Visualisierung der Auswirkungen einer Früh Positive Erfahrung, taktile Stimulation, auf dendritischen Morphologie und synaptische Verbindungen mit Golgi-Cox Färbung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe der Gold-G-Cox-Färbetechnik die morphologischen Veränderungen in Neuronen sichtbar zu machen, die auf taktile Stimulationen in der frühen Lebensphase folgen. Dies wird erreicht, indem zunächst von Tag drei nach der Geburt bis zum 21. Tag nach der Geburt dreimal täglich eine taktile Stimulation verabreicht wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Tiere nach Erreichen des Untersuchungsalters zu perfundieren und ihre Gehirne in Goldy-cos-Lösung aufzubewahren.

Anschließend werden die Gehirne mit Aome geschnitten. Der letzte Schritt besteht darin, die Gehirne mit der GOGI-Co-Färbetechnik zu imprägnieren. Letztendlich dient das GOGI-Co-Verfahren der Visualisierung einzelner Neuronen, was die Analyse morphologischer Veränderungen ermöglicht.

Die Schönheit der Goy-Cox-Technik liegt darin, dass sie es uns ermöglicht, die Struktur von Neuronen zu quantifizieren und diese mit Verhaltensergebnissen zu korrelieren. Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zu Entwicklungsstörungen, da taktile Stimulation sich sowohl bei der Verhaltens- als auch bei der anatomischen Genesung von diesen Störungen als wirksam erwiesen hat. Obwohl diese Methode Einblicke in die Neuroanatomie von Ratten ermöglicht, kann sie auch auf andere Modellorganismen und menschliches Hirngewebe angewendet werden.

Um unser Verständnis der erfahrungsabhängigen Plastizität weiterzuentwickeln, werden Tiere in einem 12-Stunden-Licht-Dunkel-Wechselzyklus gehalten und haben nach der Geburt freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Jede weibliche Ratte wird einzeln mit ihrem Nachwuchs untergebracht. Um zusätzlichen, durch Handhabung verursachten Stress zu vermeiden, erhalten die Welpen ab dem 3. Lebenstag (P3) taktile Stimulation.

Nachdem die Welpen vor der morgendlichen taktischen Stimulation gewogen wurden, transportieren Sie die Welpen in ihren Heimkäfigen in einen separaten Versuchsraum. Stellen Sie den Heimkäfig auf eine Heizplatte, die auf 24 Grad Celsius eingestellt ist. Wenn die taktile Stimulation beginnen soll, nehmen Sie die Muttertiere aus ihrem Heimkäfig und setzen sie in einen vorübergehenden Käfig mit Futter und Wasser.

Halten Sie das Dammgehege und den temporären Käfig im Zuchtraum. Verwenden Sie anschließend ein steifes Brett, um den Wurfkäfig in zwei Hälften zu teilen. Weisen Sie dann zufällig die Hälfte der Welpen aus jedem Wurf der taktilen Stimulation zu, während die andere Hälfte als Kontrolle dient.

Markieren Sie die Hinterbeine und den Schwanz mit einem Permanentstift, um die Gruppen zu unterscheiden, und platzieren Sie die Welpen der taktile Stimulation-Gruppe auf einer Seite des Käfigs und die Kontrollwelpen auf der anderen Seite. Stellen Sie einen Timer auf 15 Minuten und verwenden Sie dazu einen weichen Federwedel. Bürsten Sie alle Welpen der taktile Stimulation-Gruppe gleichzeitig über einen Zeitraum von 15 aufeinanderfolgenden Minuten.

Die jungen Rattenwelpen huddeln sich normalerweise zusammen und scheinen in einen tiefen Schlafzyklus zu verfallen, wodurch es sehr einfach ist, alle Welpen gleichzeitig zu stimulieren. Mit zunehmendem Alter werden sie aktiver, wobei einige Welpen laufen und erkunden. Während der Sitzung sollten umherirrende Welpen zur Gruppe zurückgebracht werden, um sicherzustellen, dass jeder Welpe eine gleichmäßige Stimulation erhält.

Nach 15 Minuten taktiler Stimulation kehren Sie die Mutter in den Käfig zurück und bringen den Käfig in den Zuchtraum zurück. Dieser Vorgang wird dreimal täglich wiederholt. 19 Tage nach der letzten Sitzung taktiler Stimulation werden die Welpen von ihren Müttern entwöhnt. Die Welpen werden in Käfigen mit fünf oder sechs anderen entwöhnten Tieren desselben Geschlechts untergebracht und die Ratten bleiben bis zum Untersuchungszeitpunkt ungestört unter Standardhaltungsbedingungen.

Die Proben werden gesammelt, wenn die Tiere 100 Tage alt sind. Nach der Tötung und intrakardialer Perfusion wird das Gehirn entnommen. Dabei ist darauf zu achten, dass das Kleinhirn intakt bleibt.

Legen Sie die Gehirne in eine undurchsichtige Nalgene-Flasche, die mit 20 Milliliter Goldy-Cox-Lösung gefüllt ist, und lagern Sie sie dort 14 Tage lang. Nach 14 Tagen ersetzen Sie die Lösung durch eine 30%ige Saccharose-Lösung. Bewahren Sie die Gehirne zwei bis fünf Tage in der Saccharose-Lösung auf, bevor sie geschnitten werden.

Trocknen Sie das Gehirn ab, bevor Sie es mit Sano-Acrylkleber auf einer Schneidstufe befestigen, um Einrisse oder ungleichmäßiges Schneiden zu vermeiden; stellen Sie sicher, dass das gesamte Gehirn fest auf der Stufe befestigt ist. Füllen Sie danach das Reservoir des Vibroms mit 6%iger Saccharoslösung, bis die Schneidklinge bedeckt ist. Stellen Sie die Geschwindigkeit und Amplitude des Vibroms auf fünf ein.

Schneiden Sie das Gehirn in 200 Mikrometer dicke Schnitte und legen Sie die Schnitte auf einen mit 2 % Gelatine beschichteten Objektträger. Achten Sie darauf, die Schnitte während des gesamten Schneidens feucht zu halten, bis alle gewünschten Schnitte gesammelt sind. Drücken Sie die Schnitte durch vorsichtiges Andrücken mit angefeuchtetem Filterpapier auf die Objektträger.

Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und lagern Sie sie mindestens 12 Stunden, jedoch nicht länger als vier Tage, in einer Feuchtigkeitskammer. Um mit der Färbeprozedur zu beginnen, beschriften und bereiten Sie 12 Glasfärbegläser vor. Tauchen Sie die Objektträger zunächst eine Minute lang in destilliertes Wasser ein.

Als Nächstes die Objektträger in Ammoniumhydroxid geben und 30 Minuten im Dunkeln belassen. Nach einem zusätzlichen Minute in destilliertem Wasser die Objektträger 30 Minuten unter Lichtschutz in Kodak-Fixierer legen. Die Objektträger danach erneut in destilliertes Wasser geben, bevor sie in einer Reihe von alkoholischen Lösungen mit ansteigender Konzentration dehydriert werden.

Nach dem letzten Alkoholbad die Objektträger 15 Minuten lang in eine Drittel-Lösung geben. Zuletzt die Objektträger 15 Minuten lang in Hemo D geben. Wenn fertig, mit Paraffin die Deckgläser auf die Objektträger aufbringen und die Objektträger vor der Untersuchung mit einem Mikroskop an der Luft trocknen lassen.

Hier ist eine repräsentative Photographie eines Golgi-Cox-gefärbten parametralen Neurons bei einer Ratte, die während der Entwicklung taktile Stimulation erhielt. Eine vergrößerte Aufnahme zeigt dendritische Dornen an den terminalen Dendriten. Das hellere Bild links stammt von einer Ratte aus der Kontrollgruppe, das dunklere Bild von einer Ratte, die taktile Stimulation erhielt.

Dieses Diagramm zeigt die durchschnittliche apikale und basale dendritische Komplexität von Neuronen im CG3-Areal erwachsener Ratten, die während der Entwicklung entweder taktile Stimulation erhielten oder nicht. Durch die Anwendung dieses Verfahrens ergibt sich der Vorteil, dass wir, falls zusätzliche Fragestellungen auftreten, das gesamte Gehirn gefärbt haben und somit dasselbe Gewebe erneut verwenden können, um diese Fragen zu beantworten. Durch die Entwicklung dieser Techniken haben wir den Weg dafür geebnet, dass Forschende die Nützlichkeit der taktilen Stimulation als Therapie zur Behandlung von Kopfverletzungen oder anderen Formen neurologischer Schädigungen nach deren Entstehung untersuchen können.

Diese Technik ebnete den Weg dafür, dass Neurowissenschaftler:innen ihr Potenzial bei der Behandlung von Hirnverletzungen und Entwicklungsstörungen erforschen konnten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Welpen eine anregende Erfahrung durch taktile Stimulation bietet sowie eine Methode, um einzelne Neuronen und Synapsen sichtbar zu machen.