Visualisierung der Auswirkungen einer Früh Positive Erfahrung, taktile Stimulation, auf dendritischen Morphologie und synaptische Verbindungen mit Golgi-Cox Färbung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe von Gold-G-Cox-Färbetechniken die morphologischen Veränderungen in Neuronen zu visualisieren, die einer taktilen Stimulation in jungen Jahren folgen. Dies wird erreicht, indem die taktile Stimulation zunächst dreimal täglich vom dritten bis zum 21. postnatalen Tag verabreicht wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Tiere zu perfundieren, sobald sie das Alter der Forschung erreicht haben, und ihre Gehirne in Goldy cos-Lösung zu lagern.

Als nächstes werden die Gehirne mit Aome aufgeschnitten. Der letzte Schritt besteht darin, die Gehirne mit der GOGI-Co-Färbetechnik zu imprägnieren. Letztlich wird das GOGI-co-Verfahren zur Visualisierung einzelner Neuronen eingesetzt, was die Analyse morphologischer Veränderungen ermöglicht.

Das Schöne an der Goy-Cox-Technik ist, dass sie es uns ermöglicht, die Struktur von Neuronen zu quantifizieren und diese mit Verhaltensergebnissen zu korrelieren. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auch auf Entwicklungsstörungen, da sich die taktile Stimulation sowohl bei der verhaltensbezogenen als auch bei der anatomischen Erholung von diesen Störungen als wirksam erwiesen hat. Diese Methode kann zwar Einblicke in die Neuroanatomie von Ratten geben, kann aber auch auf andere Modellorganismen und menschliches Hirngewebe angewendet werden.

Um unser Verständnis der erlebten abhängigen Plastizität zu vertiefen, werden die Tiere nach der Geburt in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser gehalten. Jedes Rattenweibchen wird einzeln mit seinem Nachwuchs untergebracht. Um zusätzlichen Stress im Zusammenhang mit der Handhabung zu vermeiden, erhalten die Welpen ab P drei eine taktile Stimulation.

Nachdem Sie die Welpen vor der morgendlichen taktilen Stimulationssitzung gewogen haben, transportieren Sie die Welpen in ihren Heimkäfigen in einen separaten Testraum. Stellen Sie den Heimkäfig auf ein Heizkissen, das auf 24 Grad Celsius eingestellt ist. Wenn Sie bereit für die taktile Stimulation sind, entfernen Sie die Muttertiere aus ihrem Heimkäfig und setzen Sie sie in einen provisorischen Käfig mit Futter und Wasser.

Bewahren Sie die Hündin und den provisorischen Käfig im Zuchtraum auf. Verwenden Sie als Nächstes ein steifes Brett, um den Heimkäfig in zwei Hälften zu teilen. Weisen Sie dann nach dem Zufallsprinzip die Hälfte der Jungtiere aus jedem Wurf einer taktilen Stimulation zu, während die andere Hälfte als Kontrolle dient.

Markieren Sie die Hinterbeine und den Schwanz mit einem Permanentmarker, um die Gruppen zu unterscheiden, und platzieren Sie die Jungtiere in der taktilen Stimulationsgruppe auf einer Seite des Käfigs und kontrollieren Sie die Jungtiere auf der anderen. Stellen Sie einen Timer mit einem weichen, federartigen Staubtuch auf 15 Minuten. Bürsten Sie alle Welpen in der taktilen Stimulationsgruppe gleichzeitig für 15 aufeinanderfolgende Minuten.

Die jungen Rattenwelpen kuscheln sich in der Regel zusammen und scheinen in einen Tiefschlafzyklus einzutreten, was es sehr einfach macht, alle Jungtiere auf einmal zu stimulieren. Wenn die Welpen älter werden, werden sie aktiver, wobei einige Welpen spazieren gehen und Nachforschungen anstellen. Bringen Sie während der Sitzung alle umherwandernden Welpen in die Gruppe, um sicherzustellen, dass jeder Welpe die gleiche Stimulation erhält.

Nach 15 Minuten taktiler Stimulation bringen Sie die Mutter wieder in den Käfig zurück und transportieren den Käfig zurück in den Zuchtraum. Dieser Vorgang wird dreimal täglich wiederholt. Für 19 Tage Nach der letzten taktilen Stimulationssitzung entwöhnen Sie die Welpen von ihren Müttern Die Welpen werden in Käfigen mit fünf oder sechs anderen entwöhnten Tieren des gleichen Geschlechts untergebracht. Lassen Sie die Ratten unter normalen Haltungsbedingungen ungestört, bis sie das Alter der Untersuchung erreicht haben.

Die Proben werden entnommen, wenn die Tiere 100 Tage alt sind. Nach Euthanasie und intrakardialer Perfusion wird das Gehirn extrahiert. Darauf achten, dass das Kleinhirn intakt bleibt.

Legen Sie die Gehirne in eine undurchsichtige Nalgene-Flasche, die mit 20 Millilitern Goldy-Cox-Lösung gefüllt ist, wo sie 14 Tage lang aufbewahrt werden. Ersetzen Sie die Lösung nach 14 Tagen durch eine 30%ige Saccharoselösung. Bewahren Sie das Gehirn zwei bis fünf Tage lang in Saccharoselösung auf, bevor Sie es zum Schneiden schneiden.

Tupfen Sie das Gehirn trocken, bevor Sie es mit Sano-Acrylkleber auf einem Schnitttisch befestigen, um ein Reißen oder ungleichmäßiges Schneiden zu verhindern, und stellen Sie sicher, dass das gesamte Gehirn fest auf dem Tisch befestigt ist. Füllen Sie anschließend das Vibram-Reservoir mit 6%iger Saccharoselösung, bis es die Trennklinge bedeckt. Stellen Sie die Geschwindigkeit und Amplitude des Vibram auf fünf ein.

Schneiden Sie das Gehirn in 200-Mikrometer-Schnitte und legen Sie die Schnitte auf einen 2%-gelatinierten Objektträger. Achten Sie darauf, die Abschnitte während des Schneidens feucht zu halten, wenn alle interessanten Abschnitte gesammelt wurden. Drücken Sie die Abschnitte durch Druck mit angefeuchtetem Papier auf die Objektträger.

Legen Sie die Objektträger in ein Objektträgergestell und lagern Sie sie mindestens 12 Stunden, jedoch nicht länger als vier Tage, in einer Feuchtigkeitskammer. Um mit dem Färbevorgang zu beginnen, beschriften und bereiten Sie 12 Glasfärbeschalen vor. Tauchen Sie die Objektträger zunächst eine Minute lang in destilliertes Wasser.

Legen Sie anschließend die Objektträger in Ammoniumhydroxid und lassen Sie sie 30 Minuten lang im Dunkeln. Legen Sie die Objektträger nach einer weiteren Minute in destilliertem Wasser für 30 Minuten unter Lichtschutz in Kodak Fix. Legen Sie die Objektträger noch einmal in destilliertes Wasser, bevor Sie sie in einer Reihe von abgestuften Alkohollösungen dehydrieren.

Legen Sie die Objektträger nach der letzten Alkoholwäsche 15 Minuten lang in eine dritte Lösung. Zum Schluss legen Sie die Objektträger für 15 Minuten in Hemo D. Wenn Sie fertig sind, legen Sie die Deckgläser mit Paramount auf die Objektträger und lassen Sie die Objektträger an der Luft trocknen, bevor Sie sie mit einem Mikroskop untersuchen.

Hier ist ein repräsentatives Foto eines mit Golgi Cox gefärbten Parametall-Neurons in einer Ratte, die während der Entwicklung eine taktile Stimulation erhielt. Eine vergrößerte Aufnahme zeigt dendritische Stacheln an den terminalen Dendriten. Das hellere Bild links stammt von einer Ratte in der Kontrollgruppe und das dunklere Bild von einer Ratte, die eine taktile Stimulation erhielt.

Diese Grafik zeigt die durchschnittliche apikale und basler-dendritische Komplexität für Neuronen im CG-3-Bereich von erwachsenen Ratten, die während der Entwicklung entweder eine taktile Stimulation erhielten oder nicht. Wenn wir diesem Verfahren folgen, haben wir den Vorteil, dass wir, wenn wir zusätzliche Fragen stellen möchten, das gesamte Gehirn gefärbt haben und so zurückgehen und das gleiche Hirngewebe verwenden können, um diese Fragen zu beantworten. Durch die Entwicklung dieser Techniken haben wir den Weg für Forscher geebnet, die Nützlichkeit der taktilen Stimulation als Therapie zur Behandlung von Kopftraumata oder anderen Formen neurologischer Verletzungen nach ihrer Entwicklung zu erforschen.

Diese Technik ebnete den Weg für neurowissenschaftliche Forscher, ihr Potenzial bei der Heilung von Hirntraumata und Entwicklungsstörungen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Wickelwelpen die bereichernde Erfahrung der taktilen Stimulation sowie ein Mittel zur Visualisierung einzelner Neuronen und Synapsen bieten können.