Intraduktale Injection für Lokalisierte Drug Delivery auf die Maus Milchdrüse

Ein Protokoll für die nicht-invasive intraductal Lieferung von wässrigen Reagenzien zu der Brustdrüse der Maus beschrieben. Die Methode nutzt lokalisierte Injektion in den Brustwarzen der Brustdrüsen Targeting Milchgänge speziell. Diese Technik ist für eine Vielzahl von Verbindungen, einschließlich siRNA, chemotherapeutischen Mitteln und kleinen Molekülen anpaßbar.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, wässrige Reagenzien nicht-invasiv an die Brustdrüse der Maus abzugeben. Einführend. Dies wird erreicht, indem zuerst die Maus betäubt und die Haare um die Brustwarzen herum entfernt werden. Der zweite Schritt besteht darin, abgestorbene Hautschüppchen, die die Spitze der Brustwarzen bedecken, mit einer Mikropinzette zu entfernen.

Als nächstes wird eine wässrige Lösung mit einer 33-Gauge-Nadel in den Nippel injiziert. Der letzte Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass die Injektion erfolgreich war, indem die Injektionsstelle auf mögliche Schwellungen beobachtet wird, was auf eine Injektion von Brustfettpolstern anstelle einer Injektion in die Brustdrüse hindeuten würde. Letztendlich kann der Erfolg des Verfahrens durch die Visualisierung des duktilen Baums nach der Evans-Blau-Injektion bestimmt werden.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich Brustkrebs zu beantworten, wie z. B. den Beitrag bestimmter Gene in verschiedenen Stadien der Gedächtnistumorgenese. Bereiten Sie zunächst 160 Mikroliter 0,2 %igen Evans-Blau-Farbstoff in steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung für jede Maus vor, die vor der Injektion injiziert werden soll. Wiegen Sie jede Maus und notieren Sie ihr Körpergewicht.

Betäuben Sie dann die Maus nacheinander mit einer Fluorkammer und tragen Sie Augenschmiermittel auf. Setzen Sie nach der Sedierung eine Fluornase auf und injizieren Sie Meloxicam in einer Dosis von fünf bis 10 Milligramm pro Kilogramm subkutan vor dem Eingriff. Überwachen Sie die Maus während des Eingriffs kontinuierlich auf Veränderungen der Atemfrequenz und passen Sie den Fluorspiegel entsprechend an, insbesondere wenn die Atemfrequenz der Maus anzeigt, dass die Anästhesie reduziert werden muss. Bereiten Sie anschließend den Brustwarzenbereich für die Injektion vor, indem Sie eine rezeptfreie Haarentfernungscreme auftragen.

Warten Sie fünf Minuten und entfernen Sie dann vorsichtig die losen Haare mit dem Wattestift-Applikator. Entfernen Sie mit kreisenden Bewegungen alle Cremereste mit feuchten Papiertüchern, die mit warmem Wasser vermischt sind. Sichern Sie dann die Maus unter dem Stereoskop, indem Sie die Extremitäten vorsichtig abkleben und die Injektionsstellen mit Alkoholtupfern reinigen.

Um zu beginnen, lokalisieren Sie die zu injizierenden Brustwarzen unter dem Stereoskop. Verwenden Sie dann eine feine Mikro-Präparierpinzette, um abgestorbene Hautschüppchen zu entfernen, die die Brustwarzenöffnung bedecken. Es ist nicht notwendig, den Sauger für die Injektion zu schneiden.

Laden Sie anschließend 11 Mikroliter Injektionslösung in eine 50-Mikroliter-Spritze, die mit einer 33-Gauge-Metallnabennadel ausgestattet ist. Nach der Injektion tritt häufig ein Mikroliter der Injektionsflüssigkeit aus, was zum Endziel von 10 Mikrolitern erfolgreich injizierter Lösungen führt. Halten Sie den Sauger vorsichtig mit der feinen Pinzette fest und heben Sie ihn leicht an, um ihn für die Injektion zu positionieren.

Injizieren Sie dann 11 Mikroliter in jede Drüse im ersten und letzten Paar der Brustdrüsen, da sie ein geringeres Volumen als die mittleren Paare benötigen, um den duktilen Baum der Drüse vollständig zu füllen. Injizieren Sie anschließend 21 Mikroliter in jede Drüse im zweiten bis vierten Paar der Brustdrüsen. Die Injektionsrate sollte bei etwa 40 Mikrolitern pro Minute gehalten werden, um mögliche Schäden durch sich schnell bewegende Flüssigkeit in den duktalen Lumen zu minimieren.

Nach der Injektion. Beobachten Sie die Injektionsstelle. Es sollten keine Anzeichen eines Traumas in der Brustwarzenregion oder im umgebenden Gewebe vorhanden sein.

Schwellung im Bereich der Brustwarze. Deutet wahrscheinlich eher auf eine Injektion von Brustfettpolstern als auf eine erfolgreiche duktale Injektion hin. Nehmen Sie dann das Tier aus dem Nasenkonus und bringen Sie es zur Bergung in einen separaten Käfig.

Stellen Sie den Käfig unter eine Wärmelampe, um Unterkühlung zu verhindern und die Genesung zu unterstützen. Halten Sie das Tier alleine und überwachen Sie es genau, bis es wieder zu Bewusstsein und Mobilität gelangt. Nach Abschluss der Studie werden die Mäuse durch Zervixdislokation nach CO2-komprimiertem Gas in einer isolierten Kammer eingeschläfert.

Entfernen Sie dann die Brustdrüsen und fahren Sie mit der richtigen Probenhandhabung für die interessierende Analyse fort. Hier ist die Brustdrüse einer Maus zu sehen, bevor und nachdem sie durch die Brustwarze mit Evan's Blue Dye injiziert wurde. Der Brustwarzenbereich weist keine Schwellungen oder Gewebeschäden auf, die durch die Injektion des Farbstoffs in das Fettpolster, das die Kanäle umgibt, verursacht würden.

Der diffuse blaue Farbstoff, der im rechten Bild zu sehen ist, ist ein guter Indikator für eine korrekte Injektion. Dies kann durch die Betrachtung der gesamten Drüse oder eines Querschnitts nach der Entfernung der Drüse bestätigt werden. In der hier gezeigten Analyse des gesamten Reittiers zeigt die Evans-blaue Injektionsdrüse die gesamte Drüse, die mit Farbstoff gefüllt ist, ohne die einheimischen Entenstrukturen zu beschädigen.

Dies wird durch Carmen Dye bestätigt, das auch die duktilen Strukturen hervorhebt. Es ist auch möglich, diese Methode für die Verabreichung von therapeutischen Molekülen wie Irna an duktale Zellen zu nutzen. In dem hier gezeigten Bild, einer fluoreszenzmarkierten Irna, die auf Sichelfüllung abzielt, wurde ein nicht-essentielles Gen injiziert und dann das Gewebe 48 Stunden später abgebildet, um die Lokalisierung der Moleküle zu zeigen.

Befolgen Sie dieses Verfahren. Andere Methoden wie der SRNA-Knockdown können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Rolle eines bestimmten Gens bei der Gedächtnisentwicklung oder der Tumorgenese zu beantworten.