiert und kurz vor der Elektroporation in 40 ul-Volumina aliquotiert. Elektro Bakterien erzeugt unter Verwendung der traditionellen Methode wurden in ähnlicher Weise vor dem Einfrieren in 40 ul Aliquots behandelt. Nach Abgabe des Impulses wurde jede Charge von 40 ul Elektroporation Bakterien in 400 ul LB suspendiert und seriell 1:10 verdünnt. Einhundert Mikroliter jeder Verdünnung wurden auf LB-Agar in Gegenwart von 100 ug / ml Ampicillin verteilt und unter Verwendung eines sterilen Glaszelle Treuerund bei 37 ° C über Nacht inkubiert. Um die Gesamtzahl der Bakterien in jeder Transformation verwendet zu quantifizieren, wurden 40 ul-Volumina von elektro Bakterien jeder vorbereiteten Partie seriell verdünnt und ohne Antibiotika identisch parallel auf LB-Agar. Ein Aliquot gleich behandelt werden Bakterien aus jeder Charge wurde mit 1 ul Tris-EDTA (TE)-Puffer, aber ohne DNA (mock-Transformation), seriell verdünnt und auf LB-Agar ohne Antibiotika, die Anzahl der Zellen, die durch die Lieferung der verlorene schätzen Elektroporation elektrischen Impuls. Schließlich ist eine weitere Variation der Versuch wurde bei 37 ° C in 1 ml LB nach Elektroporation jedoch vor, auf LB-Agar-Überzug würde die Rückgewinnung von transformierten Zellen beeinflussen geführt, ob 30 min Inkubation zu bestimmen. Kolonie-bildenden Einheiten (CFUs) wurden am folgenden Tag gezählt. Für dieses Experiment verwendeten wir pUC18, ein gemeinsames Labor Plasmid und Chargen von kompetenten Bakterien, bestehend aus einemtwa 10 8 KBE für Zellen hergestellt, wobei die traditionelle Methode und 10 7 KBE für Zellen hergestellt, wobei die schnelle Protokoll. Elektroporation allein (ohne DNA) reduziert tragfähige KBE von 10-100 fach unabhängig von der verwendeten, um die elektro Zellen herzustellen Methode. Wie in Tabelle 1 gezeigt, war Trans Ausbeute im Bereich von 10 6 bis 10 7 CFU / ug DNA-Bereich in drei Wiederholungsexperimenten (Standardabweichungen in Klammern) für E. coli (DH5 &amp;agr;) und V. cholerae (O395), die jeweils mit der herkömmlichen, längere Verfahren zur elektroZellPräparation. Trans Ausbeute erschien um 10-fach bis 10 5 bis 10 6 KBE / ug DNA in drei Wiederholungsexperimenten (Standardabweichung in Klammern) für E. coli und V. cholerae jeweils mit der schnellen Methode. Aus diesem Grund entschlossen wir den Prozentsatz der transformierten Bakterien durch Teilung verwandelt KBEdurch die Anzahl der KBE von &quot;Schein-Transformationen&quot; (ohne Plasmid) erholte sich von sonst identischen Chargen von kompetenten Zellen. Der Prozentsatz der transformierten Bakterien wurde innerhalb eines log (2,5-9,4%), unabhängig von dem Herstellungsverfahren und transformiert (Tabelle 1 Zahlen in Klammern)-Spezies. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Effizienz des Schnellverfahren ist vergleichbar mit der des herkömmlichen Verfahrens zur Herstellung von längeren kompetenten Zellen und die repräsentative Stämme von Vibrio cholerae und Escherichia coli sind ebenfalls zugänglich für die schnelle Prozedur. Wir fanden, dass die Transformationseffizienz für Plasmide wie pUC18 beherbergen β-Lactamase-Kassetten nicht durch die Wiederherstellungszeit von 30 min in LB-Medium beeinflusst. Die gleiche Anzahl an Transformanten wurden gewonnen, ob die Zellen auf LB-Agar in Gegenwart von Ampicillin unmittelbar nach der Elektroporation, oder ob sie eine Wiederherstellungszeit von 30-45 min erlaubtin LB-Brühe bei 37 º C vor dem Beschichten. Unsere Ergebnisse, dass Ampicillin-Resistenz nicht Auswuchs unter nichtselektiven Bedingungen erfordern legt nahe, dass β-Lactamase-Expression erfolgt ausreichend schnell auf Transformation. Es sollte jedoch angemerkt, dass wir geführt serielle Verdünnungen von gepulsten Bakterien in LB-Brühe, die Erholung von dem elektrischen Schlag bei und initiieren Genexpression haben können. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50684/50684fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Graphische Darstellung der Methode zur schnellen Herstellung von elektro Bakterien. Nach 4-6 Stunden (abhängig von der Dichte des Inokulums) eine ausreichende Zahl von Bakterien können gesammelt werden, um aus einer LB-Agar-Platte durchzuführen vier vor sechs Transformationen. Um die gleiche Anzahl von kompetenten Zellen für jeden Endvolumen auf elektroporiert werden, zu gewährleisten, wurden die Bakterien aus der LB-Agar-Platte gesammelt zunächst gesammelt und dann zusammen gewaschen alin 40 ul-Volumina in Abhängigkeit von der Größe des Pellets iquoted (größere Pellets wurden in größeren Mengen teilbar durch 40 ul verdünnt). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Anzahl der Ampicillin-resistenten Transformanten / ug DNA (Ampicillin-resistenten Transformanten gewonnen [%]) </td></tr><tr><td> Dehnungs </td><td> Traditionelle Methode </td><td> Rapid-Verfahren </td></tr><tr><td> E. coli (DH5 &amp;agr;) </td><td> 2,3 x 10 6 (± 7,3 x 10 5) [9,4%] </td><td> 3 x 10 6 (± 7,1 x 10 5) [2,5%] </td></tr><tr><td> V. cholerae (O395) </td><td> 4 x 10 7 (± 1,7 x 10 7) [5%] </td><td> 6,7 x 10 5 (± 2,1 x 10 5) [3,3%] </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Die Transformationseffizienz pro Mikrogramm DNA (pUC18) des elektro bacteria nach der traditionellen Methode im Vergleich zu der schnellen Methode hergestellt. Alle Umsetzungen wurden mit 500 ng pUC18-DNA durchgeführt (~ 80% supercoiled DNA, wie durch 1% Agarosegel-Elektrophorese sichtbar) und die elektroporierten Zellen wurden seriell 10-fach verdünnt in LB-Brühe vor für CFU auf LB-Agar mit Antibiotika beschichtet. Kontrollen von Nicht-Bakterien elektroporiert und Bakterien elektroporiert ohne Plasmid, seriell verdünnt und auf LB-Agar ohne Antibiotika wurden für jeden Satz von Transformationen durchgeführt, um die Anzahl der lebensfähigen Bakterien vor und nach dem Pulsen zu bestimmen. Die Elektroporation Kontrollen repräsentiert die Basislinie für die Prozent der lebensfähigen Bakterien erfolgreich transformiert.

Elektroporation ist ein häufig verwendetes Verfahren zur Einführung von DNA in Bakterien in einem als Transformation bekannt. Traditionellen Protokolle zur Herstellung von elektrokompetenten Zellen sind zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Dieser Artikel beschreibt eine alternative, schnelle und effiziente Methode zur Herstellung von elektrokompetenten Zellen derzeit von einigen Labors eingesetzt.

Rapid-Protokoll für die Herstellung von Elektrokompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Und<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, kompetente Bakterien am selben Tag schnell und bequem herzustellen, die für die Transformation benötigt werden. Dazu werden die Bakterien zunächst auf LB-Agar ausgestrichen und vier bis sechs Stunden lang inkubiert. Anschließend wird der Bakterienrasen vorsichtig von der Oberfläche des Agars abgenommen und das Pellet in steriler kalter Wasserlösung oder Puffer resuspendiert. Danach wird das Bakterienpellet dreimal bei vier Grad Celsius gewaschen und in 40 Mikroliter resuspendiert. Schließlich werden die kompetenten Zellen in Gegenwart von DNA elektroporiert.Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Transformationsgrade von Bakterien aufweisen, die mit denen der herkömmlichen Methode vergleichbar sind und die umfangreiche Ausrüstung, große Volumina bakterieller Kulturen und sterile Puffer erfordert. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass frische, kompetente Bakterien praktisch aus jedem Laburstamm am selben Tag, an dem die Transformation geplant ist, hergestellt werden können, ohne dass große Zentrifugen, Rotoren oder große Mengen steriler Puffer und Kulturen benötigt werden. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, keine großen Schwierigkeiten haben, da es sich hierbei lediglich um eine vereinfachte Variante von Techniken handelt, die in bakteriologischen Laboren üblich sind. Der Urheber dieses Protokolls lässt sich nicht identifizieren, da es im Laufe der Zeit von zahlreichen Forschern verwendet und optimiert wurde.Die hier vorgestellte Methode wird seit fast zwei Jahrzehnten in unseren Laboren angewandt, und es ist unser Ziel, dieses nützliche Protokoll mit unseren Kollegen zu teilen. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist für einen Schritt wichtig. Insbesondere die Sammlung von Bakterien aus dem Rasen auf dem Bohrer, da es eines erfahrenen Blicks bedarf, um das Wachstum auf der Platte zu beurteilen.Und dies lässt sich am besten veranschaulichen. Den Vorgang demonstriert Frau Theresa Brooks, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus dem Labor von Dr. Te Koski an der University of Alberta in Edmonton, Kanada. Um die bakterielle Kulturpräparation am späten Nachmittag zu beginnen, verwendet man eine kleine Menge E. coli oder V. coraly, um ein bis fünf Milliliter sterilisierte LB-Brühe in sterilen Borosilikatglas-Reagenzgläsern zu beimpfen.Stellen Sie die beimpften Reagenzgläser in eine Rollvorrichtung und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius und hoher Geschwindigkeit. Bereiten Sie einen Zellverteiler in Form eines Hockeyschlägers aus einem Glasstab vor, indem Sie die Mitte des Stabs in der Flamme eines Bunsenbrenners erhitzen, bis das Glas weich wird. Formen Sie dann mit einer Pinzette oder Zange vorsichtig eine Biegung in einem Winkel von 135 Grad.Erhitzen Sie die Stange erneut in der Mitte zwischen dem Ende und der ersten Biegung und biegen Sie sie in einem Winkel von 45 Grad nach innen. Bereiten Sie LB-Agar mit und ohne Antibiotika vor und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius. Am nächsten Morgen.Tragen Sie 100 Mikroliter Übernachtkultur auf jede LB-Agarplatte auf. Inkubieren Sie die Platte mit Hilfe des Zellverteilers bei 37 Grad Celsius für vier bis sechs Stunden, oder bis sich ein dünner Rasen aus bakteriellem Wachstum sichtbar bildet. Entnehmen Sie mit einer Inokulationsnadel eine bakterielle Masse von etwa zwei Millimeter Durchmesser von der Platte und resuspendieren Sie diese in einem Milliliter eiskaltem.Zwei Millimolar Calciumchlorid. Wenn v coray oder sterile zweifach destillierte Wasser für E. coli verwendet wird, zentrifugieren Sie die Suspension in einer gekühlten Zentrifuge bei vier Grad Celsius fünf Minuten lang bei 5.000 × g. Entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie die Wäsche noch zweimal. Nach dem Entfernen des letzten Überstands resuspendieren Sie das Pellet in 40 Mikrolitern Calciumchlorid oder zweifach destilliertem Wasser und stellen es auf Eis.Um eine Transformation durchzuführen, geben Sie bis zu einem Mikrogramm Plasmid-DNA zur 40-Mikroliter-Bakteriensuspension hinzu und überführen die Mischung in eine vorab gekühlte sterile Zelle mit 0,2 Zentimeter Elektrodenabstand. Platzieren Sie die Zelle in die Elektroporationskammer des Pulssteuermoduls und impfen Sie mit 1,8 Kilovolt und 25 Mikrofara. Die Zeitkonstante sollte etwa 5,0 Millisekunden betragen, und es sollte kein Lichtbogen entstehen.Suspenderen Sie die Zellen schnell in einem Milliliter LB-Brühe und überführen Sie sie in ein zuvor autoklaviertes Glasröhrchen. Lassen Sie die Zellen durch Inkubation unter belüfteten Wachstumsbedingungen bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten ohne Antibiotikaselektion regenerieren. Impfen Sie die Bakterien auf LB-Agarplatten mit Antibiotikum aus und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius.Wie hier gezeigt, führten wir eine Reihe von Transformationen mit E. coli und V. corray durch, um die Transformationseffizienz unserer schnellen Methodik mit einer Anpassung der ursprünglich von Doer et al. beschriebenen traditionellen Methode zum Herstellen elektrokompententer Bakterien zu vergleichen. Die Ausbeute an Transformanten lag in drei unabhängigen Experimenten für E. coli und V. corray im Bereich von 10⁶ bis 10⁷ KBE pro Mikrogramm DNA, wenn die traditionelle Methode zur Herstellung der Elektrokompentenz verwendet wurde.Zellvorbereitung, die Transformationsausbeute zeigte in drei unabhängigen Experimenten mit der Schnellmethode für E. coli und V. coraly eine zehnfache Verringerung auf 10 hoch 5 bis 10 hoch 6 KBE pro Mikrogramm DNA. Aus diesem Grund bestimmten wir den Prozentsatz transformierter Bakterien, indem wir die Anzahl der transformierten KBE durch die Anzahl der KBE teilten, die aus Kontrolltransformationen sonst identischer Chargen kompetenter Zellen gewonnen wurden. Der Anteil transformierter Bakterien lag innerhalb einer Größenordnung.Unabhängig von der Herstellungsmethode und der transformierten Spezies. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Effizienz der schnellen Methode mit der der traditionellen, zeitaufwändigeren Methode zur Herstellung kompetenter Zellen vergleichbar ist und dass die repräsentativen Stämme von ieo, coray und esia coli gleichermaßen für das schnelle Verfahren geeignet sind. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von fünf bis sechs Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Bakterien während ihrer logischen Wachstumsphase zu gewinnen, sie in steriler, frisch zubereiteter und vorgekühlter Pufferwasserlösung zu waschen und bis zur Resuspension in LB nach der Elektroporation kalt zu halten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie in Ihrem Labor schnell elektrokompetente, spezifische Bakterienstämme erzeugen können, indem Sie sie auf einem initialen Rasen kultivieren, während der logischen Wachstumsphase sammeln und anschließend in kaltem Puffer waschen, um sie auf die Elektroporation vorzubereiten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Vorbereitung von Vibrio parahaemolyticus Swarmer-Zellen für die Bildgebung

Quelle: Kuo, C., et al. Nachweis der besiedlung durch enterohämorrhagische Escherichia coli im murinen Wirt durch nicht-invasives In vivo Biolumineszenzsystem. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt die Herstellung einer Luciferase-exprimierenden enterohämorrhagischen Escherichia coli-Suspension aus gefrorenem Bestand zur Verwendung als orales Inokulum in Tiermodellen. Dies ermöglicht die biolumineszierende Echtzeit-Verfolgung der Darmbesiedlung während in vivo Infektionsstudien.

Zubereitung des biolumineszierenden enterohämorrhagischen Escherichia coli Inokulums

Quelle: Figueroa, D. M., et.al. Herstellung und Visualisierung von bakteriellen Sphäroplasten und Protoplasten zur Charakterisierung der antimikrobiellen Peptidlokalisierung. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt die Produktion von Escherichia coli Sphäroplasten, indem zunächst die Zellteilung gehemmt wird, um die Filamentation zu induzieren, gefolgt von einem enzymatischen Verdau der Zellwand. Der Prozess umfasst die kontrollierte Zugabe eines Chelatbildners, DNase, und eines osmotischen...

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Rapid-Protokoll für die Herstellung von Elektrokompetente

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