DNA-Ligationsreaktionen

Das Wort Ligation bedeutet auch Verknüpfung. In der Biologie bezieht sich dieser Begriff auf eine enzymatische Reaktion, die zwei verschiedene biologische Moleküle durch die Bildung einer kovalenten Bindung verbindet. Dieses Video beschreibt die Anwendung der DNA Ligation in der molekularbiologischen Forschung.

In einer Zelle sind DNA Ligasen Enzyme, die Brüche in der DNA identifizieren und versiegeln, in dem sie die Bildung einer Phosphodiesterbrücke zwischen der 3’ Hydroxy und der 5’ Phosphatgruppe im DNA Rückgrat katalysieren. Ligationen treten in normalen zellulären Prozessen wie zum Beispiel der DNA Replikation oder bei der Reparatur von Einzel- und Doppelstrangbrüchen auf.

Im Labor werden DNA Ligasen routinemäßig in der molekularen Klonierung eingesetzt – ein Prozess bei dem ein mit Endonukleasen geschnittenes DNA Fragment (oder Einsatz) mit einem mit Endonukleasen geschnittenen Vektor (wie zum Beispiel einem Plasmid) verbunden wird, so dass man das Endprodukt in Wirtszellen vermehren kann.

Endonukleasereaktionen beinhalten die Verwendung von Restriktionsenzymen, die Brüche an spezifischen Stellen der DNA einführen.

Diese spezifischen Brüche sehen entweder wie Einzelstrangbrüche aus, die 3’ und 5’ Überhänge bilden und auch “klebrige Enden” genannt werden, oder wie Doppelstrangbrüche, die keinen Überhang haben und deshalb auch “stumpfe Enden” genannt werden. Die Ligation von klebrigen Enden ist vorteilhaft, denn die komplementären Überhänge stabilisieren die Reaktion. Da es bei der Ligation von stumpfen Enden keine komplementären Basenpaare gibt, ist die Ligation nicht so effizient und es ist schwieriger für das Enzym die Enden zu verknüpfen. Klebrige und stumpfe Enden können normalerweise nicht zusammengeklebt werden.

Das Klenow-Fragment (ein Produkt der DNA Polymerase 1, das durch enzymatische Spaltung mit Subtilisin entsteht) verwandelt klebrige in stumpfe Enden. Das Klenow-Fragment hat sowohl 3’ zu 5’ Exonukleaseaktivität, welche die 3’ Überhänge zerstört, als auch Polymeraseaktivität, welche die 5’ Überhänge durch die Auffüllung des 3’ Endes des komplimentären Stranges stumpf macht.

Wenn das Ziel die Einfügung eines Gens in ein Plasmid ist, ist die Ligation eines Vektors mit sich selbst (auch Selbstligation genannt) ein häufiges, aber nicht wünschenswertes Vorkommnis. Die Behandlung der Vektor-DNA mit einer Alkalinphosphatase nach dem Verdau entfernt die 5’ Phosphatgruppen an beiden Enden und verhindert diese unerwünschte Reaktion.

Wie wir schon erwähnt haben, werden der Vektor und das DNA-Fragment vor der Ligation mit Endonukleasen geschnitten. Nach der Gel-Aufreinigung des geschnittenen Vektors und des DNA-Fragments, misst man die DNA Konzentration mit einem Spektrophotometer um die Konzentration des aufgereinigten Vektors und DNA-Fragments zu ermitteln.

Von dieser Konzentration kann die Anzahl der Moleküle des Vektors oder DNA Fragments in 1µl von der durchschnittlichen molekularen Masse der DNA Basenpaare und der Anzahl der DNA Basenpaare bestimmt werden. Ausgehen von der berechneten molekularen Konzentration des Vektors und DNA Fragments, berechnet man ein 3:1 Verhältnis von DNA Fragment zu Vektor, um deren Volumen für die Ligation zu bestimmen. Dieses 3:1 Verhältnis des DNA Fragments zu Vektor ist wünschenswert, weil es die Wahrscheinlichkeit erhöht das das DNA Fragment in den Vektor ligiert wird und der Vektor nicht mit sich selbst ligiert.

Nun das wir bestimmt haben welche Menge an Vektor und DNA Fragment man in der Reaktion verwendet, setzen wir die Reaktion auf Eis an. Die Reihenfolge in der man die Reagenzien zu der Reaktion gibt ist wie folgt: zuerst das sterile Wasser um ein Gesamtvolumen von 10 µl zu erreichen (in unserem Fall benutzen wir 4 µl), dann 1 µl eines 10X Ligationspuffers, 1 µl von 10 mM ATP, 1 µl des Vektors und 3 µl des DNA Fragments, wie berechnet, und zu letzt 1 µl der DNA Ligase. Die Reaktion wird dann gründlich gemischt, zentrifugiert und bei der angegebenen Temperatur inkubiert.

Die Temperatur und Länge der Inkubation sind abhängig davon ob man eine Reaktion mit klebrigen oder stumpfen Enden durchführt. Zum Beispiel kann eine Ligation mit klebrigen Enden und 6 Basenpaaren Überhang bei Zimmertemperatur für eine Stunde angesetzt werden, weil die komplementären Enden die Reaktion stabilisieren. Reaktionen mit kurzen Überhängen oder stumpfen Enden sollten über Nacht bei 14-20˚C ausgeführt werden.

Nun das wir gelernt haben wie man eine Ligationsreaktion ansetzt, schauen wir uns einige Anwendungen dieses Verfahrens an.

Ligationen können benutzt werden um PCR-amplifizierte Fragmente direkt in linearisierte Plasmide einzufügen. Hier sieht man einen Forscher, der eine Probe von einem gefrorenen Maushirn entnimmt und davon genomische DNA extrahiert. Danach wird eine Bisulfit PCR Reaktion angesetzt, was eine auf PCR-basierende Methode ist um methylierte DNA zu untersuchen. Die PCR Produkte werden dann direkt in das Plasmid ligiert um eine Bibliothek von Genen zu erhalten, die in einer bestimmten Gehirnregion methyliert sind.

Ligationen können verwendet werden um Oligonukleotidlinker mit Bindeseiten für PCR Primer zu befestigen, um DNA Fragmente aufzureinigen. Bei Tumorproben können Wissenschaftler diese Methode verwenden um deren genomische DNA zu sequenzieren und damit tumorspezifische Mutationen zu identifizieren.

In diesem Video wird eine Ligation von DNA, die von formaldehydfixierten Zellen isoliert worden ist, durchgeführt. Die DNA wird dann mit einem Restriktionsenzym und Klenow in der Anwesenheit von Biotin behandelt, welches dann benutzt wird um die DNA zu isolieren. Diese DNA wird danach mit PCR amplifiziert und sequenziert um Interaktionen mit Chromatin auf verschiedenen Skalen zu untersuchen.

Hier haben wir über die DNA Ligase und die verschiedenen Grundlagen, die man braucht um DNA Ligationsreaktionen anzusetzen, gesprochen. Außerdem haben wir potenzielle Probleme und deren Lösungen und verschiedene Anwendungen in der molekularbiologischen Forschung erläutert. Danke für eure Aufmerksamkeit.