Name: Visualisierung der Auswirkungen einer Früh Positive Erfahrung, taktile Stimulation, auf dendritischen Morphologie und synaptische Verbindungen mit Golgi-Cox Färbung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-25T09:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Erfahren Sie die Golgi-Cox-Färbung zur Visualisierung neuronaler Morphologie nach taktiler Stimulation bei Ratten. Diese Methode ermöglicht die Analyse dendritischer Veränderungen und deren Korrelation mit Verhaltensmustern.

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Diese Arbeit wird durch NSERC Zuschüsse an BK und RG finanziert. Die Autoren möchten auch Kehe Xie und Russell Hosain für ihre Golgi-Cox-Färbung Expertise danken.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der kanadischen Rat der Tierpflege durchgeführt und von der University of Lethbridge, Animal Care Committee genehmigt. 1. Zucht und taktile Stimulation <ol><li> Bestellen trächtigen Ratten von gemeinsamen Tier Lieferanten oder züchten Welpen im Haus mit Standard-Laborzuchtverfahren. </li><li> Haus alle Tiere in einer temperaturgeregelten Zuchtraum (21 ° C), auf einem 12:12 h Licht gehalten: Dunkel-Zyklus und den Zugang zu Nahrung und Wasser ad libitum. </li><li> Wenn Jungtiere geboren werden, Haus weiblichen Ratten einzeln mit ihrem Nachwuchs. </li><li> Um eine zusätzliche Belastung, sofort nach der Geburt bezogen Handhabung zu vermeiden, beginnen taktile Stimulation der Jungtiere bei P3. </li><li> Taktile Stimulation sollte drei Mal pro Tag (09.00, 13.00 und 16.00 Uhr) von P3-P21 durchgeführt werden sollte und Welpen von ihren Müttern entwöhnt werden bei P21. </li><li> Bei Verwendung einer Quer Wurf Design, die Hälfte der Welpen from jeder Wurf taktile Stimulation die andere Hälfte dient als Kontrolle zu unterziehen. Zufallsprinzip die gleiche Anzahl von männlichen und weiblichen Jungtiere zu jeder Gruppe. Um Welpen unterziehen taktile Stimulation und Kontrollen unterscheiden, markieren Sie eine Gruppe von Jungtieren mit einem Permanentmarker auf den Hinterbeinen und Schwanz. Markierung muss erneut angewendet jeden zweiten Tag werden. </li></ol> Taktile Stimulation <ol start="7"><li> Dämme entfernen aus ihrem Käfig und legen Sie sie in einem temporären Käfig mit Futter und Wasser. Halten Sie den Staudamm und temporäre Käfig in der Züchtung / Gehäuse Raum. </li><li> Wiegen Rattenjungen als Gruppe vor der morgendlichen Sitzung taktile Stimulation (09.00). Für jede Sitzung, Welpen Transport Ratte ihre Käfige zu einem separaten Testraum für die taktile Stimulation. Setzen Sie den Käfig auf einem Heizkissen, die auf 24 ° C eingestellt </li><li> Verwenden Sie einen steifen Bord, um den Käfig in zwei Hälften teilen. Zeigen Rattenjungen in den taktile Stimulation Gruppe eine Hälfte und Kontrolle Welpen in der anderen Hälfte.Stellen Sie einen Timer bis 15 min. </li><li> Mit einer weichen Feder-wie Staubwedel, Bürste alle Jungtiere in der Gruppe taktile Stimulation in der gleichen Zeit für 15 aufeinander folgenden min. Die jungen Rattenjungen (~ P3-P12) ususally sich zusammen und scheinen einen tiefen Schlaf-Zyklus geben, was es sehr einfach, alle Welpen auf einmal zu stimulieren. Da die Welpen Alter, werden sie aktiv, mit einigen Jungtieren zu Fuß und die Untersuchung während der Sitzung. Der Experimentator sollte kontinuierlich zu bewegen wandernde Jungtiere in der Gruppe zu gewährleisten, erhält jeder Welpe gleich Stimulation. </li><li> Sobald die 15 Minuten-Sitzung beendet ist, transportieren die Welpen zurück zum Zuchtraum und gibt die Mutter an den Käfig. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang drei Mal am Tag für die 19 Tage des taktilen Stimulation. Nach der letzten Sitzung taktile Stimulation bei P21, sollten die Jungtiere von ihren Müttern entwöhnt werden. Welpen sollten dann in Käfigen mit 5 oder 6 andere entwöhnt Tiere des gleichen Geschlechts untergebracht werden. </li><li> Wenn Ratten durchlaufen keine weiteren Tests, sollten sie un gelassen werdengestört, auf dem normalen Licht: Dunkel-Zyklus mit Zugang zu Nahrung und Wasser libitm (abgesehen von regelmäßigen Käfig Reinigung und Handhabung), bis sie etwa 100 Tage alt zu erreichen. Wenn andere experimentelle Manipulationen unterzogen, sollten die Tiere behandelt oder getestet werden in Übereinstimmung mit diesen Laborprotokolle. </li></ol> 2. Opfer und Golgi-Cox Färbung <ol><li> Bei etwa P100, eine Überdosis verabreichen Natrium-Pentobarbital über IP-Injektion, um die Ratten und perfuse intrakardial mit etwa 100 ml 0,9% Kochsalzlösung. </li><li> Extrahieren Sie die Köpfe, wenn die Durchblutung abgeschlossen ist. Entfernen Sie die Gehirn aus dem Schädel, Schneiden der Sehnerv unten mit Mühe, das Kleinhirn intakt zu halten; Forscher können die Riechkolben zu halten oder zu entfernen. Zeigen extrahiert Gehirne in einem undurchsichtigen Nalgene Flasche mit 20 ml Golgi-Cox-Lösung 14. </li><li> Halten Sie die Gehirne in Golgi-Cox-Lösung für 14 Tage. Nach 14 Tagen, ersetzen Sie den Golgi-Cox-Lösung mit einer 30% igen Saccharoselösung. Halten Sie die Köpfe der Saccharose-Lösung für 2-5 Tage vor dem Schneiden. </li></ol> Hinweis: Wenn Gehirne nicht innerhalb von 14 Tagen nach der Übertragung auf die Saccharose-Lösung geschnitten werden kann, muss der Forscher, die Saccharose mit einem neuen Bestand von 30% Saccharose ersetzen. Der Forscher kann die Saccharose alle zwei Wochen für 4 Monate ohne nachteilige Auswirkungen auf die Färbung zu ersetzen. <ol start="4"><li> Um Abschnitt das Gehirn, das Gehirn sollte trocken getupft und mit dem Schneidetisch mit cyanocacrylic Kleber fixiert werden. Um Reißen oder ungleichmäßige Schnitte zu vermeiden, müssen die Forscher vorsichtig sein und sicherstellen, dass das gesamte Gehirn ist fest an der Bühne gesichert. </li><li> Die Vibratoms Behälter muss mit 6% Saccharose-Lösung auf ein Niveau, das die Schneideklinge deckt gefüllt werden. Stellen Sie die Parameter Vibratoms zu einer Geschwindigkeit und Amplitude bis 5, (dem Mittelpunkt auf beiden Skalen). Schneiden Sie das Gehirn in 200 um Abschnitte und legen die Abschnitte auf einem 2% verkleistert MikroUmfang Rutsche. Achten Sie darauf, die Abschnitte im Laufe des Schnitt feucht zu halten. </li><li> Wenn alle Abschnitte von Interesse gesammelt wurden, drücken die Abschnitte auf die Objektträger durch Druck auf den Schieber mit angefeuchtetem Löschpapier. Bewahren Sie die Folien in einer Objektträgergestell in der Feuchtigkeitskammer, bis sie bereit sind, angefärbt werden. Sie sollten in der Feuchtigkeitskammer für zumindest 12 Stunden länger als 4 Tage bleiben, aber nicht. Die Folien müssen feucht sein und sollte nicht erlaubt werden, zu trocknen. </li><li> Bereiten Sie die Färbung Regiment vor Beginn der Färbung. Etiketten zwölf Glas Färbeschalen (10,7 x 8,5 x 6,8 cm) und Prozess in der folgenden Weise: <ol><li> Destilliertes Wasser - 1 min </li><li> Ammoniumhydroxid - 30 min (im Dunkeln) </li><li> Destilliertes Wasser - 1 min </li><li> Kodak Fix für Film - 30 min (im Dunkeln) </li><li> Destilliertes Wasser - 1 min </li><li> 50% Alkohol - 1 min </li><li> 70% Alkohol - 1 min </li><li> 95% Alkohol - 1 min </li><li> 100% Alcohol - 5 min </li><li> Alcohol 100% - 5 min </li><li> Lösung (1/3 Chloroform, 1/3 HemoDe, 1/3 von 100% Alkohol) - 15 min </li><li> HemoDe - 15 min </li></ol></li></ol> * Xylol in verwendet wird, ersetzen von HemoDe werden. Um eine einheitliche Qualität der Färbung zu gewährleisten, sollten neue Lösungen für jede Folie verarbeitet Rack verwendet werden. <ol start="8"><li> Nach der letzten 15 Minuten Auftauchen in HemoDe, Deckglas die Folien mit Permount. </li><li> Lassen Sie die Folien an der Luft trocknen, bevor die Prüfung mit einem Mikroskop. </li></ol>

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<li>Muhammad, A., Hossain, S., Pellis, S., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tactile+stimulation+during+development+attenuates+amphetamine+sensitization+and+structurally+reorganizes+prefrontal+cortex+and+striatum+in+a+sex-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tactile stimulation during development attenuates amphetamine sensitization and structurally reorganizes prefrontal cortex and striatum in a sex-dependent manner.</a> Behavioral Neuroscience. 125 (2), 161-174 (2011).</li>
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<li>Glaser, E. M., van der Loos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thick+brain+sections+by+obverse-reverse+computer+microscopy%3A+Application+of+a+new%2C+high+clarity+Golgi-Nissl+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: Application of a new, high clarity Golgi-Nissl stain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4, 117-125 (1981).</li>
<li>Gibb, R., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+vibratome+sectioning+of+Golgi-Cox+stained+whole+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 79, 1-4 (1998).</li>
<li>Meaney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+care%2C+gene+expression%2C+and+the+transmission+of+individual+differences+in+stress+reactivity+across+generations%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Maternal care, gene expression, and the transmission of individual differences in stress reactivity across generations.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 1161-1192 (2001).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass wir keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Aufgrund der offenen Plastizität des sich entwickelnden Gehirns, ist es wichtig, dass die experimentellen Verfahren, die früheren Erfahrungen werden sorgfältig überprüft und wird versucht, für alle dazwischenliegenden Variablen zu steuern. Aus diesem Grund wird ein Quer Wurf-Design während der taktile Stimulation Verfahren eingesetzt, um sicherzustellen, dass Welpen erhalten ähnliche Erfahrungen in allen anderen Bereichen der Entwicklung. Darüber hinaus ist es auch wichtig, dass mehrere Jungtiere aus mehreren Würfen sind für die Analyse ausgewählt, um die Möglichkeit, dass Effekte resultieren aus einer Vorspannung in einem einzigen Wurf Welpen oder zu vermeiden. Taktile Stimulation wird angenommen, dass die natürlich vorkommende mütterliche Verhalten nachahmen, Lecken und Putzen, die vermutlich von Vorteil für Nachkommen Entwicklung zu sein. Obwohl frühere Forschung hat betont, die erste Woche des Lebens (P0-P7), um eine kritische Periode für Lecken und Putzen 16 sein, nach 18 Tagen der ta die schiere Größe der Veränderung identifiziertctile Stimulation kann bedeuten, dass, obwohl sensiblen Zeiten gibt, ist längere Belichtungs überlegen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Jungtiere Empfangen taktile Stimulation in diesem experimentellen Paradigma erleben auch lecken und Pflege von ihren Müttern, damit die taktile Stimulation ist zusätzlich zu den normalen Stimulation durch die Mutter verabreicht. Schließlich muss man sich auch bewusst Region abhängige Änderungen. Obwohl taktile Stimulation während der Entwicklung erhöht dendritischen Komplexität im präfrontalen Kortex, bedeutet dies nicht garantieren, dass strukturelle Veränderungen dieser Art wird sich in allen Hirnregionen sein. Es ist möglich, dass neuronale Morphologie in anderen Hirnregionen wie dem parietalen Kortex, würde in einem auffallend andere Art und Weise auf die gleiche Erfahrung zu reagieren. , Weil die taktile Stimulation Verfahren ist leicht verwaltet und stellt keine Gefahr für den Nachwuchs oder Absetzbecken, die das Potenzial, als ein wertvolles Werkzeug für viele Forschungsstudien zur Verbesserung der Entwicklung zum Ziel zu dienen hat jedochal Ziele. Bezüglich Golgi-Cox-Färbung von Hirngewebe sind die entscheidenden Schritte zur erfolgreichen Visualisierung von neuronalen Zellen, wie folgt: 1) Es muss eine ausreichende Durchblutung des Gehirns mit Kochsalzlösung sein. Falsche oder unzureichende Perfusion der Hirngewebe führt zu Blutgefäß-Artefakte, die es schwierig, tatsächlich neuronale Zellen sichtbar durch das Labyrinth der Blutgefäße, aber auch kompliziert die Fähigkeit, Neuronen zu fotografieren Malerei zu machen. 2) perfundierten Gehirn sollte in Golgi-Cox-Lösung und Saccharose-Lösung im Dunkeln gelagert werden. Speichern des Hirngewebe im Dunkeln reduziert die Hintergrundfärbung des Gewebes, was wiederum die Wahrscheinlichkeit des erfolgreichen Visualisierung Qualität neuronalen Zellen. 3) Das Hirngewebe ist in Saccharose-Lösung nach der 14 Tage Lagerung im Golgi-Cox-Lösung gespeichert. Wenn das Gewebe in 30% Saccharose-Lösung für 2-5 Tage eingetaucht, sind die Köpfe biegsamer bewegend und Reißen der Abschnitte verhindert, wennSchneiden. Es ist wichtig, Hirngewebe von der Saccharose-Lösung für eine erhöhte Zeitperioden verbleibenden verhindern (es sei denn, die Saccharoselösung kontinuierlich durch frische Lösung ersetzt), weil längerer Lagerung in Saccharose verringert die Qualität der Färbung. 4) Schließlich, sobald Folien wurden gebeizt und Abdeckung gerutscht, sollten sie genügend Zeit, um vor der Anzeige mit einem Mikroskop trocknen gegeben werden. Wenn Folien dürfen nicht ausreichend trockene Luft, kann das Gewebe zu verdunkeln, wodurch erfolgreiche Visualisierung von kortikalen Neuronen. Stabile Änderungen in psychologische Funktion und Verhaltens-Reaktionen, die in Reaktion auf Erfahrungen auftreten, werden vermutlich durch Reorganisation neuronaler Morphologie und synaptischer Verbindungen 17 erleichtert werden. Da diese Strukturänderungen eine messbare Ressource für erfahrungsabhängige Plastizität, ist die Verwendung eines zuverlässigen Färbeverfahren wichtig. Diese Vibratoms basierend Golgi-Cox Färbeverfahren bietet zuverlässige Fleckening von feinen Ästen und dendritischen Dornen, die nicht offensichtlich sein, kann mit anderen Protokollen wie Celloidin-Einbettung. Die Besonderheit des Golgi-Cox-Verfahren beruht auf seiner Fähigkeit, nur einen kleinen Teil der neuronalen Elemente (1-10%), die Rückverfolgung einzelner Neuronen für große Entfernungen ermöglicht färben. Trotz der Tatsache, dass nur ein kleiner Bruchteil der Neuronen mit dem Farbstoff imprägniert, Zellen, sichtbar gemacht werden, halten alle Funktionen, einschließlich Zellkörper, Dendriten, Axonen und Dendriten. Wenn darüber hinaus das Färbungsverfahren korrekt durchgeführt wird, werden die gefärbten Zellen zeichnen sich klar und deutlich gegen einen transparenten Hintergrund, weil andere kortikalen Strukturen bleiben ungefärbt und transparent. Aufgrund der Erkenntnis, dass die anhaltende Veränderungen in der äußeren Funktionieren muß die Plastizität des Nervensystems, dh die Fähigkeit von Neuronen, ihre Struktur und Konnektivität zu ändern, stellt die Golgi-Cox Färbeverfahren Forscher mitzuverlässige Technik zu visualisieren und quantifizieren diese Plastizität.

Obwohl es viele gemeldet und genutzt Techniken für die Prüfung der negativen frühen Erfahrungen auf die Hirnreifung, wie perinatalen Stress 1,2, sensorische Deprivation 3 und Medikamententoxizität 4, gibt es eingesetzt, um die Auswirkungen der positiven Erfahrungen nur sehr wenige Methoden untersuchen diese Zeit. Abgesehen von ökologischen Bereicherung ist taktile Stimulation einer der wenigen Gehirn Verbesserung Behandlungen mit nachgewiesener Wirkung 5. Taktile Stimulation ist eine Methode der sensorischen Stimulation der Haut, die das mütterliche Verhalten nachahmt, Ratte, Lecken und Putzen. Die allgemeine Akzeptanz als eine positive Manipulation ergibt sich aus Studien, dass taktile Stimulation verbessert die Reifung von Früh-und Neugeborenen-Ratten 6. Darüber hinaus Forschung im Labor Meaney 7 hat gezeigt, dass höhere Mütter lecken und Pflege sind, um positive Ergebnisse bei den Nachkommen verbunden. Aufgrund tiese positive Einflüsse, taktile Stimulation rasch entwickelte sich zu einem Sanierungsstrategie zur Minderung der Angst 8, die Verbesserung der Ergebnisse mit Hirnverletzung 9-11 zugeordnet und Dämpfen Drogen Sensibilisierung 12 ausgerichtet. Als solches ist taktile Stimulation eine wertvolle Technik für die Förderung der positiven ersten Erfahrungen, mit einem bewährten Fähigkeit, dramatisch neu zu organisieren neuronale Morphologie und synaptische Konnektivität des sich entwickelnden Gehirns. Um zu untersuchen und zu quantifizieren, Veränderungen in der neuronalen Morphologie, ist es notwendig, intakten Neuronen zu visualisieren. Der Golgi-Cox-Färbung Verfahren ist eine Modifikation von Camillo Golgi der Technik, die in den späten 1800er Jahren, die diskrete Färbung von einer kleinen Anzahl von Neuronen komplette 13 liefert. Obwohl das Verfahren scheint Neuronen zufällig und Reproduzierbarkeit wird allgemein als Hauptfehler, den kleinen Imprägnierungsrate ermöglicht die Visualisierung der gesamten neuronalen Elements, einschließlich ce genannten Fleckll Körper, Dendriten dendritischen Dornen, und Axone. Ebenso hat die erforderliche Zeit, um eine vorgegebene Gehirn mit Golgi-Lösung zu imprägnieren auch als Gang zitiert. Da jedoch einmal Färbung abgeschlossen Gewebe kann unbegrenzt aufbewahrt werden, und die Zeit zwischen der Durchblutung des Gehirns und Visualisierung von Neuronen mit einem Mikroskop kann in weniger als 21 Tagen durchgeführt werden, ist die Zeit nicht unvernünftig. Zusätzlich mit kleinen Änderungen zum Protokoll, Golgi-Cox-Färbung kann effektiv genutzt werden, um Gehirn von Nagetieren aus allen Altersgruppen zu imprägnieren. Da die Veränderungen auf der strukturellen Ebene haben, anhaltende Änderungen an Verhaltens-und psychologische Funktionieren gebracht worden, stellt der Golgi-Cox-Färbetechnik Forschern ein wertvolles Werkzeug, um Neuroplastizität messen.

<table><tbody><tr><td>Kaliumdichromat</td><td>Fisher</td><td>P188</td><td></td></tr><tr><td>Quecksilberchlorid</td><td>Fisher</td><td>M1561</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchromat</td><td>Fisher</td><td>P220</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid</td><td>Fisher</td><td>A669-500</td><td></td></tr><tr><td>Kodak Rapid Fix</td><td>Vistek</td><td>Kodak 146 4016</td><td></td></tr><tr><td>EtOH-95 & Wasserfreie</td><td>kommerzielle Alkohole</td><td>Keine Katzennummern</td><td>Alle anderen Et-OH sind Verdünnungen</td></tr><tr><td>Swiffers - Weiche federartige Staubtücher</td><td>Safeway</td><td></td><td>Kann in den meisten Lebensmittelgeschäften gefunden werden</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9378</td><td></td></tr><tr><td>HemoDe</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>23410</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>Sp15</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>VWR</td><td>160004-365</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>VWR</td><td>062011-9</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung der auswirkungen einer früh positive erfahrung, taktile stimulation, auf dendritischen morphologie und synaptische verbindungen mit golgi-cox färbung

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

Um längerfristige Verhaltensänderungen zu erzeugen, muss Erfahrungen produzieren stabile neuronale Morphologie und synaptische Verbindungen. Taktile Stimulation ist eine positive Erfahrung, die frühen ahmt Müttern lecken und Pflege bei der Ratte. Offenlegen von Rattenjungen zu dieser positiven Erfahrung kann leicht und kostengünstig durch den Einsatz hoch zugänglichen Materialien, wie ein Hausstaubtuch abgeschlossen sein. Mit einem Kreuz-Wurf-Design, sind Jungtiere entweder strich oder ungestört, für 15 min, drei Mal pro Tag während der perinatalen Periode. Um die neuroplastische Veränderungen zu dieser positiven ersten Erfahrungen im Zusammenhang zu messen, wird Golgi-Cox-Färbung von Hirngewebe eingesetzt. Aufgrund der Tatsache, dass Golgi-Cox Imprägnieren färbt eine diskrete Anzahl von Neuronen und nicht alle der Zellen, Färbung von Nagetiergehirn mit Golgi-Cox-Lösung ermöglicht die Visualisierung der gesamten neuronalen Elemente, einschließlich der Zellkörper, Dendriten, Axonen, und dendritischen Dornen. Das Färbeverfahren is durchgeführt über mehrere Tage und erfordert, dass der Forscher achten auf Details. Sobald jedoch Färbung abgeschlossen ist, das gesamte Gehirn wurde imprägniert und kann unbegrenzt fortlaufenden Analyse konserviert werden. Daher ist Golgi-Cox-Färbung eine wertvolle Ressource für das Studium erfahrungsabhängige Plastizität.

Wenn diese Färbungsverfahren wurde entsprechend folgt, wird konsistente und einheitliche Färbung von Dendriten und Dornen erzeugt. Siehe Abbildung 1 für eine Darstellung der Golgi-Cox neuronale Färbung. Dieses Verfahren erzeugt Färbung, die vergleichbar mit der neu in-vitro-Methoden entwickelt und kann gestatten Visualisierung von dendritischen Felder, die unterbrechungsfreie folgende Gewebeeinbettung sind, ist. Das Vibratom basierende Technik für Golgi-Cox-Färbung wurde festgestellt, weiter verbreitet Färbung der endständigen Zweige und pyramidalen Neuronen zu erzeugen, als die Färbung mit entweder Celloidin eingebettet und Kryostat-geschnittenen Gewebes 15. Da außerdem dieses Verfahren der Färbung imprägniert das gesamte Gehirn, alle Abschnitte können entweder sofort oder in der Zukunft zu analysieren. Da die Lage der morphologischen Veränderung ist es nicht immer offensichtlich, wenn Erzeugen eines ursprünglichen Hypothese, ermöglicht dieses Verfahren für die Erforschung weiterer Hirnregionen eind verhindert Entsorgung von Gewebe, das in der Zukunft nützlich sein können. Diese Färbung Methode für zuverlässige Anfärbung von allen Alters Rattenhirnen (P0-Alter) verwendet werden. Wenn jedoch Färbung junge Gehirne (&lt;1 g), das Gehirn nur in der Golgi-Cox Lösung bleiben 6 Tage, anstatt der 14 Tage erwachsenen Gehirn empfohlen, alle anderen Verfahren konstant gehalten werden. Die Hauptschwierigkeit, die während dieser Golgi-Cox Färbung auftreten können, ist die Unfähigkeit, hochwertige Färbung der zentralen Hirnregionen, einschließlich des Thalamus zu produzieren. Das gesamte Gehirn gleichzeitig imprägniert, kann zentralen Regionen empfangen ideale Konzentrationen von Flecken. Trotz dieser Erkenntnis, die Golgi-Cox-Technik produziert außergewöhnliche Färbung der subkortikalen Regionen wie dem Hippocampus und Striatum. Eine letzte Einschränkung des Verfahrens ergibt sich aus einer unvollständigen Entfernung von Blut aus dem Gehirn während der Perfusion Prozess. Blut kann zu Artefakten in dem Hirngewebe zu erzeugendas macht es schwierig zu fotografieren und verfolgen die Neuronen. Golgi-Cox Färbetechniken eine zuverlässige Messung der dendritischen Morphologie und Neuroanatomie, die nützlich für eine umfangreiche Reihe von Studien entwickelt, um Veränderungen auf neuronaler Ebene zu untersuchen ist. Bei der Untersuchung der neuronalen Struktur im präfrontalen Kortex folgenden taktile Stimulation in der frühen postnatalen Phase zeigte Golgi-Cox-Färbung dramatischen Anstieg der dendritischen Komplexität. Anatomischen Veränderungen frühzeitig taktile Stimulation Zusammenhang kann visuell durch Vergleich Wirbelsäule Dichte von pyramidalen Neuronen aus einer Kontrollratte, Neuronen von einer Ratte, die taktile Stimulation unterpyramiden (siehe Fig. 1) nachgewiesen werden. Außerdem können Parameter wie dendritische Verzweigung, dendritische Länge und Wirbelsäule Dichte berechnet und statistisch analysiert, um kontinuierliche Daten über Tiere verglichen werden können erzeugen. Um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen, sollte auf Analyse Uhr durchgeführt werdenINDESTLISTE von drei Tieren pro Behandlungsgruppe und etwa fünf Neuronen pro Hemisphäre sollte zufällig für jede Gehirnregion unter Analyse ausgewählt werden. den dendritischen Komplexität (Stacheln / um x um von Dendriten) von Tieren, die taktile Stimulation und Tiere, die nicht taten empfangen Abbildung 2 zeigt . In den beiden apikalen und basilar Felder der Neuronen aus dem mPFC (Cg3) analysiert, führte taktile Stimulation der Proliferation von neuronalen Parameter. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50694/50694fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. A. Repräsentative Foto eines Golgi-Cox gefärbten Pyramidenzelle aus der Schicht III der Bereich Cg3 in einer Ratte, die taktile Stimulation während der Entwicklung eingegangen. B. Repräsentative vergrößert (1.000 X) Foto von dendritischen Dornen auf den Terminal-Dendriten in der basilaris Bereich der Cg3 , das hellere Bild links ist für eine Ratte in der Kontrollgruppe und den dunkleren Bild auf der right ist von einer Ratte, die taktile Stimulation erhalten. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50694/50694fig2.jpg" /> 2. Illustrative Darstellung der durchschnittlichen apikalen dendritischen basilaris und Komplexität (Stacheln / &amp;mgr; m × &amp;mgr; m) für die Neuronen in der Cg3 Bereich von erwachsenen Ratten, die entweder empfangen taktile Stimulation während der Entwicklung oder nicht (* p &lt;0,01).

Dieser Beitrag beschreibt die Verfahren für die taktile Stimulation von Rattenjungen und anschließende Golgi-Cox-Färbung der neuronalen Morphologie. Taktile Stimulation ist eine positive Erfahrung, die in der Perinatalperiode durch Streicheln Welpen mit einem Haushalts duster verwaltet wird. Golgi-Färbung cox ist ein zuverlässiges Verfahren ermöglicht die Visualisierung der gesamten Neuronen.

Visualisierung der Auswirkungen einer Früh Positive Erfahrung, taktile Stimulation, auf dendritischen Morphologie und synaptische Verbindungen mit Golgi-Cox Färbung

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe der Gold-G-Cox-Färbetechnik die morphologischen Veränderungen in Neuronen sichtbar zu machen, die auf taktile Stimulationen in der frühen Lebensphase folgen. Dies wird erreicht, indem zunächst von Tag drei nach der Geburt bis zum 21. Tag nach der Geburt dreimal täglich eine taktile Stimulation verabreicht wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Tiere nach Erreichen des Untersuchungsalters zu perfundieren und ihre Gehirne in Goldy-cos-Lösung aufzubewahren.Anschließend werden die Gehirne mit Aome geschnitten. Der letzte Schritt besteht darin, die Gehirne mit der GOGI-Co-Färbetechnik zu imprägnieren. Letztendlich dient das GOGI-Co-Verfahren der Visualisierung einzelner Neuronen, was die Analyse morphologischer Veränderungen ermöglicht.Die Schönheit der Goy-Cox-Technik liegt darin, dass sie es uns ermöglicht, die Struktur von Neuronen zu quantifizieren und diese mit Verhaltensergebnissen zu korrelieren. Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zu Entwicklungsstörungen, da taktile Stimulation sich sowohl bei der Verhaltens- als auch bei der anatomischen Genesung von diesen Störungen als wirksam erwiesen hat. Obwohl diese Methode Einblicke in die Neuroanatomie von Ratten ermöglicht, kann sie auch auf andere Modellorganismen und menschliches Hirngewebe angewendet werden.Um unser Verständnis der erfahrungsabhängigen Plastizität weiterzuentwickeln, werden Tiere in einem 12-Stunden-Licht-Dunkel-Wechselzyklus gehalten und haben nach der Geburt freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Jede weibliche Ratte wird einzeln mit ihrem Nachwuchs untergebracht. Um zusätzlichen, durch Handhabung verursachten Stress zu vermeiden, erhalten die Welpen ab dem 3. Lebenstag (P3) taktile Stimulation.Nachdem die Welpen vor der morgendlichen taktischen Stimulation gewogen wurden, transportieren Sie die Welpen in ihren Heimkäfigen in einen separaten Versuchsraum. Stellen Sie den Heimkäfig auf eine Heizplatte, die auf 24 Grad Celsius eingestellt ist. Wenn die taktile Stimulation beginnen soll, nehmen Sie die Muttertiere aus ihrem Heimkäfig und setzen sie in einen vorübergehenden Käfig mit Futter und Wasser.Halten Sie das Dammgehege und den temporären Käfig im Zuchtraum. Verwenden Sie anschließend ein steifes Brett, um den Wurfkäfig in zwei Hälften zu teilen. Weisen Sie dann zufällig die Hälfte der Welpen aus jedem Wurf der taktilen Stimulation zu, während die andere Hälfte als Kontrolle dient.Markieren Sie die Hinterbeine und den Schwanz mit einem Permanentstift, um die Gruppen zu unterscheiden, und platzieren Sie die Welpen der taktile Stimulation-Gruppe auf einer Seite des Käfigs und die Kontrollwelpen auf der anderen Seite. Stellen Sie einen Timer auf 15 Minuten und verwenden Sie dazu einen weichen Federwedel. Bürsten Sie alle Welpen der taktile Stimulation-Gruppe gleichzeitig über einen Zeitraum von 15 aufeinanderfolgenden Minuten.Die jungen Rattenwelpen huddeln sich normalerweise zusammen und scheinen in einen tiefen Schlafzyklus zu verfallen, wodurch es sehr einfach ist, alle Welpen gleichzeitig zu stimulieren. Mit zunehmendem Alter werden sie aktiver, wobei einige Welpen laufen und erkunden. Während der Sitzung sollten umherirrende Welpen zur Gruppe zurückgebracht werden, um sicherzustellen, dass jeder Welpe eine gleichmäßige Stimulation erhält.Nach 15 Minuten taktiler Stimulation kehren Sie die Mutter in den Käfig zurück und bringen den Käfig in den Zuchtraum zurück. Dieser Vorgang wird dreimal täglich wiederholt. 19 Tage nach der letzten Sitzung taktiler Stimulation werden die Welpen von ihren Müttern entwöhnt. Die Welpen werden in Käfigen mit fünf oder sechs anderen entwöhnten Tieren desselben Geschlechts untergebracht und die Ratten bleiben bis zum Untersuchungszeitpunkt ungestört unter Standardhaltungsbedingungen.Die Proben werden gesammelt, wenn die Tiere 100 Tage alt sind. Nach der Tötung und intrakardialer Perfusion wird das Gehirn entnommen. Dabei ist darauf zu achten, dass das Kleinhirn intakt bleibt.Legen Sie die Gehirne in eine undurchsichtige Nalgene-Flasche, die mit 20 Milliliter Goldy-Cox-Lösung gefüllt ist, und lagern Sie sie dort 14 Tage lang. Nach 14 Tagen ersetzen Sie die Lösung durch eine 30%ige Saccharose-Lösung. Bewahren Sie die Gehirne zwei bis fünf Tage in der Saccharose-Lösung auf, bevor sie geschnitten werden.Trocknen Sie das Gehirn ab, bevor Sie es mit Sano-Acrylkleber auf einer Schneidstufe befestigen, um Einrisse oder ungleichmäßiges Schneiden zu vermeiden; stellen Sie sicher, dass das gesamte Gehirn fest auf der Stufe befestigt ist. Füllen Sie danach das Reservoir des Vibroms mit 6%iger Saccharoslösung, bis die Schneidklinge bedeckt ist. Stellen Sie die Geschwindigkeit und Amplitude des Vibroms auf fünf ein.Schneiden Sie das Gehirn in 200&nbsp;Mikrometer dicke Schnitte und legen Sie die Schnitte auf einen mit 2&nbsp;% Gelatine beschichteten Objektträger. Achten Sie darauf, die Schnitte während des gesamten Schneidens feucht zu halten, bis alle gewünschten Schnitte gesammelt sind. Drücken Sie die Schnitte durch vorsichtiges Andrücken mit angefeuchtetem Filterpapier auf die Objektträger. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und lagern Sie sie mindestens 12 Stunden, jedoch nicht länger als vier Tage, in einer Feuchtigkeitskammer. Um mit der Färbeprozedur zu beginnen, beschriften und bereiten Sie 12 Glasfärbegläser vor. Tauchen Sie die Objektträger zunächst eine Minute lang in destilliertes Wasser ein.Als Nächstes die Objektträger in Ammoniumhydroxid geben und 30 Minuten im Dunkeln belassen. Nach einem zusätzlichen Minute in destilliertem Wasser die Objektträger 30 Minuten unter Lichtschutz in Kodak-Fixierer legen. Die Objektträger danach erneut in destilliertes Wasser geben, bevor sie in einer Reihe von alkoholischen Lösungen mit ansteigender Konzentration dehydriert werden.Nach dem letzten Alkoholbad die Objektträger 15 Minuten lang in eine Drittel-Lösung geben. Zuletzt die Objektträger 15 Minuten lang in Hemo D geben. Wenn fertig, mit Paraffin die Deckgläser auf die Objektträger aufbringen und die Objektträger vor der Untersuchung mit einem Mikroskop an der Luft trocknen lassen.Hier ist eine repräsentative Photographie eines Golgi-Cox-gefärbten parametralen Neurons bei einer Ratte, die während der Entwicklung taktile Stimulation erhielt. Eine vergrößerte Aufnahme zeigt dendritische Dornen an den terminalen Dendriten. Das hellere Bild links stammt von einer Ratte aus der Kontrollgruppe, das dunklere Bild von einer Ratte, die taktile Stimulation erhielt.Dieses Diagramm zeigt die durchschnittliche apikale und basale dendritische Komplexität von Neuronen im CG3-Areal erwachsener Ratten, die während der Entwicklung entweder taktile Stimulation erhielten oder nicht. Durch die Anwendung dieses Verfahrens ergibt sich der Vorteil, dass wir, falls zusätzliche Fragestellungen auftreten, das gesamte Gehirn gefärbt haben und somit dasselbe Gewebe erneut verwenden können, um diese Fragen zu beantworten. Durch die Entwicklung dieser Techniken haben wir den Weg dafür geebnet, dass Forschende die Nützlichkeit der taktilen Stimulation als Therapie zur Behandlung von Kopfverletzungen oder anderen Formen neurologischer Schädigungen nach deren Entstehung untersuchen können.Diese Technik ebnete den Weg dafür, dass Neurowissenschaftler:innen ihr Potenzial bei der Behandlung von Hirnverletzungen und Entwicklungsstörungen erforschen konnten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Welpen eine anregende Erfahrung durch taktile Stimulation bietet sowie eine Methode, um einzelne Neuronen und Synapsen sichtbar zu machen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Zahlreiche neuere Studien haben Mutationen in synaptischen Proteinen mit Hirnerkrankungen assoziiert identifiziert. Primär kultivierte kortikalen Neuronen bieten eine große Flexibilität bei der Prüfung der Auswirkungen dieser Krankheit assoziierte Proteine ​​auf dendritischen Dorn Morphologie und Motilität.

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Wir beschreiben zwei Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung der dendritischen Arborisierung im Hippocampus von Mausmodellen: Echtzeit- und erweiterte Tiefenschärfebildgebung. Während die erste Methode eine ausgefeilte topographische Verfolgung und Quantifizierung des Ausmaßes der Verzweigung ermöglicht, ermöglicht die zweite eine schnelle Visualisierung des dendritischen Baumes.

Bewertung der dendritischen Verzweigung im Gyrus dentatus des Hippocampus-Region an der Maus

Dieses Video zeigt das Kraniotomieverfahren, das die chronische Bildgebung von Neuronen im retrosplenialen Kortex der Maus mittels in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie in der transgenen Thy1-GFP-Linie ermöglicht. Dieser Ansatz wird mit der Injektion von mCherry-exprimierenden Adeno-assoziierten Viren in den dorsalen Hippocampus kombiniert. Diese Techniken ermöglichen eine langfristige Überwachung der erfahrungsabhängigen strukturellen Plastizität bei RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

Wir präsentieren ein Protokoll der Golgi-Cox-Färbung in dicken Hirnschnitten für die Verwendung, um Neuronen mit langen Dendritenbäume innerhalb einzelner Gewebeproben enthalten ist, zu visualisieren. Zwei Varianten dieses Protokolls werden auch vorgestellt, Kresylviolett Gegenfärbung einzubeziehen und das Einfrieren von nicht verarbeiteten Gehirne für die Langzeitlagerung.

Imaging Neurone innerhalb Dickhirnschnitten Mit der Golgi-Cox-Methode

Hier stellen wir ein Golgi-Cox-Protokoll ausführlich vor. Diese zuverlässige Gewebe-Fleck-Methode ermöglicht eine qualitativ hochwertige Beurteilung der Cytoarchitektur im Hippocampus und im gesamten Gehirn mit minimaler Fehlersuche.

Bewertung der Hippocampalen Dendritischen Komplexität bei gealterten Mäusen unter Verwendung der Golgi-Cox-Methode

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die gleichzeitige Darstellung von Thalamocortical Axon Verzweigung und Synapse Bildung in organotypischen Kokulturen des Thalamus und Großhirnrinde. Individuelle Thalamocortical Axone und ihre präsynaptischen Terminals werden durch eine einzelne Zelle Elektroporation Technik mit DsRed und GFP-Tags Synaptophysin visualisiert.

Visualisierung von Thalamocortical Axon Verzweigung und Synapse Bildung in organotypischen Kokulturen

Die Kombination von Transmissions-Elektronenmikroskopie und in der Gebärmutter Transduktion ist ein leistungsfähiger Ansatz für das Studium der morphologischer Veränderungen in den feinen Ultrastruktur des Nervensystems während der Entwicklung. Diese kombinierte Methode ermöglicht tiefe Einblicke in Änderungen in Strukturdetails Neuroplastizität in Bezug auf ihre topographische Darstellung zugrunde liegen.

Bewertung der Ultrastrukturforschung Neuroplastizität Parameter nach In Utero Transduktion von Entwicklungsländern Mausgehirn und Rückenmark

Hier beschreiben wir eine Methode zur Visualisierung der Synaptogenese von Körnerneuronen im Kleinhirn der Maus über den zeitlichen Verlauf der postnatalen Gehirnentwicklung, wenn diese Zellen ihre synaptischen Strukturen verfeinern und Synapsen bilden, um sich in den gesamten Gehirnkreislauf zu integrieren.

Verwendung der postnatalen In-vivo-Elektroporation zur Untersuchung der Morphologie von Kleinhirngranula-Neuronen und der Synapsenentwicklung

Das Protokoll beschreibt eine Modifikation der schnellen Golgi-Methode, die an jeden Teil des Nervensystems angepasst werden kann, zur Färbung von Neuronen im Hippocampus und im medialen präfrontalen Kortex der Ratte.

Schneller Golgi-Fleck für die Visualisierung der dendritischen Wirbelsäule im Hippocampus und im präfrontalen Kortex

Wir beschreiben hier Methoden zur Induktion und Analyse des olfaktorischen erfahrungsabhängigen Umbaus von synaptischen Glomeruli des Antennenlappens im juvenilen Gehirn von Drosophila .

Erfahrungsabhängiger Umbau der synaptischen Konnektivität von olfaktorischen sensorischen Neuronen im juvenilen Gehirn in einer kritischen Phase im frühen Leben

Erfahren Sie die Golgi-Cox-Färbung zur Visualisierung neuronaler Morphologie nach taktiler Stimulation bei Ratten. Diese Methode ermöglicht die Analyse dendritischer Veränderungen und deren Korrelation mit Verhaltensmustern.

Visualisierung der Auswirkungen einer Früh Positive Erfahrung, taktile Stimulation, auf dendritischen Morphologie und synaptische Verbindungen mit Golgi-Cox Färbung (Video) | JoVE Journal

Visualisierung der Auswirkungen einer Früh Positive Erfahrung, taktile Stimulation, auf dendritischen Morphologie und synaptische Verbindungen mit Golgi-Cox Färbung

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