Gesichtstransplantation in

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das extrem anteriore Domänen- oder EAD-Gesichtsgewebe zwischen Xenopus laevis-Embryonen zu transplantieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das EAD-Gewebe von Spender- und Empfängerembryonen mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund entfernt wird. Anschließend werden die EAD-Explantate der Spenderembryonen in die Gesichter der Empfängerembryonen eingesetzt.

Im letzten Schritt werden die transplantierten Embryonen 60 bis 70 Stunden nach der Befruchtung zur Beobachtung kultiviert. Abschließend können Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um Veränderungen in der kraniofazialen Entwicklung der transplantierten Tiere zu beobachten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der kraniofazialen Entwicklung zu beantworten und damit unser Verständnis kraniofazialer Fehlbildungen zu verbessern, beispielsweise hinsichtlich neuer Signale, die für die orale Entwicklung erforderlich sind und aus der äußersten anterioren Domäne hervorgehen. Vor der Operation Kapillarrohre in einen Nadelextrahierer laden und dann vier bis sechs Nadeln ziehen, wobei jede Nadel so gebrochen wird, dass der zwei bis drei Millimeter lange, flexible, haarähnliche Teil der Glasnadel vollständig entfernt ist.

Die Spitze muss relativ starr sein, aber schmal genug, um als Schneidwerkzeug verwendet zu werden. Zünden Sie dann einen Bunsenbrenner an und führen Sie die Spitze einer Glas-Pasteurpipette in den blauen Teil der Flamme ein. Drehen Sie die Pipette so, dass die Spitze schmilzt und sich die Öffnung vollständig schließt, wodurch ein geschlossenes, abgerundetes Ende entsteht. Verwenden Sie zum Herstellen von Glasbrücken lange Standard-Pinzetten, um drei Millimeter mal drei Millimeter große Stücke von Deckgläsern vorsichtig abzubrechen.

Dann halten Sie das Deckglasstück mit einer Pinzette und führen das Glas in die Flamme, bis alle vier Kanten weich werden und sich nach unten krümmen, sodass sich eine winzige Glashaube bildet. Als Nächstes legen Sie eine Kunststoff-Petri-Schale mit 60 Millimeter Durchmesser mit rotem, weißem oder gelbem Modellier-Ton aus und füllen die Schale mit 3% phi.

Rufen Sie eine 0,5-XMBS-Lösung an. Verwenden Sie dann den ausgeglühten Pastell, Ihr Pipettenwerkzeug, um 40 bis 60 flache, zwei bis drei Millimeter tiefe Vertiefungen – etwa von der Tiefe eines Körpers eines Embryos im Stadium 20 – in den Ton 48 Stunden vor dem Experiment einzubringen. Gewinnen Sie Eier von weiblichen Fröschen und befruchten Sie diese in vitro.

Danach die Embryonen nach der Injektion mit cappierter Membran, GFP-mRNA sowie einer weiteren Boten-RNA bei 15 Grad Celsius 48 Stunden lang lagern, bis sie das Entwicklungsstadium 19 bis 20 erreicht haben. Am Tag des Transplantationsversuchs unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops die injizierten Embryonen auswählen, die eine gleichmäßige, helle Fluoreszenz zeigen. Nach dem Desinfizieren der Arbeitsfläche, des Stereomikroskops und der Instrumente mit 70 %igem Ethanol die Vitellinmembran jedes ausgewählten Embryos unter dem Stereomikroskop mit Dumont-Forceps Nr. 5 45 entfernen.

Verwenden Sie dann eine Plastik-Messpipette mit abgeschnittenem Spitzenende, um die Wirtsembryonen in die Operationschale zu überführen. Achten Sie darauf, die Embryonen nicht mit der Luft-Wasser-Grenzfläche in Berührung zu bringen. Setzen Sie die Embryonen mit der Hinterseite nach unten in die Vertiefungen der Tonmasse ein und schließen Sie vorsichtig mit der Pinzette den Ton um den jeweiligen Embryobasisbereich, sodass der Kopf aus der Vertiefung herausragt. Um den Spender zuerst mit dem Gesicht zu entfernen, führen Sie eine der gezogenen Nadeln in den Kopf des Embryos links von der Zementdrüse so tief ein, dass sie von außen durch den Kopf hindurch bis in den Vorderdarm verläuft.

Bewegen Sie die Nadel von der linken zur rechten Seite des Kopfes über die gesamte Breite der Zementdrüse, um einen sauberen Schnitt zu erzielen. Platzieren Sie dann die Nadel am Anfang des Schnitts an der linken Grenze der Zementdrüse und bewegen Sie die Nadel nach oben, bis sie die Unterseite des linken Auges erreicht, um einen vertikalen Schnitt von der linken Grenze der Zementdrüse bis zur Unterseite des linken Auges zu erzeugen. Als Nächstes platzieren Sie die Nadel an der rechten Grenze der Zementdrüse und bewegen die Nadel nach oben, bis sie die Unterseite des rechten Auges erreicht, um einen vertikalen Schnitt von der rechten Grenze der Zementdrüse bis zur Unterseite des rechten Auges zu erzeugen.

Danach die Gewebestück vollständig entfernen, indem die Nadel von der Unterseite des linken Auges zur Unterseite des rechten Auges geführt wird, wodurch ein horizontaler Schnitt entsteht, der das Gewebe freilöst. Nun das ausgeschnittene Gewebe vorsichtig auf die Nadelspitze schieben und durch das Puffermedium in den Bereich der Schale heben, der die Wirtsembryonen enthält. Das Gewebe aus dem Wirtsembryo wie zuvor gezeigt entfernen, wobei der Wirt und das EAD-Explant verworfen werden, und das Spenderexplant in den verbleibenden Wirtsembryo einsetzen.

Nachdem das Spendergewebe korrekt positioniert und vollständig vorsichtig eingesetzt wurde, platzieren Sie eine der zuvor vorbereiteten Glasbrücken über das Gesicht des Embryos, um die Transplantatposition zu sichern, und führen Sie die Enden der Brücke in den Lehm ein, um sie zu stabilisieren. Nach der Operation lassen Sie die Embryos zwei bis drei Stunden lang ungestört bei Raumtemperatur ruhen. Sobald die Transplantate verheilt sind, entfernen Sie die Glasbrücken vorsichtig von den Embryos und den Lehm um die Basis der Embryos herum.

Verwenden Sie dann eine plastische, skalierte Transferpipette, um die Embryonen vorsichtig aus ihren Vertiefungen abzusaugen. Überführen Sie die Embryonen in eine entsprechend beschriftete Petrischale, die zur Hälfte mit frischem 0,1× MBS ergänzt durch Gentamycin gefüllt ist, und kultivieren Sie die Embryonen bei 15 bis 18 Grad Celsius über mehrere Tage, bis sie Stadium 40 erreichen. Wechseln Sie die MBS-Lösung täglich, und überprüfen Sie das transplantierte Gewebe mittels Fluoreszenz, um sicherzustellen, dass das Explantat an seiner Position verheilt ist.

Die transplantierten Gewebe sollten nach der Transplantation vollständig in den Kopf des Wirts eingefügt sein, wie gerade gezeigt wurde, und korrekt an die Größe der Öffnung im Wirt angepasst sein, damit die Transplantation erfolgreich ist. Das EAD-Gewebe sollte in keiner Weise aus dem Kopf hervorstehen, wie in diesen beiden Bildern falsch positionierter Explantate zu sehen ist. Außerdem sollte die Gesichtstransplantation im Vergleich zu ihrer Position im Spenderkörper nicht verdreht sein, wie hier dargestellt.

Nach mehreren Stunden sollten sich das transplantierte Gewebe und das umgebende Gesichtsgebiet regeneriert haben, und am nächsten Tag sollte das Embryo wie im gezeigten Beispiel erscheinen, wobei, wie gerade demonstriert, die Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden kann, um zu bestätigen, dass die Transplantation während des Heilungsprozesses an ihrem Platz verblieben ist. Im Stadium 42 wird das transplantierte Kontrollgewebe zum Mund beitragen und fluoreszierend grün bleiben. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man EAD-Gewebe von einem Embryo in einen anderen transplantiert.

Die Anwendung dieser Methode erleichtern, um festzustellen, welches Keimblatt oder welcher Bereich des EAD am entscheidendsten für die Gesichtsentwicklung ist.