Name: Dissection und seitlicher Anbau von Zebrafisch-Embryonen: Analyse der Rückenmarksentwicklung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Lernen Sie die Präparation und seitliche Montage von Zebrafisch-Embryonen für die mikroskopische Visualisierung des Rückenmarks. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Axonführung und neurobiologischen Entwicklungsprozessen.

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Skidmore Fakultät Entwicklungszuschuss finanziert die Erstellung und Veröffentlichung des Manuskripts.

1. Montage Embryonen (nach Abschluss der gewählte Visualisierungstechnik, wie Immunzytochemie, in situ Hybridisierung, etc.) <ol><li> Platzieren Embryonen in einer 35 mm Petrischale mit Puffer der Wahl (1A) gefüllt. Die Wahl der Puffer in der Kennzeichnung Verfahren. Typischerweise PBS-basierten Puffer sind geeignet. </li><li> Unter einem Binokular und mit einer Pinzette, sichern Sie den Kopf mit einer Zange und ziehen Sie das Eigelb weg mit dem anderen Paar (Abbildung 1B). Alternativ können Sie auch ein Insektenstift in einer Insektenstifthalter vorsichtig wegziehen das Eigelb. </li><li> Mit dem Embryo Poker (Angelschnur (0,41 mm Durchmesser) geklebt, um entweder eine Kapillare oder eine Pasteur-Pipette) bewegen die Embryonen auf einen Teil der Petrischale, die nicht über eine Menge von Schutt Eigelb (1C-D). </li><li> Mit einem Glas Pasteur Pipette absaugen die Embryonen in so wenig Flüssigkeit wie möglich und gständig pipettieren sie auf einen Objektträger (1E). </li><li> Sanft Docht entfernt überschüssige Flüssigkeit mit einem Labortuch. Kontakt mit Embryonen vermeiden. </li><li> Einen Tropfen Eindeckmedium auf Embryonen. Für Fluoreszenzmarkierungen, verwenden Sie ein Antifade Reagenz der Wahl. Für kolorimetrische Signale kann 70% Glycerin als Befestigungsmedium verwendet werden. </li><li> Mit dem Embryo Poker, orientieren die Embryonen auf ihren Seiten in Reihen (1F). </li><li> In einem &quot;dab&quot; Vaseline oder Hochvakuumfett auf jeder Ecke einem Deckglas (1G). Dies verhindert eine Beschädigung des Embryos vor übermäßiger Kompression. </li><li> Deckglas (Vaseline Seite nach unten) auf der Oberseite der Embryonen (1H). </li><li> Klopfen Sie leicht das Deckglas an jeder Ecke, bis die Montage Medien (70% Glycerin oder anti-fade Montage Reagenz) wird das Deckglas (1H) zu berühren. </li><li> Falls erforderlich, mehr Montage Medien durch Pipettieren direkt neben dem coverslip, mit einer Pipette in einem Bereich von 20 bis 200 ml. Es wird unter Docht. </li><li> Mit einem Labortuch, ganz sauber auf der Deckglas. Seien Sie sicher, um Druck auf das Deckglas nicht zu, da diese Embryonen schädigen. Dieser Bereich muss trocken sein und haben keine Vaseline oder Montage Medien auf sie. </li><li> Verwenden Sie Nagellack um den Rand des Deckglases (1I) abzudichten. </li></ol>

<ol><li>Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+Dbx+genes+in+the+zebrafish+spinal%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal.</a> Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).</li>
<li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midline+crossing+is+not+required+for+subsequent+pathfinding+decisions+in+commissural+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons.</a> Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).</li>
<li>Ross, A. B. J. Activation of Wnt signaling using Lithium Chloride: Inquiry-Based Undergraduate Laboratory Exercises. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoss%2C+ABJ+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. , In Press. (2012).</li>
<li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+patterning+are+mediated+independently+in+the+dorsal+spinal+cord+downstream+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proliferation and patterning are mediated independently in the dorsal spinal cord downstream of canonical Wnt signaling.</a> Dev. Biol. 313 (1), 398-407 (2008).</li>
<li>Gribble, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tcf3+inhibits+spinal+cord+neurogenesis+by+regulating+sox4a+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tcf3 inhibits spinal cord neurogenesis by regulating sox4a expression.</a> Development. 136 (5), 781-789 (2009).</li>
<li>England, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Hedgehog+pathway+components+and+retinoic+acid+signalling+in+specifying+zebrafish+ventral+spinal+cord+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Roles of Hedgehog pathway components and retinoic acid signalling in specifying zebrafish ventral spinal cord neurons.</a> Development. 138 (23), 5121-5134 (2011).</li>
<li>Challa, A. K., Beattie, C. E., Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+roundabout+orthologs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of roundabout orthologs in zebrafish.</a> Mech Dev. (1-2), 101-101 (2001).</li>
<li>Lee, J. S., Ray, R., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+three+zebrafish+roundabout+homologs+suggest+roles+in+axon+guidance+and+cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of three zebrafish roundabout homologs suggest roles in axon guidance and cell.</a> 221 (2), 216-230 (2001).</li>
<li>Downes, G. B., Waterbury, J. A., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+labeling+of+identified+zebrafish+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo labeling of identified zebrafish neurons.</a> Genesis. 34 (3), 196-202 (2002).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-regulated+oligodendrocyte+specification+from+radial+glia+in+the+spinal+cord+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Notch-regulated oligodendrocyte specification from radial glia in the spinal cord of zebrafish embryos.</a> Dev. Dyn. 237 (8), 2081-2089 (2008).</li>
<li>Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+exposed+to+alcohol+undergo+abnormal+development+of+motor+neurons+and+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).</li>
<li>de Soysa, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macondo+crude+oil+from+the+Deepwater+Horizon+oil+spill+disrupts+specific+developmental+processes+during+zebrafish+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Macondo crude oil from the Deepwater Horizon oil spill disrupts specific developmental processes during zebrafish embryogenesis.</a> BMC Biol. 10 (40), (2012).</li>
<li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Dev Dyn. 228 (3), 464-474 (2003).</li>
<li>Deschene, E. R., Barresi, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Targeted+Embryonic+Chimeras%3A+Zebrafish+Gastrula+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (31), (2009).</li>
</ol>

Keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen entweder Autor.

Seitlicher Anbau von festen Zebrafischembryonen Hilfen Visualisierung von Rückenmark-Entwicklung. Durch die Entfernung des Dotterkugel, wird der für außergewöhnliche mikroskopische Bildgebung erforderlich Arbeitsabstand reduziert. Unsere repräsentative Ergebnisse wurden mit der 24 hpf Stufe begrenzt, jedoch kann diese Technik schon HPF 18 verwendet werden, obwohl früher Embryonen sind schwieriger aufgrund der Größe des Embryos und der Zerbrechlichkeit des Gewebes zu sezieren. Diese Technik ist auch anwendbar auf Embryonen, die älter als 24 HPF. Durch die optische Klarheit des embryonalen Zebrafisch, der Fähigkeit, zukunfts genetischen Screens durchführen, Reverse Genetik und transgene Ansätze unterstützt, kann mehrere Entwicklungsprozesse untersucht werden. Dies beinhaltet Mitoseindices der neuronalen Vorläuferzellen mit Markierungen wie BrdU-und Anti-Phospho-Histon-März 4-06 und Strukturierung durch Expression von neuronalen und glialen Vorläufer Marker in der pax, nkx, dbx, und olig families 1,4-6. Reagenzien, Gliazellen und neuronale Bestimmung (wie gliafibrilläres-Protein (GFAP) und HuC / D) berichten 1,4,5,10 verwendet werden können. Neuronale Differenzierung Subtyp kann durch Expression von Insel, VSX, engrailed und gata 1,4-6 Gene analysiert werden. Und schließlich ist die Analyse der Axon Führung durch Antikörper, wie anti-acetyliertes Tubulin, 3A10 und ZNP-1 2,11,12 möglich. Obwohl andere Wirbeltiermodellsysteme (Maus und Küken) werden verwendet, um das Rückenmark Entwicklung zu studieren, nur der Zebrafisch erlaubt den gleichzeitigen Empfang von allen Entwicklungs Achsen in der intakten Embryo. Die offensichtliche Einschränkung dieses Ansatzes ist, dass die Embryonen festgelegt sind, die die Live-Darstellung ausschließt. Tatsächlich Entfernen (oder Beschädigung) der Dotter führt zu einem schnellen Tod des Embryos, ist es somit nicht möglich, den Arbeitsabstand in lebenden Embryos unter Verwendung dieser Technik zu reduzieren. Allerdings hoher Vergrößerung Rücken Cord Bildgebung in lebenden Embryonen möglich ist. Um das Eigelb bei Live-Bildgebung zu erhalten, können Embryonen in Depression Dias, die einen größeren Abstand zwischen der Probe und dem Deckglas bieten platziert werden. Alternativ können mehrere 22 mm x 22 mm Deckgläsern auf beiden Schlitten in einer 3 x 1 in Objektträger geklebt werden. Die Deckgläser dienen als &quot;Brücke&quot; für die darüberliegenden Deckglas. Wenn Embryonen sind älter als 18 hpf ist Tricaine verwendet, um Embryonen zu betäuben, um die Bewegung zu verhindern. Während ein Arbeitsabstand von 0,288 mm für deyolked Embryonen bei 24 hpf erforderlich, wenn mit lebenden Embryonen in Agarose eingebettet, mit intakten Eidotter, eine Mikroskoplinse mit einem Arbeitsabstand von 3,3 mm ausreichend. Alternativ kann Explantatkulturen deyolked aus Embryonen gewonnen mittels eines Plasmagerinnsel Immobilisierungstechnik 13 visualisiert werden. Verschiedene Populationen von Zellen durch die Verwendung von genetisch kodierte fluoreszierende Proteine ​​wie GFP, mCherry oder der photo beachtenWandel Kaede Farbstoff (um nur einige zu nennen). Ferner kann fluoreszenzmarkierten Zellen in chimären Embryonen auch mit diesem Ansatz 14 gesehen werden. Eine konsequente Montagetechnik, die für Monate stabil ist, ist ein wichtiges Werkzeug für Zell-und Entwicklungsbiologen. Diese einfache Technik ist reproduzierbar, was eine einfache Vergleich zwischen verschiedenen experimentellen Studien. Ferner wird die Ausrichtung der Embryonen in Reihen leicht ermöglicht Identifizierung spezifischer Embryonen für eine spätere Analyse.

Visualisierung des Rückenmarks im Zebrafisch ist durch eine Anzahl von Faktoren gehemmt. Aufgrund der Dicke der darüberliegenden Somiten und der inneren Lage des Rückenmarks ist eine beträchtlich lange Arbeitsabstand für Hochzellauflösung erforderlich. Der Dotterkugel (die noch während der frühen Stadien der Neurogenese vorhanden ist) erhöht weiter die erforderlichen Arbeitsabstand und ist leicht durch Druck von einem Deckglas beschädigt. Außerdem Trümmer von beschädigten Eigelb verbietet klare Visualisierung von Geweben. Obwohl Querschnitte in den dorso-ventralen (DV) Achse möglich sind, sie nicht leicht eine gleichzeitige Visualisierung in der anterior-posterior (AP) Achse 1. Um diese Hindernisse zu überwinden, werden Embryonen präpariert und auf Objektträger aufgebracht. Dieses Verfahren bietet mehrere Vorteile. Erstens liegen Zebrafischembryonen leicht mit der lateralen Seite nach oben, die AP-Achse Visualisierung erleichtert. Zweitens die Entfernung des Eigelbs ball verringert die erforderlichen Arbeitsabstand und begrenzt Schutt. Drittens erlaubt sowohl für Fluoreszenz-und Hellfeldmikroskopie das Montageverfahren zu. Viertens sind montiert Embryonen Monate stabil bei 4 ° C, wodurch längere Probe Visualisierung. Schließlich, daß vorderen Segmente auftritt Fortschreiten der Entwicklung sind reifer als Zahnbereich. Um sicherzustellen, dass inszeniert abgestimmt Rücken hemisegments zwischen Embryonen verglichen wird, wird überlagert Somitengewebe als Richtlinie. Zum Beispiel liegt über der zehnte hintersten Somiten den zehnten Rücken hemisegment, die entwicklungs Äquivalent in der Stufe abgestimmt Embryonen ist. Dieses Montageverfahren von intakten Embryonen ermöglicht die einfache Identifizierung von Somiten. Wir verwenden Genetik und Gen-Knock-down-Technologien, um die Mechanismen der Axon-Führung in der Entwicklung des Rückenmarks zu studieren. Insbesondere haben wir festgestellt, dass robo2, robo3 und DCC für Commissural Primär Asce erforderlichNding (COPA) Axon-Wegfindung. Mit der hier beschriebenen Montageverfahren, waren wir in der Lage, ventralen Wachstum, Mittellinienüberfahrt, commissure Breite, Rücken-und Vorder Wachstum 2,3 zu untersuchen. Dieses Montageverfahren kann auch auf DV-oder AP-Musterbildung des Rückenmarks eingesetzt werden. Wir haben dieses Verfahren verwendet, um unterschiedlichen Rollen von Wnt nachgeschalteten Effektoren in DV Strukturierung des Rückenmarks zu bestimmen. Mit dieser Montage, waren wir in der Lage, DV-Auflösung von Markern auf Einzelzellebene zu erhalten, und zu bestimmen, Minute Musterverschiebungen als Folge der veränderten Wnt-Signalempfang 4,5. Dieses Montageverfahren ermöglicht auch mitotische Indexberechnung durch anti-phosphohistone 3 oder BrdU-Markierung (Vorläufer Proliferation) 5 Differenzierung.

<table><tbody><tr><td>Petrischalen 35 mm x 10 mm</td><td>VWR</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td> Dumont Pinzetten #3 </td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9839169</td><td></td></tr><tr><td> Deckglas </td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B22X22-1,5</td><td></td></tr><tr><td> Folien </td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td> SlowFade Gold </td><td>Fisher Scientific</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td> ProLong Gold </td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td> Vaseline </td><td>jedes Lebensmittelgeschäft</td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Schlaufenhalter </td><td>VWR</td><td>80094-482</td><td></td></tr><tr><td> Insektenstifte </td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td> Vernickelte Stifthalter </td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12 </td><td></td></tr><tr><td>Olympus Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection und seitlicher anbau von zebrafisch-embryonen: analyse der rückenmarksentwicklung

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Der Zebrafisch Rückenmark ist eine effektive Untersuchungsmodell für Systemforschung Nerven aus mehreren Gründen. Erstens kann genetische, transgene und Gen-Knockdown Ansätze genutzt werden, um die molekularen Mechanismen, die der Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen. Zweitens großen Fängen der entwicklungs synchronisiert Embryonen bieten großen Versuchsprobengrößen. Drittens, die optische Klarheit des Zebrafischembryos erlaubt Forschern Vorläufer, glialen und neuronalen Populationen zu visualisieren. Obwohl Zebrafischembryonen transparent sind, können Probendicke wirksam mikroskopische Visualisierung behindern. Ein Grund dafür ist die Entwicklung von Tandem-Rückenmark und darüberliegenden Gewebe Somiten. Ein weiterer Grund ist die große Dotterkugel, die noch in Zeiten der frühen Neurogenese vorliegt. In diesem Artikel zeigen wir, Mikrodissektion und die Entfernung der Dotter in festen Embryonen, die mikroskopische Visualisierung ermöglicht es, während das umliegende Gewebe Somiten. Wir ALSo zeigen, semipermanente Befestigung von Zebrafischembryonen. Dies ermöglicht eine Beobachtung der Entwicklung des Nervensystems in den dorso-ventralen und anterior-posterioren Achsen, da sie die Dreidimensionalität des Gewebes bewahrt.

Bei der Aufklärung der Mechanismen, die verschiedenen Entwicklungsereignisse wie Zellmusterungs, Differenzierung und Axon Führung unterliegen, ist es wichtig, in der Lage, Zellen, die im Rahmen ihrer Gewebe zu visualisieren. Dorsoventraler Strukturierung Mängel in der Regel als eine ventrale oder dorsale Verschiebung der Expressionsdomäne von Transkriptionsfaktoren in der pax, nkx oder dbx Familien 4 vorhanden. Manchmal können Veränderungen subtil sein, das nur wenige Zelldurchmesser 4. Querschnittsanalyse ermöglicht diese Art der Analyse. Jedoch können Reagenzien mit schwächeren Signalen oder Querschnitte, die nicht senkrecht zu der Achse AP Interpretation beschränken. Ferner Querschnittsanalyse nicht ohne zu berücksichtigen, ob Änderungen bestehen in der AP-Achse, und ist auf die Verfügbarkeit eines Kryostaten. Diese Einschränkung wird durch Seitenansichten des Rückenmarks umgangen. Wie in 2B zu sehen ist, ist nkx6.1 mRNA detwa in der ventralen Hälfte des Rückenmarks bei 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) istributed, in der Vorläuferdomäne. Vorläuferzellen unterscheidbar von Post mitotischen Zellen aufgrund des Vorhandenseins der Bodenplatte, die im medialen Teil des Rückenmarks zu finden ist. Mit DIC Optik angesehen werden einzelne Zellen deutlich unterscheidbar, und eine definierte Grenzfläche zwischen exprimierenden und nicht exprimierenden Zellen, ist offensichtlich. Austrittsvorläuferzellzyklus wird durch Veränderungen in der Genexpression begleitet. Zum Beispiel werden alle post-mitotischen Neuronen auszudrücken HuC / D, die mit Immunzytochemie 1,5 nachweisbar ist. mRNA-Sonden für die Insel, gata und VSX Familien beschriften spezifische post-mitotischen Neuronen konsequente Position und Anzahl in jeder Rückenmark hemisegment 6. Zusätzlich werden Axon Führung Rezeptoren, wie sie in der Robo-Familie in begrenzten Populationen von postmitotischen Neuronen (2C) <sup&gt; 2,7,8. Seitlicher Anbau von Embryonen erlaubt eine genaue Zählungen der post-mitotischen Neuronen. Ebenso können Vorläuferzellen sich zu teilen, die weiterhin mit Anti-Phospho-Histon-3 Immunzytochemie sowie BrdU-Markierung quantifiziert werden. Weiterhin kann Zelltod mit TUNEL Kennzeichnung 4-6 bewertet. Bei 24 hpf können Axone der folgenden postmitotischen Neuronen mit verschiedenen Methoden sichtbar gemacht werden, und unterscheiden sich in der Einzelzellebene: Seitliche Rücken Aufsteigend (Dola), Commissural Primär Aufsteigend (COPA), Commissural Sekundär Aufsteigend (CoSA), ventrale Längs Absteigend (Steppe), Kolmer-Agdur (KA), Commissural gegabelten / Längs (CoB / L), Umlauf Aufsteigend (CiA), Umlauf absteigend (CID) und unipolar Commissural absteigend (UCoD), Rohon-Bart (RB), Motoneuronen ( M) 9. Axone verlaufen von dieser Neuronen im dorsalen, ventralen, vorderen und hinteren Richtungen. Sie Niederlassung, über die Mittellinie, und beenden Sie sowohl die Rückenund ventralen Rückenmark. In Verbindung mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie sind diese vielfältigen zellulären Verhaltensweisen deutlich in seitlich angebrachten Embryonen mit Hilfe der Immunzytochemie und genetisch kodierte Fluoreszenzproteine ​​wie GFP 2. In 2D wurde ZNP-1 Immunzytochemie verwendet werden, um die Entwicklung Motoneuronen zu beschriften. Motoneuronen verlassen das Rückenmark ventral um die umliegende Muskulatur innervieren entwickeln. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1.jpg" width="500px" /> Fig. 1 ist. Präparation und Montage seitlich von Zebrafischembryos. (A) Nach der Verarbeitung für Immunfluoreszenz in situ-Hybridisierung, etc., sind Embryonen in einer 35 mm Petrischale mit PBT gefüllten (PBS mit 0,5% Triton X-100) oder PTW (PBS mit platziert 0,1% Tween-20). Das EigelbBall (YB) ist offensichtlich. (B) Das Eigelb wird durch die Sicherung der Kopf des Embryos, gefolgt von sorgfältig seziert und entfernt. (C) Ein Embryo Poker (Angelschnur an einer Pasteur-Pipette aufgeklebt) auf separaten Embryonen und Eigelb Schutt (D) verwendet. Gereinigt Embryonen werden auf einen Mikroskop-Objektträger (E) pipettiert und ausgerichtet (F). (G) Vaselin an den Ecken des Deckglases aufgebracht. (H) Das Deckglas wird sanft auf der Embryonen in Montagemedium platziert. (I) Nagellack verwendet, um die Kanten des Deckglases zu versiegeln. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2.jpg" width="500px" /> &lt;<html> strong&gt; Abbildung 2. Analyse von Genexpressionsmustern und Axon Pathfinding in seitlich angebrachten Zebrafischembryonen. (A) Zeichnung eines Zebrafischembryos bei 24 hpf. In BD, sind etwa vier hemisegments über dem Dottersack-Erweiterung visualisiert (boxed-Bereich). (B) nkx6.1 wird im ventralen Rückenmark, einschließlich der Bodenplatte (FP) ausgedrückt. (C) robo3 in postmitotischen Neuronen (PMN) ausgedrückt. Die Bodenplatte und Vorläuferzone ist nicht ersichtlich, in diesem mehr seitliche Brennebene. In B, C, das Rückenmark durch eine Klammer auf der linken Seite des Bildes begrenzt. (D) Die konfokale Mikroskopie wurde an Bild ZNP-1-Immunfluoreszenz, der Motor Axone verlassen das Rückenmark ventral-Etiketten eingesetzt. In allen Abbildungen ist anterior der linken und dorsalen liegt. A 40X großen Arbeitsabstand, Eintauchen in Wasser (NA 0,8) Objektiv verwendet wurde (3,3 mm).oad/50703/50703fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Entwicklungsprozesse wie Proliferation, Strukturieren, Differenzierung und Axon Führung leicht im Zebrafisch Rückenmark modelliert werden. In diesem Artikel beschreiben wir ein Verfahren zur Montage Zebrafisch-Embryonen, die Visualisierung dieser Ereignisse optimiert.

Dissection und seitlicher Anbau von Zebrafisch-Embryonen: Analyse der Rückenmarksentwicklung

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Zebrafischembryonen zu präparieren und auf einem Objektträger zu montieren, um eine optimale mikroskopische Visualisierung des Rückenmarks zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine mikrochirurgische Präparation durchgeführt und der Eichenkern entfernt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Eichenreste zu entfernen und die Embryonen mit einer Pipette auf einen Objektträger zu übertragen.Anschließend wird die überschüssige Flüssigkeit vorsichtig mit einem Kim-Tuch entfernt, gefolgt von der Zugabe von Eindeckmedium. Der letzte Schritt besteht darin, die Embryonen auf dem Objektträger mit einem Embryonen-Poker auszurichten und dann den Deckglaser aufzusetzen. Abschließend wird mittels Fluoreszenz- oder Hellfeldmikroskopie die Verteilung der postmitotischen Zellkörper sowie die Bahn wachsender Axone dargestellt.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurobiologie zu beantworten, beispielsweise, welche Mechanismen für Musterbildung, Differenzierung und Axonführung verantwortlich sind. Obwohl diese Methode Einblicke in viele Aspekte der Entwicklung des Nervensystems ermöglicht, kann sie auch auf andere Gewebe wie sich entwickelnde Muskulatur angewendet werden. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da vor Beginn des Experiments eine Dissektion unter dem Mikroskop erforderlich ist.Stellen Sie einen Embryonen-Poker her, indem Sie eine Pipettenspitze an eine benutzte Pipette kleben und anschließend eine Angelschnur an die Pipettenspitze kleben. Um die Embryodissektion zu beginnen, geben Sie bis zu 30 Zebrafisch-Embryonen im Alter von 24 Stunden nach der Befruchtung in eine 35-Millimeter-Petrischale, die mit PBS gefüllt ist.Unter einem Stereomikroskop fixieren Sie den Kopf eines Embryos mit einer Pinzette, während Sie die Eichel mit einer Insektennadel wegziehen. Anschließend bewegen Sie die Embryonen mit einem Embryonestäbchen in einen Bereich der Petrischale, der möglichst wenig Dottertrümmer enthält. Danach saugen Sie die Embryonen in eine Glas-Pasteurpipette auf, wobei Sie so wenig Flüssigkeit wie möglich aufnehmen.Pipettieren Sie anschließend vorsichtig bis zu 21 Embryonen auf einen Objektträger. Entfernen Sie vorsichtig überschüssige Flüssigkeit mit einem Laborabwischpapier, wobei Sie darauf achten, die Embryonen nicht zu berühren, und geben Sie dann einen Tropfen Einbettmedium auf die Embryonen. Richten Sie danach mithilfe des Embryonenstäbchens die Embryonen in zwei bis drei Reihen seitlich aus.Tragen Sie nun einen Klecks Vaseline auf jede Ecke eines Deckgläschens auf. Drehen Sie das Deckgläschen, sodass die Seite mit der Vaseline nach unten zeigt, und legen Sie das Deckgläschen auf die Embryonen. Die Vaseline verhindert Schäden an den Embryonen durch übermäßige Kompression.Klopfen Sie gegebenenfalls vorsichtig an jeder Ecke der Deckglasplatte, bis das Einbettmedium das Deckglas berührt, wobei ein Pipettiergerät im Bereich von 20 bis hundert Mikrolitern verwendet wird. Fügen Sie weiteres Einbettmedium neben dem Deckglas hinzu und lassen Sie das zusätzliche Medium unter das Deckglas eindringen. Reinigen Sie nun mithilfe eines Laborwischtuchs den Bereich rund um das Deckglas vollständig. Üben Sie keinen Druck auf die Deckglasabdeckung aus, da dies die Embryonen beschädigen kann. Nach gründlicher Reinigung ist der Bereich trocken und frei von Vaseline oder Einbettmedium. Versiegeln Sie abschließend die Ränder des Deckglases mit Nagellack. Nach der Einbettung der Zebrafisch-Embryonen wurden mehrere HEMI-Segmente oberhalb der Eichelbeutelverlängerung sichtbar gemacht.Diese Abbildung zeigt die Expression von NK X 6.1 im ventralen Rückenmark des Zebrafischembryos. Die NK X 6.1-mRNA ist 24 Stunden nach der Befruchtung ungefähr in der ventralen Hälfte des Rückenmarks verteilt. Innerhalb der Vorläuferdomäne lassen sich Vorläuferzellen von postmitotischen Zellen anhand des Vorhandenseins der Bodenplatte unterscheiden, die sich im medialen Teil des Rückenmarks befindet.Im DIC-Kontrast betrachtet. Einzelne Zellen sind deutlich unterscheidbar, und eine definierte Grenze zwischen exprimierenden und nicht exprimierenden Zellen ist erkennbar. Der Ausstieg aus dem Zellzyklus in Vorläuferzellen geht mit Veränderungen in der Genexpression einher.Dieses Bild zeigt die Expression von robo drei in postmitotischen Neuronen. Die robo-Rezeptorfamilie gehört zu den Axon-Leitungsrezeptoren, deren Expression genaue Zählungen von postmitotischen Neuronen ermöglicht. Beachten Sie, dass Platte und das Vorläufergebiet in dieser weiter lateral gelegenen Fokusebene nicht erkennbar sind.Mittels konfokaler Mikroskopie wurde die Znp1-Immunfluoreszenz abgebildet, die wie in diesem seitlich montierten Embryo gezeigt motorische Axone markiert. Die motorischen Neuronen verlassen 24 Stunden nach der Befruchtung ventral das Rückenmark, um die umgebende sich entwickelnde Muskulatur zu innervieren. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 30 Minuten durchgeführt werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Integrität des Gewebes durch sorgfältige Mikrodissektion zu bewahren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie mikrodissektorische Techniken angewendet werden, um den Dott von Zebrafischembryonen zu entfernen, um sie anschließend einzubetten und mikroskopisch sichtbar zu machen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Neurowissenschaften

In diesem Video zeigen wir eine Methode, mit der sich entwickelnden Gehirn Wirbeltiere in Live Zebrafischembryonen bei einzelnen Zelle Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu analysieren. Dazu gehört auch die Methode, mit der wir spritzen die Single-Cell-Zebrafischembryo und anschließend montieren und Bild das sich entwickelnde Gehirn.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

Nach Durchtrennung des Rücken, erwachsenen Zebrafisch haben die funktionelle Erholung von 6 Wochen nach der Verletzung. Um die Vorteile der Larven Transparenz und schnellere Erholung zu nehmen, stellen wir ein Verfahren zur Durchtrennung des Rückenmarks Larven. Nach Durchtrennung beobachten wir sensorischen Erholung ab 2 Tage nach der Verletzung, und C-Bogen-Bewegung um 3 Tage nach der Verletzung.

Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Die Zebrafischembryo ist ein hervorragendes Modell für Entwicklungsbiologie Forschung. Während der Embryogenese entwickeln Zebrafisch mit einem Dottermasse, die dreidimensionale Herausforderungen für die Proben Beobachtung und Analyse präsentiert. Dieses Protokoll beschreibt, wie man zweidimensionale Flachmontage Zubereitungen der ganze Berg in situ (WISH) gefärbt Zebrafischembryo Proben erstellen.

Wohnung Berge Vorbereitung für Beobachtung und Analyse der Zebrafisch-Embryo Proben von Bunt Ganze Berge<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht Zeitraffer-Analyse der Organentwicklung in Genaktivität durch ein Fluoreszenzmikroskop mit Lage ist, eine optische Schnitte und einfache Strategien der Neueinstellung Sezieren fokale und planaren Drift zu korrigieren.

Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

Hier präsentieren wir eine vielseitige Einbettungsmethode, die die Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung der hinteren Körperentwicklung von lebenden Zebrafischembryonen ermöglicht, ohne die normale Entwicklung zu stören.

Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

Dieses Manuskript beschreibt Verfahren zur elektrophysiologischen Aufnahmen von spinalen Neuronen Zebrabärblingembryonen und Larven. Die Herstellung hält Neuronen in situ und beinhaltet oft minimale Dissektion. Diese Verfahren ermöglichen die elektro Untersuchung einer Vielzahl von spinalen Neuronen, von der ersten elektrischen Erregbarkeit Erwerb durch den frühen Larvenstadien.

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Hier beschreiben wir eine Methode, um die Größe von Zebrafisch-Embryonen zu reduzieren, ohne die normalen Entwicklungsprozesse zu stören. Diese Technik ermöglicht das Studium der Musterskalierung und der Entwicklungsrobuste gegen Größenwechsel.

Chirurgische Größenreduktion von Zebrafischen für die Erforschung der embryonalen Muster Skalierung

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Montage zerbrechlicher Zebrafischembryonen für eine längere konfokale Zeitraffermikroskopie. Diese kostengünstige Methode ist einfach mit normalen Glasbodenmikroskopie-Geschirr für die Bildgebung auf jedem invertierten Mikroskop durchzuführen. Die Montage erfolgt in Agaroseschichten in unterschiedlichen Konzentrationen.

Eine geschichtete Montagemethode für die verlängerte Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ganzer Zebrafisch-Embryonen

In vivo Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die zellulären Mechanismen zugrunde liegenden Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Technik zur Verwendung von Zeitraffer-Konfokalmikroskopie, um eine große Anzahl von mehrfarbigen Brainbow-markierten Zellen in Echtzeit innerhalb des sich entwickelnden Zebrafischnervensystems zu visualisieren.

Visualisierung des sich entwickelnden Gehirns bei lebenden Zebrafischen mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalbildnis

Hier stellen wir das Protokoll für die 3D-Gewebekultur der hinteren Körperachse des Zebrafischs vor, das eine Live-Untersuchung der Wirbeltiersegmentierung ermöglicht. Dieses Explant-Modell bietet Kontrolle über die Achsenverlängerung, die Veränderung von Morphogenquellen und die Subzellularauflösung auf Gewebeebene.

Eine 3D-Schwanz-Explant-Kultur zur Untersuchung der Wirbeltiersegmentierung bei Zebrafischen

Hier stellen wir eine Methode vor, mit der mehrere Zebrafisch-Larvenproben (Danio rerio) ausgerichtet und kryosektioniert und auf einem einzigen Objektträger für die räumliche transkriptomische Analyse gesammelt werden können.

Räumlich kompakte Anordnung von Zebrafischlarvenschnitten für die räumliche Transkriptomanalyse

Lernen Sie die Präparation und seitliche Montage von Zebrafisch-Embryonen für die mikroskopische Visualisierung des Rückenmarks. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Axonführung und neurobiologischen Entwicklungsprozessen.

Dissection und seitlicher Anbau von Zebrafisch-Embryonen: Analyse der Rückenmarksentwicklung

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