Name: Gesichtstransplantation in Xenopus laevis Embryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Lernen Sie die Gesichtstransplantation von EAD-Gewebe bei Xenopus laevis Embryonen für die Entwicklungsbiologie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung kraniofazialer Signalwechselwirkungen.

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Wir danken Radek Sindelka für seine Hilfe und Cas Bresilla für die Unterstützung mit Froschhaltung und Embryo Vorbereitung. Diese Arbeit wurde durch die NIH über die Erteilung R01DE021109 zu HLS Laura Jacox finanziert wurde von der Herschel Smith Graduiertenstipendium an der Harvard University und einen F30 einzelner Stipendien Zuschuss F30DE022989-01 durch die NIDCR finanziert.

1. Vorbereiten Reagenzien <ol><li> 10x MBS: Bereiten 1 l 10x Geändert Barths Saline (MBS)-Lösung 17. Siehe Tabelle 1, Reagenzien Bestandteile und Anweisungen. Verwenden Sie destilliertes Wasser für alle Lösungen. Mischen Sie in einem Becherglas mit einem Rührstab, bis zur vollständigen Auflösung. Alle Lösungen sollten bei Raumtemperatur durchgeführt werden. </li><li> 1x MBS: Verdünnen Sie 100 ml 10x MBS-Lösung in 900 ml destilliertem Wasser auf 1 l 1x MBS zu machen. Hinzufügen von 0,7 ml 1 M CaCl 2-Lösung. </li><li> 0,1 x MBS: 1x verdünnen MBS auf 1 L 0,5 x MBS-Lösung und 2 L 0,1 x MBS-Lösung herzustellen. Um 1 L 0,1 x MBS-Lösung, 1 ml 10 mg / ml Gentamycin-Lösung. Die MBS-Lösung mit 0,1 × Gentamycin wird für langfristige Embryokultur verwendet werden. </li><li> Ficoll / MBS: In 15 g Ficoll 400 bis 500 ml 0,5 x MBS-Lösung. Gründlich mischen. Fügen Sie einen Rührstab und mischen, bis Ficoll vollständig aufgelöst ist (mehrere Stunden). </li><li> 70% Ethanol: Verdünnung 100% Ethanol auf 70% Ethanol mitdestilliertes Wasser. </li></ol> 2. Vorbereiten Glas Betriebs Werkzeuge <ol><li> Nadel-Vorbereitung: Last Kapillarrohr in eine Nadel Magnet. <ol><li> Ziehen Sie die Nadeln nach den in Tabelle 2 gezeigten Einstellungen: Nadelzieher-Einstellungen. Die Einstellungen sind für eine Sutter Instrument Co. Modell P-80/PC Mikropipette Puller und Kapillar-Schläuche, wie in der Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte beschrieben. Allerdings sind diese spezifischen Einstellungen der Sutter Nadel Puller, und müssen für andere Maschinen angepasst werden. Die Einstellungen können über eine Rampe Test bestimmt werden, wie von dem Hersteller der Maschine festgelegt. </li><li> Ziehen 4-6 Nadeln in Vorbereitung für das Verfahren. Die Nadeln sollten gebrochen werden, so dass die flexible, haarähnlichen Abschnitt der Glasspitze vollständig entfernt wird, was typischerweise 2-3 mm lang ist. Die Spitze muß relativ starr, aber dennoch schmal genug ist, um als Schneidwerkzeug verwendet werden. Siehe Foto von einem idealen Nadel in 1A. </li&gt; <li> Bewahren Sie die Nadeln in einer Petrischale mit einem Streifen aus Ton in der Mitte. Drücken Sie die Welle jeder Nadel in den Ton, um es in Position zu halten und die fragile scharfe Spitze aus dem Boden und die Seiten halten. </li></ol></li><li> Für weitere Tools, erhalten Glasplättchen, ein Paar lange Standardmuster Zangen, einem Bunsenbrenner, und 3-4 Glaspasteurpipetten (Größe 5 ¾ in). </li><li> Pipette-Werkzeug: Um eine Pipette-Werkzeug machen, Licht der Bunsenbrenner und legen Sie die Spitze einer Glaspasteurpipette in den blauen Teil der Flamme, während Drehen, so dass die Spitze schmilzt und das Loch vollständig Dichtungen, die einen geschlossenen, abgerundeten Ende . Die abgerundete, versiegelte Spitze wird später verwendet, um Vertiefungen im Tontopf, der die Embryonen während der Operation hält zu machen. Siehe Abbildung 1B. </li><li> Glas-Brücken: Um Glasbrücken zu machen, verwenden lange Standardmuster Pinzette vorsichtig abbrechen 3 mm und 3 mm Stücke von Deckglas Glas. Halten Sie das Stück des Deckglases mit tweezers, legen Sie das Glas in der Flamme, bis alle vier Kanten weicher und die Kurve nach unten und bildet eine kleine Glaskuppel. Die Kanten sollten nicht mehr scharf sein. Siehe Abbildung 1C. </li><li> Bewahren Sie die Deckglas Brücken, indem Sie sie, Kanten nach unten in Modelliermasse, Futter den Boden einer Petrischale. Stecken Sie die Brücken, so dass die Oberseite der Brücke über der Ton-Oberfläche bleibt. Drücken Sie nicht zu hart, so dass die Brücke bricht, und nicht ganz die Brücke in den Ton einbetten, weil es schwer zu entfernen sein. Nach der Sterilisation mit einer Flamme oder 70% Ethanol, können die Brücken aus dem Experiment wiederverwendet, um zu experimentieren. </li></ol> 3. Vorbereitung für den Embryo Betrieb <ol><li> Richten einen kleinen 60 mm Kunststoff-Petrischale mit Knetmasse. Zwischen den Anwendungen, die Schale und Ton Oberfläche gründlich mit destilliertem Wasser mit 70% Ethanol gewaschen und dann. HINWEIS: rot, weiß oder gelb, Van Aken Plastalina Modelliermasse, die in einem lokalen zu kaufen kanny-oder Kunstspeicher. Schwarz-Ton ist nicht zu empfehlen, weil es einen Rückstand Mitteilungen. </li><li> Füllen Sie die Schale mit 3% Ficoll 0,5 x MBS-Lösung. Der höhere Salzkonzentration verhindert Gewebedissoziation und das Polysaccharid Ficoll hilft, die Lösung, die in das Gesicht halten in Position unterstützt verdicken. </li><li> Verwenden Sie die geflammt Pasteur-Pipette-Werkzeug (siehe Abbildung 1), um flache, 2-3 mm Vertiefungen im Ton zu machen, über die Tiefe der Bühne 20 Embryo Körper. Machen 20-30 Vertiefungen, 1-2 mm voneinander auf jeder Seite der Schale, so dass es insgesamt 40-60 Vertiefungen. Beschriften einer Seite LOF / GOF, und die andere Seite Wildtyp, durch das Schnitzen Initialen in den Ton mit einer Pinzette. </li></ol> 4. Preoperation Embryo Vorbereitung <ol><li> Erhalten und Kultur Xenopus laevis Embryonen mit Standardverfahren 17. Für eine detaillierte Beschreibung der Froschhaltung, finden Sie Sive et al. 17. <ol><li> Achtundvierzig Stunden vor dem Experiment obtain Eiern von weiblichen Frösche und durchzuführen, in-vitro-Fertilisation. </li><li> Injizieren 0,5-1 ng Membran verschlossen GFP mRNA sowie beliebige mRNA oder Antisense-Morpholino-modifizierten Antisense-Oligonukleotiden (&quot;Morpholino&quot;) an der einen Zellen-Stadium oder in 2-Zellen in 2-Zellen-Stadium. Die eine Zelle Stufe dauert etwa 70-90 min. Spritzen Sie ein Gesamtvolumen von 3.1 nl. Anstelle von RNA, codierend für ein Fluoreszenzprotein (wie GFP oder RFP RNA), einen Morpholino-oder FITC fluoreszenzmarkierten Dextran injizieren. Die Fluoreszenz ist wichtig zu bestimmen, ob das transplantierte Gewebe heilt und bleibt im Kopf. </li><li> Capped-mRNA kann von einer linearisierte Plasmid mit einem mMessage mMachine SP6 oder T7 Kit vorbereitet werden. Morpholinos gestaltet werden kann und durch Gene Werkzeuge LLC bestellt werden. Die Menge an Morpholin für eine gewünschte Wirkung erforderlich ist für jedes Gen 18 bestimmt werden. </li><li> Bewahren Sie die injizierten Embryonen bei 15 ° C für 48 Stunden, bis sie Stufe 19-20 zu erreichen. (Foder alle nachfolgenden Schritte, Embryonen nach der Normal-Tabelle von Xenopus laevis durch Nieuwkoop Faber und 19). HINWEIS: Am Tag der Operation, müssen beide Empfänger und Spender Embryonen in einem Stadium der jeweils anderen für die Transplantate, um optimal arbeiten zu können. Allerdings, Embryonen mit Morpholinos (&quot;morphants&quot;) injiziert entwickeln manchmal langsamer als Wildtyp-oder steuern morphanten Embryonen, die es erforderlich machen Experimente so zu koordinieren, sowohl morphanten und Wildtyp-Embryonen sind auf der gleichen Stufe. Morphants müssen möglicherweise bei einer höheren Temperatur für 12-24 Stunden vor dem Eingriff gehalten werden. Um die Wahrscheinlichkeit, dass Embryonen können bei passenden Stufen gefunden werden zu erhöhen, können Embryonen bei verschiedenen Temperaturen gehalten werden. Vierundzwanzig Stunden vor dem Experiment, sollte man die Embryonen in einer mehrere Gerichte und morphants Ort bei 18-20 ° C und Wildtyp-Embryonen bei 15-18 ° C teilen </li></ol></li><li> Am Tag der Transplantation Experiment remove die Embryonen aus the15 ° C Inkubator und inszenieren sie nach Nieuwkoop und Faber 19. Wenn sie jünger als spät neurula (Stufe 19), lassen Sie sie bei Raumtemperatur für 1-2 Stunden, bis sie Stufe 19 zu erreichen. </li><li> Bildschirm des injizierten Embryonen unter einem Fluoreszenzmikroskop. Wählen Embryonen, die gleichmäßige, helle Fluoreszenz für das Experiment zeigen. </li><li> Entfernen Sie Unordnung und mögliche Verunreinigungen in der Nähe der Arbeitsbereich. Wischen Sie die Arbeitsfläche, Stereomikroskop und alle Werkzeuge mit 70% Ethanol. </li><li> Sobald die Embryonen im Stadium 19, entfernen Sie die Dotterhaut mit # 5/45 Dumont Pinzette unter einem Stereomikroskop. <ol><li> Entfernen Sie die Dotterhaut von 20-30 von jedem Spender und Empfänger Embryonen. </li><li> Für die ersten Gesichtstransplantation mehrere Experimente, sollte man mit ein paar Embryonen für jede Bedingung zu üben. Das Verfahren ist anspruchsvoll und erfordert eine sorgfältige Praxis, bevor es in einem größeren Maßstab verwendet werden, schnell und erfolgreich. Man kann u arbeitenp zu tun, 20 Transplantationen / Experiment. </li></ol></li><li> Bewegen Host Embryonen in die Betriebsschale mit einer Kunststoff abgestuften Führungspipette mit der Spitze abgeschnitten, daß die Öffnung ist viel breiter als ein Embryo (zumindest einige Millimeter). Seien Sie vorsichtig, nicht zu berühren Embryonen Blasen oder der Wasseroberfläche, als Embryonen werden in der Oberflächenspannung explodieren. </li><li> Verwenden Sie # 5/45 Pinzetten, um die Embryonen in die Vertiefungen Ton einfügen, mit dem hinteren Teil des Embryos in der Lehm. Schließen Sie vorsichtig den Ton rund um die Grundlagen des Embryos mit der Zange, so dass die obere Viertel des Embryos, den Kopf aus der Depression herausragt. </li><li> Sobald alle Host-Embryonen in ihren Depressionen gesichert ist, auf die andere Seite der Platte bewegen und beginnen, die Spender Embryonen in ihre Depressionen einfügen. Wiederholen Sie den Prozess der Sicherung der Embryonen in ihren Brunnen. </li></ol> 5. Durchführen der Gesichtstransplantation <ol><li> Schneidmesser: Als ein Schneidmesser zum Entfernenvon Spendergewebe EAD, verwenden Sie eine geeignete Glasscherben Kapillarnadel (siehe Schritt 2.3 und Abbildung 1). HINWEIS: Man kann direkt halten die Kapillare zwischen den Fingern (dies funktioniert auch für Menschen mit kleinen Händen) oder ein in einer Insektenstifthalter die Nadel montieren. Electrosharpened Wolfram Nadeln 17 in einem Stifthalter geladen anstelle eines Kapillarrohrs Nadel verwendet werden. Bitte sehen Sie schlug vor, Stifthalter und Wolfram Nadeln in der Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte. </li><li> Unter einem Stereomikroskop, legen Sie die Nadel in den Kopf des Embryos auf der linken Seite des Zementdrüse. Die Nadel sollte tief eingesetzt werden, so dass es geht von außerhalb der Embryo durch den Kopf, und in den Vorderdarm. Um die gesamte EAD verpflanzen, sollte Schnitte von der Außenseite des Embryos in die Vorderdarm verlängern. Für nur Ektoderm-Transplantationen sollten Schnitte flacher sein und sich nur durch das Ektoderm. <ol><li> Flick die Nadel von der linken zur rechten Seite derKopf, über die gesamte Breite der Zementdrüse. Das Schnippen ist wichtig, da die Bewegung gibt einen sauberen Schnitt. Siehe 2A für eine Zusammenfassung der Technik und 2B für eine Demonstration der Schnitte. Die Zementdrüse und Augen sind wichtige Meilensteine ​​für die Schnitte. Die Reihenfolge der Schnitte hat keinen Einfluss auf das Ergebnis und kann basierend auf Vorlieben oder Händigkeit des Benutzers variieren. </li></ol></li><li> Platzieren der Nadel zu Beginn des vorigen Schnitt am linken Rand der Zementdrüse und den Fingern an die Nadel nach oben, bis es den Boden des linken Auges erreicht. Dies wird einen vertikalen Schnitt vom linken Rand der Zementdrüse auf der Unterseite des linken Auges zu schaffen. </li><li> Stecken Sie die Nadel am rechten Rand des Zementdrüse, und Flick die Nadel nach oben, bis sie den Boden des rechten Auges erreicht. Dies wird einen vertikalen Schnitt vom rechten Rand der Zementdrüse an der Unterseite des rechten Auges zu schaffen. </li><li> Um vollständig herauszuschneiden das Gewebe, flick die Nadel von der Unterseite des linken Auges auf der Unterseite des rechten Auges, wodurch ein horizontaler Schnitt, die das Gewebe frei werden. Cuts von außerhalb des Embryos an der Vorderdarm erweitern, einschließlich sowohl Ektoderm und Entoderm in der EAD Explantation. Alternativ können flache Schnitte für Ektoderm nur EAD Transplantationen verwendet werden. Sobald der EAD Gewebe entfernt wird, sollte es eine rechteckige Öffnung von der Außenseite des Embryos in den Vorderdarm zu sein, die sich von der Zementdrüse bis knapp unterhalb der Augen (von oben nach unten). Das Loch sollte vom inneren Rand des linken Auges auf den inneren Rand des rechten Auges (Seite zu Seite) zu erstrecken. Siehe Abbildung 2Bb. </li><li> Schieben Sie das ausgeschnitten Gewebe auf der Spitze der Nadel, und heben Sie durch den Puffer, um den Teil der Schale mit Host-Embryonen. Sie nicht das Gewebe an der Oberfläche Luft auszusetzen oder es wird beschädigt werden. </li><li> Zuschneiden elbe Gewebe vom Wirtsembryo, wie für den Spender. Entsorgen Sie die Host-EAD Explantat oder speichern Sie es auf Insertiont in den Spender Gesicht, für die gegenseitige Transplantationen. </li><li> Legen Sie die Geber Explantation in die resultierenden Host-Loch mit # 5/45 Pinzette. </li><li> Sobald das Spendergewebe richtig positioniert ist und vollständig eingeführt ist, sorgfältig einen Glasbrücke (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2Bc) über das Gesicht des Embryos, das Transplantat in Position zu halten. Die Enden der Brücke soll in den Ton einfügen, an Ort und Stelle hält. Die Brücke sollte sanft Druck auf das transplantierte Gewebe, so dass die Transplantation bündig mit der Host-Kopf, ohne ihn aus dem Kopf heraus oder liegend tief im Kopf. Der Kopf kann leicht durch das Deckglas abgeflacht werden, aber darauf achten, nicht den Embryo mit zu viel Druck beschädigt werden. Transplantationen sollten innerhalb von 5 Minuten durchgeführt werden. HINWEIS: Ein erfahrener Ermittler rund zwanzig Transplantationen pro Experiment über 2-3 Stunden durchführen können. Während dieser Zeit werden die Embryonen von Stufe 20-22 Fortschritte. Abschluss der Gesichtstransplantations in der Stufe 21 oder 22 hat keinen Einfluss auf die Ergebnisse. Später Transplantation (in den Stufen 22-26) kann getan werden, sind schwieriger als das Wappen frei EAD Mittellinienbereich wird als Schädel Neuralleiste bewegt sich in das Gesicht, aber verengt. Konsistenz über Transplantationen ist kritisch. </li></ol> 6. Gesichts-Transplantation nach der Operation Wiederherstellung <ol><li> Heilung dauert in der Regel 2-3 Stunden. Lassen Sie die Embryonen bei Raumtemperatur in ihrem Ton Vertiefungen mit den Glasbrücken hält die Spendergewebe an Ort ungestört. </li><li> Sobald die Transplantationen geheilt werden vorsichtig die Glasbrücken, entfernen Sie den Ton aus um die Basis der Embryonen mit einer Pinzette, und verwenden Sie absolvierte ein Kunststofftransferpipette vorsichtig absaugen die Embryonen aus ihren Depressionen. </li><li> Setzen Sie die Embryonen in eine entsprechend beschriftete Petrischale, die Hälfte mit sauberem 0,1 x MBS gefüllt mit Gentamicin. </li><li> Wachsen die Embryonen bei 15 ° C oder 18 ° C für mehrere Tage bis zum Erreichen Zuführen Kaulquappenstadium bei Stufe 40, wHenne Gesichts Phänotypen erzielt werden. <ol><li> Der 0,1 x MBS-Lösung mit Gentamicin sollte täglich gewechselt werden, und alle toten Embryonen sollten sofort entfernt werden, um Verunreinigung und Tod anderer Embryonen zu verhindern. </li><li> Der Mund öffnet um Stufe 40. In der Stufe 40-41, muss man überprüfen, dass das transplantierte Gewebe bleibt an Ort und Stelle verheilten, indem Sie seine Fluoreszenz. Transplantate gelegentlich fallen aus, so muss man sicherstellen, dass alle Embryonen hat die Spendergewebe an Ort und Stelle. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Kritische Schritte und Einschränkungen: Der EAD Gesichtstransplantation Verfahren ist zeit-und arbeitsintensiv. Es erfordert Übung, ruhige Hände und Fingerfertigkeit zu perfektionieren. Die Gesichtstransplantation Protokoll beruht auf der Fähigkeit des Forschers, um effizient zu entfernen und Transplantatgewebe. Wenn man zu lange braucht, um die Transplantation in das Wirts Gesicht einfügen, wird der Host Gesicht beginnen, sich zusammenzuziehen und zu heilen. Pinzetten können verwendet werden, um den Gesichtsbere...

Um Mechanismen bei kraniofazialen Entwicklung zugrunde liegenden Gesichtsschädelfehlbildungen 1-2, wichtige Gewebe und deren Signalbeiträge zu verstehen, müssen identifiziert werden. In dem Frosch Xenopus laevis, Teil des Gesichts, einschließlich der Mund-und Nasenlöcher Form aus der &quot;Extreme Anterior Domain&quot; (EAD), wo Ektoderm und Endoderm direkt nebeneinander 3-4. Der EAD dient auch als Signalzentrum, um das umliegende Gewebe, einschließlich der Schädel Neuralleiste, die die Kiefer und andere Gesichtsbereiche 5 bildet beeinflussen. Um Gene, die EAD-Funktion beitragen zu identifizieren, wurde eine &quot;Gesichtstransplantation&quot;-Technik entwickelt, bei der Gewebe wird von einem Spender in eine Wirts Embryo verpflanzt, nach dem Entfernen der entsprechenden Host-Region. Nach der Transplantation, was Gesichtsentwicklung beurteilt. Somit werden die Auswirkungen der Funktionsverlust (LOF) oder Überfunktion (GOF) für ein spezifisches Gen in der EAD lokal analysiert, wobei der Rest der head und Körper von Wildtyp-Gewebe besteht. Die wechselseitige Transplantation durchgeführt werden kann, in dem Wildtyp-Gewebe wird in Embryonen mit globaler LOF oder GOF in bestimmten Genen transplantiert. Transplantation wurde häufig in Xenopus verwendet und Küken studiert 6. Zum Beispiel hat Xenopus Transplantation homo neurale Induktion, Objektiv und neuronalen Kompetenz und Neuralleiste Migration 7-10 gerichtet. Wachtel-Küken chimären Transplantation hat die Entwicklung der anterioren Neuralplatte vorderen neuronalen Grat, Neuralleiste und Schädelknochen 11-14 analysiert. Dies ist die erste Transplantation Technik für die Untersuchung der Schädelentwicklung in Xenopus. Diese Technik hat eine neue Rolle für den Wnt-Inhibitoren Frzb1 und Halbmond bei der Regulierung der Basalmembran Bildung im Mund mutmaßlichen 5 demonstriert. Xenopus laevis ist ein ideales Modell für die Untersuchung der Schädelentwicklung als Embryonen groß sind, entwickeln extern einnd das Gesicht ist gut sichtbar, so dass die Mikromanipulation und Bild der Entwicklung. Mechanismen, die Gesichtsentwicklung konserviert erscheinen, die anzeigt, dass Ergebnisse in der Frosch machte einen Einblick in die menschliche Entwicklung 4,15-16.

<table><tbody><tr><td>Pasteurpipette</td><td>VWR</td><td>14672-400</td><td>Limettenglas</td></tr><tr><td>Größe 5 3/4 Zoll Baumwolle</td> mit <td>Stecker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>und graduierter Transferpipette</td><td>VWR</td><td>16001-180</td><td>Einweg</td></tr><tr><td>#5/45 Pinzette</td><td>Fine Science Tools von Dupont medical</td><td>11251-35</td><td>Abgewinkelt 45&deg;</td></tr><tr><td>Standardmuster Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-20</td><td>Gerade; gezackte Spitze; Edelstahl</td></tr><tr><td>Kapillarschlauch (für Nadeln)</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>Borosil 1,0 mm AD x 0,5 mm ID/Faser</td></tr><tr><td>Abdeckslip&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48393 252</td><td>24 x 60 mm&nbsp; Mikro-Deckglas;</td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9378</td><td></td></tr><tr><td>Nadelabzieher&nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>Nadelabzieher: abgekündigt Filament: FB300B</td><td>Der ähnlichste, derzeit erhältliche Nadelabzieher ist der P-97. Verwenden Sie für Filamente Sutter 3,00 mm quadratische Box-Filamente, 3,0 mm breit.</td></tr><tr><td>Modell P-80</td><td>Flammender / Brauner Mikropipettenabzieher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop Beleuchtung von Fostec</td><td>Fostec</td><td></td><td>Verwenden Sie einen Leuchtkasten mit 2 faseroptischen Armen. &nbsp;</td></tr><tr><td>Vernickelter Stifthalter</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td>Durchmesser der Maulöffnung: 0-1 mm</td></tr><tr><td>Moria Vernickelter Stifthalter</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>Durchmesser der Maulöffnung: 0-1 mm</td></tr><tr><td>Wolframnadeln</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-05</td><td>0,125 mm Stabdurchmesser</td></tr><tr><td>Van Aken Plastalina</td><td>Blick</td><td>#33268-2981</td><td></td></tr><tr><td>Modelliermasse - weiß, rot oder gelb</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMashine SP6 oder T7 Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr></tbody></table>

gesichtstransplantation in<em&gt; xenopus laevis</em&gt; embryonen

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial Geburtsschäden treten in 1 aus jeden 700 Lebendgeburten, aber Ätiologie wird selten aufgrund der begrenzten Verständnis der kraniofazialen Entwicklung bekannt. Um festzustellen, wo Signalwege und Gewebe während der Strukturierung der Entwicklungs Gesicht handeln, hat eine &quot;Gesichtstransplantation&quot;-Technik in Embryonen von dem Frosch Xenopus laevis entwickelt. Eine Region der vermutlichen Gesichtstücher (die &quot;Extreme Anterior Domain&quot; (EAD)) von einem Spender an Schwanzknospen-Embryonen Stufe entfernt und auf eine Wirtsembryo der gleichen Stufe, aus dem die äquivalenten Bereich entfernt wurde transplantiert. Dies kann verwendet werden, um einen chimären Gesicht, wo der Host-oder Spendergewebe hat einen Verlust oder Gewinn von Funktion in einem Gen, und / oder enthält einen Label-Linie zu erzeugen. Nach der Heilung wird das Ergebnis der Entwicklung überwacht und anzeigt Rollen der Signalweg innerhalb des Spenders oder des umgebenden Wirtsgewebe. Xenopus ist ein wertvolles Modell für die Entwicklung Fläche, wie der Gesichtsbereich groß ist und leicht eineccessible für die Mikromanipulation. Viele Embryonen untersucht werden können, die über einen kurzen Zeitraum, da die Entwicklung rasch erfolgt. Ergebnisse in der Frosch sind relevant für die menschliche Entwicklung, da craniofacial Prozesse erscheinen zwischen Xenopus und Säugetieren konserviert.

Transplantierte Gewebe sollten vollständig nach der Transplantation in die Wirtskopf eingesetzt werden, wie in 3A gezeigt, und haben eine Glasbrücke entsprechend auf dem Gesicht des Embryos platziert, wie in Abbildung 2Bc gezeigt. Das transplantierte Spendergewebe muss korrekt für die Host-Öffnung bemessen sein, für die Transplantation erfolgreich zu sein. Die EAD Gewebe nicht aus dem Kopf herausragen, in irgendeiner Weise, wie in den 3B und 3C zu sehen...

Eine Technik zum Trans &quot;Extreme Anterior Domain&quot; Gesichtsgewebe zwischen Xenopus laevis-Embryonen entwickelt. Tissue kann von einem Gen-Expression Hintergrund in eine andere verschoben werden, so dass die Untersuchung der lokalen Anforderungen für kraniofaziale Entwicklung und zur Signalisierung von Wechselwirkungen zwischen Gesichtsregionen.

Gesichtstransplantation in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das extrem anteriore Domänen- oder EAD-Gesichtsgewebe zwischen Xenopus laevis-Embryonen zu transplantieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das EAD-Gewebe von Spender- und Empfängerembryonen mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund entfernt wird. Anschließend werden die EAD-Explantate der Spenderembryonen in die Gesichter der Empfängerembryonen eingesetzt.Im letzten Schritt werden die transplantierten Embryonen 60 bis 70 Stunden nach der Befruchtung zur Beobachtung kultiviert. Abschließend können Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um Veränderungen in der kraniofazialen Entwicklung der transplantierten Tiere zu beobachten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der kraniofazialen Entwicklung zu beantworten und damit unser Verständnis kraniofazialer Fehlbildungen zu verbessern, beispielsweise hinsichtlich neuer Signale, die für die orale Entwicklung erforderlich sind und aus der äußersten anterioren Domäne hervorgehen. Vor der Operation Kapillarrohre in einen Nadelextrahierer laden und dann vier bis sechs Nadeln ziehen, wobei jede Nadel so gebrochen wird, dass der zwei bis drei Millimet

facial-transplants-in-xenopus-laevis-embryos

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zebrafisch-Transplantation ermöglicht die Kombination von Genetik und Embryologie an gewebespezifischen Chimären zu erzeugen. Dieses Video zeigt Gastrula inszeniert zelltransplantationen, dass es unserem Labor auf den Rollen von astroglialen Bevölkerung und spezifische Anleitungen Cues während Kommissur Bildung im Vorderhirn zu untersuchen.

Tissue Gezielte Embryonale Chimären: Zebrafisch Gastrula Cell Transplantation

Tierische caps überexprimierenden Genprodukt (e) auf die Flanke der Entwicklung von...

Tissue Bestimmung mit dem Tier Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Dieses Video-Protokoll beschreibt eine Methode zur Herstellung...

Herstellung transgener Xenopus laevis Durch Restriktionsenzym-vermittelte Integration und Reaktorsicherheit Transplantation

Craniofacial Knorpel entwickeln in engem Kontakt mit anderen Geweben und sind schwer zu lebenden Tieren zu manipulieren. Wir sind mit Elektroporation, um molekulare Werkzeuge während des Wachstums des kraniofazialen Skeletts liefern unter Umgehung der frühen Embryonalentwicklung Effekte. Dieser Ansatz erlaubt es uns, effizient Testkandidat...

Elektroporation von Craniofacial Mesenchym

Dieses Protokoll beschreibt, wie premigratory Schädel Neuralleiste (NC) von Xenopus laevis neurulas sezieren. Diese Explantate können sich auf Fibronektin und in vitro kultiviert beschichtet werden, oder zurück in die Wirts Embryonen gepfropft wird. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Mechanismen der NC-Epithel-Mesenchym-Übergang an, Migration und Differenzierung.

Dissektion der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest für<em&gt; In-vitro-</em&gt; Explantation Kultur oder<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation

Ein Verfahren, um die orofacial Größe und Form des Xenopus laevis Embryonen Quantifizierung entwickelt worden. In diesem Protokoll werden traditionelle Größenmessungen mit geometrischen Morphometrie kombiniert, um für komplexere Analysen der orofazialen Entwicklung und Mängel zu ermöglichen.

Quantifizierung der Orofacial Phänotypen in Xenopus

In Xenopus-Embryonen sind Zellen aus dem Dach des Blastocoels pluripotent und können so programmiert werden, dass sie verschiedene Gewebe erzeugen. Hier beschreiben wir Protokolle zur Verwendung von amphibischen Blastocoel-Dachexplantaten als Assay-System, um in vivo und in vitro wichtige Merkmale der frühen neuronalen Entwicklung zu untersuchen.

Stammzell-ähnlichen<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantate bis Früh Neurale Entwicklungs- Eigenschaften Studieren<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Gene überlebensnotwendig stellen technische Hürden für die Erstellung von mutierter Linien. Leap Frogging umgeht Letalität durch die Kombination von Genom-Bearbeitung mit Keim Urzelle Transplantation Wildtyp Tiere Keimbahn-Mutationen zu erstellen. Leap Frogging erlaubt auch die effiziente Erzeugung von homozygot null Mutanten in der F-1 -Generation. Hier wird die Transplantation Schritt demonstriert.

Keim Urzelle Transplantation für CRISPR/Cas9-basierte in Xenopus überspringen

Dieses Protokoll soll zeigen, wie man ein DNA/DOTAP-Gemisch in Augenknospen von eintägigen Xenopus laevis Embryonen mikroinjiziert und wie man einzelne grüne fluoreszierende Proteine (GFP) abbilden und rekonstruieren kann, die optische axonale Lauben in tektalen Midhirnen von intakte, lebende Xenopus Kaulquappen.

Mikroinjektion von DNA in Augenknospen in Xenopus laevis Embryonen und Bildgebung von GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Dieser Artikel beschreibt eine Gewebetransplantationstechnik, die entwickelt wurde, um die Signal- und Musterbildungseigenschaften des basalen Vorderhirns während der kraniofazialen Entwicklung zu testen.

Erstellung von Vogel-Vorderhirn-Chimären zur Beurteilung der Gesichtsentwicklung

Embryologische Manipulationen wie Exstirpation und Transplantation von Zellen sind wichtige Werkzeuge, um die frühe Entwicklung zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches und effektives Transplantationsgerät, um diese Manipulationen in Zebrafischembryonen durchzuführen.

Ein einfaches und effektives Transplantationsgerät für Zebrafischembryonen

Lernen Sie die Gesichtstransplantation von EAD-Gewebe bei Xenopus laevis Embryonen für die Entwicklungsbiologie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung kraniofazialer Signalwechselwirkungen.

Gesichtstransplantation in

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