Eine quantitative Assay für Zellmigration Murine Enteric neuralen Vorläuferzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Migrationspotenzial von enterischen Neurovorläuferzellen in Gegenwart verschiedener Wachstumsfaktoren zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst embryonale Dünndärme von Mäusen seziert werden, die von fluoreszierenden Neurokrustenzellen besiedelt sind. Der zweite Schritt besteht darin, mit einem vibrierenden Mikrotom 200 Mikrometer dicke Darmscheiben herzustellen.

Als nächstes werden diese Scheiben auf einem Kollagengel inkubiert, das Wachstumsfaktoren enthält. Der letzte Schritt besteht darin, die Scheiben abzuziehen, um die darunter liegenden wandernden Zellen freizulegen. Letztendlich wird die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um das Muster der wandernden Zellen innerhalb des Kollagengels zu zeigen.

Diese Methode kann helfen, eine Schlüsselfrage der Entwicklungsbiologie zu beantworten, wie z.B. ein besseres Verständnis des Zusammenspiels zwischen verschiedenen Signalwegen, die der Bildung des peripheren Nervensystems zugrunde liegen. 12 Tage nachdem ein Vaginalpfropfen gefunden wurde, die weibliche Maus einschläfern und die Gebärmutter entfernen, die Gebärmutter in eine mit Eis gefüllte Petrischale aus Glas legen. Kalte PBS: Schneiden Sie die Gebärmutter quer zwischen den einzelnen Deumschwellungen, um jede Implantationsstelle des Embryos unter einem Präpariermikroskop zu isolieren, und verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Muskelschicht der Gebärmutter zu entfernen.

Öffne den viszeralen Dottersack und das Amnion, um den Embryo freizulegen. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Blutgefäße durchtrennen und den Embryo mit dem Dottersack verbinden, da sie mit dem sich entwickelnden Darm verflochten sind. Führen Sie dann geschlossene Pinzetten in die Bauchhöhle direkt über der dunkelrot gefärbten Leber ein und lassen Sie sie öffnen.

Dadurch entsteht eine Queröffnung in der Bauchhöhle. Ziehen Sie die geöffnete Pinzette nach unten zum hinteren Ende des Embryos, um den Bauch vollständig zu öffnen. Nach dem Öffnen greifst du das Bindegewebe hinter der Leber und ziehst die Eingeweide heraus.

Achten Sie darauf, den Darm nicht zu brechen. Schneide den Dickdarm an einer beliebigen Stelle ab, um die Eingeweide vom Rest des Embryos zu befreien. Heben Sie sich den Schwanzteil für später auf.

Lösen Sie das Bindegewebe aus dem Blinddarm und dann aus dem Darm heraus und arbeiten Sie vorsichtig daran, sie nicht am rostralen Ende des Dünndarms zu verwunden. Schneiden Sie die Leber und den Magen sowie den Meso, den Nephros und die Genitalrippen ab, falls vorhanden. Zum Schluss isolieren Sie den Dünndarm, indem Sie den Blinddarm und den Dickdarm sowie das restliche Bindegewebe abschneiden.

Achten Sie wie zuvor darauf, den Darm nicht einzukerlen. Lassen Sie den Dünndarm in PBS so kurz wie möglich bei Raumtemperatur, bevor Sie ihn einbetten. Nachdem Sie den Embryo am Hals durchtrennt haben, notieren Sie die Anzahl der Schwanzsomiten, um das Stadium der Embryonalentwicklung genau zu bestimmen.

Bevor Sie mit der Embryonendissektion fortfahren, schmelzen Sie 1,5 Gramm Agros in 100 Millilitern PBS und halten Sie es bei 50 Grad Celsius. Bereiten Sie die Einbettungsform vor, indem Sie ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen der Länge nach schneiden, um etwa ein Viertel der Röhrchenwand herauszuschneiden. Gießen Sie das geschmolzene Agros in die Form und lassen Sie es abkühlen, bis es sich nur noch leicht warm anfühlt.

Wenn Sie fertig sind, halten Sie den Darm mit einer Pinzette am gefalteten rostralen Ende fest und ziehen Sie ihn sehr langsam durch den Agros, entlang der Länge der Form. Dies hilft, den Darm gerade zu halten, während die Agro-Sets das Gewebe freisetzen, sobald es beginnt, sich der Bewegung zu widersetzen, und die Ausrichtung des Darms bei rostraler Verhätschlung im Auge behalten. Stellen Sie die Form anschließend für zwei bis drei Minuten in den Kühlschrank, damit sie vollständig fest wird.

Sobald es fest ist, nehmen Sie das Agros aus der Form und schneiden Sie das überschüssige Agros an beiden Enden ab, wobei Sie Schnitte senkrecht zum Darm machen. Kleben Sie das rostrale Ende des Agros-Blocks auf die Metallstufe eines Mikrotoms und schneiden Sie den überschüssigen Aros an allen Seiten ab. Montieren Sie als Nächstes den Metalltisch auf der vibrierenden Mikrotomkammer.

Stellen Sie bei Bedarf den Winkel des Tisches so ein, dass der Darm so senkrecht wie möglich steht. Decken Sie die Probe mit eiskaltem PBS ab, bevor Sie die Mikrotonklinge bis auf wenige Millimeter unter die Pufferoberfläche bringen. Wenn Sie fertig sind, machen Sie 200 Mikrometer große Querschnitte des verhätschelten Dünndarms.

Sicherstellen, dass jede Agro-Scheibe einen vollständigen Darmabschnitt enthält. Legen Sie die frisch geschnittenen Scheiben vorsichtig auf ein zuvor vorbereitetes Kollagen-Gel. Legen Sie eine Scheibe in die Mitte jeder Vertiefung, um die Wanderung der Neurokammzellen aus den Auberginen zu ermöglichen, und inkubieren Sie die Scheiben drei Tage lang.

Nehmen Sie nach dieser Zeit die Scheiben vorsichtig mit einer Pinzette vom Kollagengel ab und achten Sie darauf, das darunter liegende Gel nicht zu beschädigen. Um sicherzustellen, dass das Zellmigrationsmuster nicht gestört wird, ist es wichtig, das Kollagengel während der nachfolgenden Inkubations- und Waschschritte nicht direkt zu berühren. Fixieren Sie die Zellen zunächst mit 500 Mikrolitern 4%PFA pro Vertiefung für eine Stunde bei Raumtemperatur.

Ersetzen Sie anschließend das Fixiermittel durch 500 Mikroliter DPI-Lösung pro Vertiefung und inkubieren Sie es 10 Minuten lang. Entfernen Sie bei Raumtemperatur vorsichtig die DPI-Lösung und waschen Sie jede Vertiefung dreimal fünf Minuten lang mit 500 Mikrolitern PBS. Fotografieren Sie abschließend die fluoreszierenden Zellen, die in das Kollagengel in jeder Vertiefung eingebettet sind.

In diesem Beispiel wurden Wachstumsfaktoren verwendet, um die Migration von GFP-exprimierenden enterischen Neurokrustenzellen zu stimulieren. Die gestrichelte Linie stellt die ungefähre Größe und Position des Plans dar. Bevor es aus dem Gel entfernt wurde, wurde festgestellt, dass die Anzahl und Ausbreitung von GFP-exprimierenden Zellen, die aus dem Darmexplan migrieren, bei behandelten im Vergleich zu unbehandelten Erkrankungen signifikant größer war.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Migrationspotenzial von enterischen neuralen Vorläuferzellen bestimmen können, indem Sie Darmschnitte über einem Kollagengel mit Wachstumsfaktoren inkubieren.