Isolation von Fettgewebe Immune Cells

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Immunzellen des Fettgewebes zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zuerst die epidermalen Fettpolster entfernt werden. Im zweiten Schritt wird das Fettgewebe mit Kollagenase verdaut.

Anschließend wird die stromale Gefäßfraktion des Fettgewebes mittels Differenzialzentrifugation isoliert. Im letzten Schritt werden die Immunzellen des Fettgewebes mit Fluor-4-konjugierten Primärantikörpern markiert. Letztendlich kann der Anteil lebensfähiger Makrophagen und T-Zellen, die sich im Fettgewebe befinden, durch Durchflusszytometrie quantifiziert werden.

Hallo, ich bin Alyssa Hasty. Heute zeigen wir Ihnen, wie Sie Immunzellen aus Fettgewebe isolieren und quantifizieren können. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich des Immunstoffwechsels zu beantworten, z. B. wie sich Immunzellpopulationen im Fettgewebe nach genetisch-pharmakologischer oder ernährungsphysiologischer Manipulation verändern.

Das Verfahren wird heute von Arian Kennedy und Jeb demonstriert, oder Postdoc-Stipendiaten in meinem Labor. Nachdem Sie das Fell des eingeschläferten Tieres gründlich mit 70% Ethanol benetzt haben, machen Sie einen Schnitt auf der Ebene des Xiphoid-Prozesses und öffnen Sie die Brusthöhle, um das Herz freizulegen, wobei Sie darauf achten, dass keine großen Blutgefäße durchtrennt werden. Schneiden Sie als Nächstes den rechten Vorhof ab, damit das Blut und die Perfu Acht das Kreislaufsystem verlassen können.

Fassen Sie dann mit einer Pinzette das Herz und führen Sie vorsichtig eine Nadel durch die Spitze in den linken Ventrikel ein. Perfundierten Sie nun die Maus langsam mit 15 Millilitern sterilem PBS. Öffnen Sie dann die Bauchhöhle und entfernen Sie die Pereg-Gonadenfettpolster mit Sorgfalt, um jegliches Gonadengewebe zu vermeiden.

Legen Sie die Fettpolster in ein Molkeschiffchen auf Eis, das zwei Milliliter magnesium- und kalziumfreies DPBS enthält, das mit 0,5 % BSA ergänzt ist, und hacken Sie dann das Fettgewebe in feine Stücke. So sollte das Fett nach Beendigung des Zerkleinerns aussehen. Gießen Sie nun das gehackte Fettgewebehomogenat in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Spülen Sie das Webo mit einem Milliliter DPBS, ergänzt mit BSA, und gießen Sie die Wäsche in die konische Tube. Spülen Sie anschließend das WHE-Boot mit drei Millilitern Kollagenaselösung aus und gießen Sie die Wäsche in die Tube. Inkubieren Sie das Homogene in einem Rotationsschüttler für 20 Minuten bei 200 U/min und 37 Grad Celsius.

Geben Sie dann 10 Milliliter BSA-supplementiertes DPBS mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette zum Homogenat. Als nächstes iterieren Sie das verdaute Homogenat mehrmals und stellen das Röhrchen auf Eis. Führen Sie die Zellsuspension durch einen 100-Mikrometer-Filter in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Nachdem Sie die Zellen heruntergeschleudert haben, dekantieren Sie die Schlinge und läusen Sie dann die kontaminierenden Erythrozyten im Zellpellet der stromalen Gefäßfraktion aus. Mit drei Millilitern eines CK-Puffers. Fügen Sie schnell einen Faxpuffer hinzu, um den A-CK-Puffer zu neutralisieren.

Nach dem Waschen und der Repelletierung suspendieren die Zellen das Pellet wieder in Faxpuffer. Zählen Sie dann die lebensfähigen Zellen durch Trianblau-Ausschluss und verdünnen Sie die Zellsuspension weiter auf eine Endkonzentration von fünf bis 10 mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter. Beginnen Sie die Färbung, indem Sie die Zellen mit Anti-US-Antikörpern CD 16, CD 32 FC bis zu einer Endkonzentration von 0,5 bis einem Mikrogramm pro 10 μm an die sechs Zellen für 10 Minuten auf Eis inkubieren.

Teilen Sie dann die Zellen in mindestens 10 bis 10 bis sechs Aliquots und überführen Sie die Aliquote in 12 x 75 Millimeter große Polystyrol-Rundbodenröhrchen. Kombinieren Sie alle zusätzlichen Zellen in einer ausreichenden Anzahl von Röhrchen, um die erforderliche Kompensation und die modifizierte Fluoreszenz minus eine Kontrolle aufzunehmen. Geben Sie dann Fluor-4-konjugierte Primärantikörper und Isotypkontrollen in den entsprechenden Konzentrationen in die entsprechenden Röhrchen.

Nachdem Sie die Proben 30 Minuten lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius inkubiert haben, waschen Sie die Proben zweimal in zwei Millilitern Faxpuffer Resus und suspendieren Sie die Pellets in mehr als oder gleich 400 Mikrolitern Faxpuffer. Nach dem zweiten Waschen werden die Proben in neue 12 x 75 Millimeter große Polystyrolröhrchen mit rundem Boden umgefüllt, die mit 35-Mikrometer-Zellensiebröhrchen ausgestattet sind. Fügen Sie den entsprechenden Proben kurz vor der Analyse einen Viabilitätswürfel für die Unterscheidung lebender toter Zellen hinzu. Verwenden Sie dann eine nicht gefärbte Negativsteuerung, um die seitliche Streuung auf einer logarithmischen Skala und die Vorwärtsstreuung auf einer linearen Skala anzupassen.

Zeichnen Sie als Nächstes ein anfängliches Lichtstreugatter basierend auf dem zu analysierenden Zelltyp und passen Sie die Verstärkung der Photomultiplierröhre so an, dass sich die ungefärbten Zellen ganz links in einem Einzelparameter-Histogramm befinden, das ungefähr auf der Tendenz der beiden Markierungen für die entsprechenden Kanäle zentriert ist. Führen Sie unter Verwendung von Antikörper-Capture-Kompensationsbeads die Mehrfarbenkompensation durch und stellen Sie dann die experimentellen Gates basierend auf den zuvor vorbereiteten modifizierten Fluoreszenz-abzüglich-eins-Kontrollen ein. Sammeln Sie schließlich die entsprechende Anzahl von Ereignissen basierend auf der Prävalenz der interessierenden Population und zeichnen Sie die experimentellen Daten auf.

In dieser ersten Serie von Dichtediagrammen wurden stromale vaskuläre Fraktionszellen, die aus epidermalem Fettgewebe des Urins isoliert wurden, für F 4 80 und CD 11 B gefärbt, um Fettgewebemakrophagen zu identifizieren. Diese ersten drei Panels demonstrieren die anfängliche Gating-Strategie, einschließlich der Lichtstreu-Dublett-Unterscheidung und der Viaability-Gates. In den nächsten beiden Panels sind repräsentative modifizierte Fluoreszenz minus eine Kontrolle zu beobachten, die zum Einstellen der experimentellen Gates verwendet wurde.

In diesem Beispiel wurden die Antikörper F four 80 und CD 11 B durch geeignete Isotypkontrollen ersetzt, um Autofluoreszenz und unspezifische Bindung zu berücksichtigen. Die Quadrantengatter wurden dann gezeichnet, um die lebensfähigen F vier 80 CD 11 B positiven Fettgewebemakrophagen zu identifizieren. Der Anteil von F vier 80 positiven CD 11 B positiven Fettgewebsmakrophagen, die aus fettarmen und fettreichen Mäusen isoliert wurden, konnte dann verglichen werden, wie in diesen repräsentativen Dichtediagrammen dargestellt.

In dieser nächsten Serie von Panels wurde das anfängliche Lichtstreugatter auf die Lymphozytenpopulation beschränkt, um den Einschluss von autofluoreszierenden myeloischen Zellen zu vermeiden. In diesen letzten beiden Panelpaaren ist ein repräsentatives Gating für CD 4 positive und CD 8 positive Fettgewebe T-Zellen dargestellt. Lebensfähige Fettgewebs-Lymphozyten wurden zunächst für TCR R beta tcr gestoppt.

R-beta-positive T-Zellen aus Fettgewebe wurden dann für die Expression von CD 4 und CD 8 gegated. Anschließend konnte der Anteil der TCR-beta-positiven T-Zellen und der aus dem Fettgewebe von fettreichen und fettarmen Mäusen isolierten Zöliakie-4-positiven und Zöliakie-T-Zellen verglichen werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Immunzellen des Fettgewebes isoliert