Dissection und seitlicher Anbau von Zebrafisch-Embryonen: Analyse der Rückenmarksentwicklung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Zebrafischembryonen zu präparieren und zu montieren, um eine optimale mikroskopische Visualisierung des Rückenmarks zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem die Eichenkugel zunächst mit Mikros präpariert und entfernt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Eichenreste zu entfernen und die Embryonen auf einen Objektträger zu pipettieren.

Anschließend wird die überschüssige Flüssigkeit vorsichtig mit einem Kim-Tuch entfernt, gefolgt von der Zugabe von Eindeckmedium. Der letzte Schritt besteht darin, die Embryonen mit einem Embryo-Schürhaken auf dem Objektträger auszurichten, gefolgt von der Anbringung des Deckglases. Letztendlich wird die Fluoreszenz- oder Hellfeldmikroskopie verwendet, um die Verteilung postmitotischer Zellkörper und den Verlauf der sich entwickelnden Axone zu zeigen.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Neurobiologie zu beantworten, z. B. welche Mechanismen für die Musterbildung, Differenzierung und Axonführung verantwortlich sind. Obwohl diese Methode Einblicke in viele Aspekte der Entwicklung des Nervensystems geben kann, kann sie auch auf andere Gewebe wie die Muskelentwicklung angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da vor Beginn des Experiments eine Sektion unter einem Mikroskop erforderlich ist.

Machen Sie einen Embryo-Poker, indem Sie eine Pipettenspitze auf eine frühere Pipette kleben und dann eine Angelschnur auf die Pipettenspitze kleben. Um mit der Embryonendissektion zu beginnen, setzen Sie bis zu 30 Zebrafischembryonen ein. Alter 24 Stunden nach der Befruchtung in eine 35 Millimeter große Petrischale, die mit PBS gefüllt ist.

Befestigen Sie unter einem Präpariermikroskop den Kopf eines Embryos mit einer Pinzette, während Sie die Eiche mit einer Insektennadel wegziehen. Verwenden Sie dann den Embryo-Schürhaken, um die Embryonen in einen Teil der Petrischale zu bringen, der nicht viele Dotterreste enthält. Als nächstes aspirieren Sie die Embryonen in eine Weidepipette aus Glas und ziehen so wenig Flüssigkeit wie möglich auf.

Pipettieren Sie dann vorsichtig bis zu 21 Embryonen auf einen Objektträger. Leiten Sie überschüssige Flüssigkeit vorsichtig mit einem Labortuch ab, vermeiden Sie es, die Embryonen zu berühren, und geben Sie dann einen Tropfen Einbettmedium auf die Embryonen. Als nächstes richten Sie die Embryonen mit dem Embryo Poker in zwei bis drei Reihen auf ihren Seiten aus.

Gib nun einen Klecks Vaseline auf jede Ecke eines Deckglases. Drehen Sie das Deckglas so, dass die Seite mit der Vaseline nach unten zeigt, und legen Sie das Deckglas auf die Embryonen. Die Vaseline verhindert, dass die Embryonen durch übermäßige Kompression geschädigt werden.

Klopfen Sie bei Bedarf vorsichtig mit dem Deckglas an jeder Ecke auf das Deckglas, bis das Eindeckmedium das Deckglas berührt, und zwar mit einer Pipette im Bereich von 20 bis hundert Mikrolitern. Fügen Sie weitere Eindeckmedien neben dem Deckglas hinzu und lassen Sie das hinzugefügte Medium unter dem Deckglas hindurchleiten. Verwenden Sie nun ein Labortuch, um das Deckglas vollständig zu reinigen.

Üben Sie keinen Druck auf das Deckglas aus, da dies die Embryonen beschädigen kann, wenn es richtig gereinigt wird, der Bereich trocken ist und sich keine Vaseline oder Eindeckmedien darauf befindet. Zum Schluss die Ränder des Deckglases mit Nagellack versiegeln. Nach dem Einsetzen der Zebrafischembryonen wurden mehrere HEMI-Segmente oberhalb der Verlängerung des Eichensacks sichtbar.

Diese Abbildung zeigt die Expression von NK X 6.1 im ventralen Rückenmark des Zebrafischembryos. Die NK X 6.1 mRNA ist 24 Stunden nach der Befruchtung etwa in der ventralen Hälfte des Rückenmarks verteilt. Innerhalb der Vorläuferdomäne unterscheiden sich Vorläuferzellen von postmitotischen Zellen durch das Vorhandensein der Bodenplatte, die sich im medialen Teil des Rückenmarks befindet.

Betrachtet mit DIC-Optik. Einzelne Zellen sind klar unterscheidbar und eine definierte Grenze zwischen exprimierenden und nicht-exprimierenden Zellen ist erkennbar. Der Austritt aus dem Zyklus der Vorläuferzellen geht mit Veränderungen in der Genexpression einher.

Dieses Bild zeigt die Robo-3-Expression in postmitotischen Neuronen. Bei der Robo-Rezeptorfamilie handelt es sich um Axonleitrezeptoren, deren Expression eine genaue Zählung postmitotischer Neuronen ermöglicht. Beachten Sie, dass die Bodenplatte und die Vorläuferzone in dieser eher lateralen Brennebene nicht sichtbar sind.

Die konfokale Mikroskopie wurde verwendet, um die Immunfluoreszenz von znp one abzubilden, die motorische Axone markiert, wie in diesem lateral montierten Embryo gezeigt. Die Motoneuronen verlassen das Rückenmark 24 Stunden nach der Befruchtung ventral, um die umgebende sich entwickelnde Muskulatur zu innervieren. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Integrität des Gewebes durch sorgfältige Mikrodissektion zu erhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Mikrodissektionstechniken anwenden können, um das Eigelb von Zebrafischembryonen für die Montage und mikroskopische Visualisierung zu entfernen.