Name: Eine quantitative Assay für Zellmigration Murine Enteric neuralen Vorläuferzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T15:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Migration enterischer neuraler Vorläuferzellen quantitativ analysieren. Diese ex vivo-Methode nutzt Fluoreszenzmikroskopie und Kollagen-Gele, um Zellwanderung unter Wachstumsfaktoren zu untersuchen.

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Wir danken Denis Flipo für die Bildverarbeitung und Analyse Beratung und David W. Silver in dessen Labor die Gata4p [5 kb]-GFP-Mauslinie generiert wurde. Die Forschung im Labor wird von Pilon CIHR, NSERC, FRQS und FRQNT finanziert.

Ethik-Erklärung Experimente mit Mäusen wurden folgende Kanadischer Rat der Tierpflege-Richtlinien für die Versorgung und Manipulation von Tieren in der medizinischen Forschung durchgeführt. Protokolle, die die Manipulation der Tiere wurden von der Ethikkommission der Universität von Quebec in Montreal genehmigt (Comité institutionnel de Protection des Animaux, Referenznummer 0512-R3-650 bis 0513). 1. Herstellung von Kollagen-Gels Arbeiten Sie in einem steril unter einer Gewebekultur Kapuze. <ol><li> Bereiten Sie komplette 5x DMEM (Eagle modifiziertem essentiellen Medium) einschließlich Standard-Antibiotika. Man löst 3,37 g DMEM-Pulver und 0,925 g NaHCO 3 in 20 ml Wasser. Sterilisiert, indem sie durch ein 0,22 um-Filter. Hinzufügen von 2,5 ml sterilem 100x Penicillin / Streptomycin und 25 ml sterile hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum. Lagern bei 4 ° C </li><li> Auf Eis, mischen Sie 800 ulvon Collagen-I-Lösung (3,77 mg / ml in 0,02 N Essigsäure, filtersterilisiert), 600 ul 5x vollständigen DMEM und 17 &amp;mgr; l 1 N NaOH. Verdünnt mit sterilem Wasser auf ein Endvolumen von 3 ml. Fügen Sie relevanten Wachstumsfaktoren in der Mischung. Wir verwenden in der Regel GDNF bei 10 ng / ml zu ente NCC Migration anzuregen. </li><li> Kaution ca. 480 ul in jede Vertiefung einer einzelnen Zeile in einer 24-Well-Platte. Vermeiden Sie Luftblasen. Die restlichen Zeilen verwendet werden, um die Wirkung anderer Wachstumsfaktoren auf die Zellmigration testen. </li><li> Das Kollagen zu polymerisieren lassen mindestens 1 Stunde in einem sterilen Inkubator bei 37 ° C. </li></ol> 2. Präparation der Tiere 16 <ol><li> Richten Sie Paarungen und überprüfen Vaginalpfropf am nächsten Morgen. Tag E0.5 als Uhr am Tag der vaginale Stecker gefunden wird, isolieren die weibliche und warten Sie 12 Tage bis E12.5. </li><li> Anesthetize schwangere Mäuse mit Isofluran und einschläfern durch CO 2-Inhalation. </li><li> Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol. Heben Sie die Bauch skin und öffnen Sie den Bauch Hohlraum mit Dissektionsscheren. </li><li> Entfernen der Gebärmutter in eine Glaspetrischale mit eiskaltem PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) gefüllt. Schneiden Sie die Gebärmutter quer zwischen den einzelnen deciduum Schwellungen, jeden Embryo Implantationsstelle zu isolieren. </li><li> Die Arbeiten an jeder Implantationsstelle separat in einem anderen Glaspetrischale mit eiskaltem PBS gefüllt. Unter einem Binokular, feinen Pinzette verwenden, um die Muskelschicht der Gebärmutter zu entfernen. </li><li> Öffnen Sie die viszerale Dottersack und Amnion, um den Embryo zu offenbaren. Achten Sie beim Abtrennen der Blutgefäße Beitritt der Embryo mit der Plazenta / viszeralen Dottersack, da sie mit den Entwicklungs Darm verflochten. </li><li> Sever Kopf des Embryos am Hals. </li><li> Legen Sie eine geschlossene Zange in der Bauchhöhle des Embryos, knapp über dem dunklen rot gefärbten Leber und lassen Sie die Zange geöffnet von sich selbst (mehr anwenden Druck), um eine Queröffnung in den Bauch Hohlraum zu machen. Ziehen Sie die Zange geöffnet nach unten in Richtungdas hintere Ende des Embryos, um den Bauch vollständig zu öffnen. </li><li> Schnappen Sie sich das Bindegewebe hinter der Leber und aus dem Bauch ziehen den Mut, man aufpassen, nicht zu brechen, den Darm (der Dickdarm bis zum Anus beigefügt). </li><li> Schneiden Sie den Doppelpunkt, um die Eingeweide aus dem Rest des Embryos zu befreien. Der Schnitt kann an jeder Stelle entlang des Dickdarms werden. Reservieren Sie den Schwanzteil für später. </li><li> Herauszuarbeiten, die das Bindegewebe von der Blinddarm, dann den Rest des Darms. Achten Sie darauf, um den Darm gewickelt, während dies zu tun. </li><li> Schneiden Sie die Leber und Magen (auf dem rostralen Ende des Dünndarms), sowie die Urniere und Genitalleisten, wenn einige vorhanden sind. </li><li> Isolieren Sie den Dünndarm. Auch darauf achten, nicht um den Darm zu ersticken. Von nun an kann der rosrrocaudal Ausrichtung des Darmgewebe unter Verwendung des auf der rostralen Ende vorhanden scharfen Krümmung verfolgt werden. Lassen Sie den Dünndarm in PBS bei Raumtemperatur für so kurze Zeit wie möglich vor emBettwäsche (siehe Schritt 3.3). </li><li> Schließlich notieren die Anzahl der Schwanz Somiten für jeden Embryo das Stadium der embryonalen Entwicklung genau zu bestimmen. </li></ol> 3. Schnitte von embryonalen Darm <ol><li> Bevor Sie mit Embryo Dissektionen fortfahren, schmelzen 1,5 g Agarose in 100 ml PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) und halten bei 50 ° C </li><li> Gießen Agarose in eine Einbettungsform geschmolzen (zB ein geschlossener 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, die längs geschnitten auf etwa 1/4 der Rohrwand herausgeschnitten). Lassen Sie die Agarose abkühlen auf ca. 42-45 ° C, sollte es nur leicht warm an. </li><li> Betten Sie die embryonalen Darm, kurz bevor die Agarose erstarrt (dies kann mit einer Pinzette Tipps ausgewertet und 36-38 ° C um auftreten). Halten Sie den Darm mit einer Zange durch die gefaltete rostralen Ende, ziehen Sie es sehr langsam durch die Agarose entlang der Länge der Form. Dies hilft, den Darm gerade, während die Agarose-Sets zu halten. Lassen Sie die Tausgeben, sobald sie beginnt, zu wider bewegt. Verfolgen Sie die rostral-kaudale Ausrichtung der Darm. </li><li> Legen Sie die Form in einem Kühlschrank 2-3 Minuten, um zu gewährleisten, die Agarose wurde komplett eingestellt. </li><li> Nehmen Sie die Agarose aus der Form (indem Sie sie aus dem geöffneten Eppendorf-Röhrchen). Mit einer Klinge, nehmen Sie die überschüssige Agarose an beiden Enden, Kürzungen senkrecht auf den Darm. </li><li> Kleben Sie den rostralen Ende des Darms / Agarose blockieren Sie auf die Metallphase eines Mikrotom mit vibrierender Klinge. Schneiden Sie die überschüssige Agarose an den Seiten des Darms / Agarose-Block. </li><li> Montieren Sie den Metall Bühne, auf der vibrierenden Mikrotom Kammer. Wenn nötig, stellen Sie den Winkel der Bühne, so ist der Darm so senkrecht wie möglich (also senkrecht zur Klinge). Decken Sie die Probe mit eiskaltem PBS. Bringen Sie die Mikrotomklinge bis auf wenige Millimeter unter der Oberfläche Puffer. </li><li> Stellen Sie 200 um Vibratoms Querschnitte der Schwanz-die meisten Dünndarm, sicherzustellen, dass die each Agarose-Scheibe enthält eine vollständige Darmabschnitt. </li></ol> 4. Kultur der Darm Explantate <ol><li> Sanft legen das frisch geschnittene Darm / Agarose-Scheiben flach auf den Kollagen Gele mit einer Pinzette, indem eine Scheibe in die Mitte von jedem gut. </li><li> Inkubiere 3 Tage bei 37 ° C in einer feuchten 5% CO 2-Atmosphäre, um die Migration von NCC aus dem Explantat ermöglichen. </li><li> Nehmen Sie die Darm / Agarose-Scheiben aus dem Kollagen-Gel sehr vorsichtig mit einer Pinzette. Achten Sie darauf, um das Gel unter beschädigen. </li><li> Vermeiden direkt während der nachfolgenden Inkubation und Waschschritte, um Berühren der Kollagen-Gel, um sicherzustellen, dass die Zellmigrationsmuster nicht gestört wird. Fix mit 500 ul 4% PFA (Paraformaldehyd) (in PBS) pro Vertiefung 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Ersetzen Sie das Fixiermittel mit 500 ul DAPI (4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindol)-Lösung (5 pg / ml in PBS) pro Vertiefung und Inkubation 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie jede Vertiefung 3xmit 500 ul PBS für 5 min. </li><li> Fotografieren Sie die fluoreszierenden Zellen (GFP und DAPI-Kanäle) in der Kollagen-Gel in jedem gut eingebettet. </li></ol> 5. Bildanalyse Wir haben umfangreiche Verwendung von ImageJ 17 zu verarbeiten und zu quantifizieren, die nach Explantatkultur erzeugten Bilder. <ol><li> Beginnen Sie mit der Abbildung einer Mikrometer-Objektträger mit der gleichen Vergrößerung wie die fluoreszierenden Zell Fotografien. Messen Sie die Länge von einem Mikrometer in Pixeln (mit der Straight Line Tool). </li><li> Stellen Sie die Skala (Analyse / Set-Skala; Eingang Anzahl der Pixel / Mikron). </li><li> Für jedes Foto GFP-Fluoreszenz, ändern Sie das Bildformat auf 8-Bit-Graustufen (Image/Type/8-bit). </li><li> Passen Sie Intensität des Signals (Bild / Anpassen / Helligkeit / Kontrast). </li><li> Subtrahieren Sie die Hintergrundgeräusche, falls erforderlich (Prozess / Subtrahieren Hintergrund; stellen Sie den rollenden Ball Radius). </li><li> Stellen Sie eine Schwelle, um Zellen und Zellklumpen (Bild / Anpassen / Threshold), markieren Sie dieeinen Wende n anwenden, um die Klumpen (Process / Binary / Watershed) teilen. </li><li> Analysieren Teilchen Regionen von Interesse (ROI) zu spezifizieren und generieren Zellzahl-Statistik (Analyse / Analysieren Partikel; Set-Größe Mindest, um die verbleibenden Pixel auszuschließen). </li><li> Stellen Messoptionen zu Feret-Durchmesser (Analyse / Set Maße) enthalten. </li><li> Gruppe ROIs und messen als Ganzes der Feret-Durchmesser zu bestimmen, die Angabe der Zellausbreitung (Analysieren / Tools / ROI-Manager / Mehr / OR, dann ROI-Manager / Hinzufügen und ROI-Manager / Measure). </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir zeigen, wie unser Ex-vivo-Explantatkultur Technik kann verwendet werden, um genau zu quantifizieren ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von GDNF werden. Eine solche genaue Quantifizierung wird stark durch Verwendung von 200 um dicke Vibratoms Darmstücke statt große Stücke ungefähre Größe, wie zuvor beschrieben, 11,12,15 erleichtert. Tatsächlich ermöglicht uns das mit einer angemessenen Anzahl von Zellen in einem hoch reproduzierbare Einstellung zu arbeiten. Zu beachten ist, ermöglicht die g...

Neuralleistenzellen (NCC) sind eine Übergangszelltyp spezifisch für Wirbeltiere, die während der Embryonalentwicklung viele Derivate bildet. Diese Zellpopulation entsteht am Rand des neuronalen Platte, benachbart zu nicht-neuralen Ektoderm 1. Während Neurulation, Biegen der Neuralplatte NCC Orten entlang der dorsalen Rand der bildenden Neuralrohr. NCC laufen dann eine epitheliale-mesenchymale Transition, Trennung und die Migration weg von dem Neuralrohr. NCC besiedeln verschiedenen embryonalen Strukturen, einschließlich des Verdauungstraktes, wo sie den gesamten enterische Nervensystem (ENS) zu bilden, ein zusammenhängendes Netzwerk von Nervenknoten in der Darmwand eingebettet. Wie kürzlich Bewertung 2,3 haben viele Gene in der Entwicklung dieser komplizierten Struktur beteiligt. Die meisten der ENS wird aus einem kleinen Pool von NCC mit Ursprung aus dem Vagus Neuralrohr (dh rund um die potenziellen Hinterhirn / Rückenmark-Grenze) abgeleitet 4.Diese neuronalen Vorläuferzellen erreichen die Vorderdarm um embryonalen Tag (e) 9,0 bei Mäusen und dann kaudal wandern im Darm Mesenchym bis ca. EUR 15,0 um die ganze embryonalen Darm zu kolonisieren. Eine kleinere Teilmenge von Kolon neuralen Vorläuferzellen wird auch durch sakrale NCC, die den hinteren Darm in die entgegengesetzte Richtung bis zum Blinddarm 4 eindringen vorgesehen. Sowohl Vagus-und sakralen NCC erfordern mehrere migrations, Proliferation-, Überlebens-und Differenzierungsfördernde Hinweise, um vollständige Bildung des ENS zu gewährleisten. In dieser Hinsicht Tiermodellen - vor allem gentechnisch veränderte Mäuse - haben maßgeblich bei der Identifizierung von mehreren wesentlichen extrazellulären Liganden: GDNF (Glia-Zellen-derived neurotrophic factor), Endothelin-3, Neurotrophin-3, BMPs (Bone morphogenetische Proteine), Netrin sowie Sonic und Indian Hedgehog (Shh und Ihh) 10.05. Von diesen ist GDNF Signal durch die Transmembran-Rezeptor-Tyrosin-Kinase RET (während der Transfektion Rearranged) als th erkanntE kritischen Weg für die Anziehung und Führung von NCC nach und in der embryonalen Darm. GDNF ist durch den Darm ausgeschieden und Mesenchym bildet eine raumzeitlich gesteuert rosrrocaudal Gradienten, die direkt chemoattractive zu ente NCC, die ausdrücken, RET ist 11,12. Neben anderen Funktionen steuert der ENS Bewegung im Verdauungstrakt durch seine Wechselwirkung mit der glatten Muskulatur in der Darmwand. Abwesenheit von neuralen Ganglien im Anschlussbereich der Darm Ergebnisse in Hirschsprung-Krankheit: tonische Kontraktion des betroffenen Segments führt zu Verstopfung stromauf Anhäufung von aufgeschlossenen Material und massive Ausdehnung des Darms und Bauch. Hirschsprung-Krankheit tritt in etwa einem von 5.000 Lebendgeburten. Die rostro-kaudale Migrationsmuster von magensaft NCC ist vermutlich die wichtigsten Einflussfaktor auf die Ätiologie der Hirschsprung-Krankheit sein. Der Doppelpunkt, die am weitesten von der Quelle der Migration NCC und letzte Teil Bowel besiedelt zu werden, ist besonders anfällig für Mängel in der ENS-Bildung. In Übereinstimmung mit ihrer entscheidenden Rolle bei magensaftresistenten NCC Migration ist Störung der GDNF / RET Signalisierung der Haupt bekannte genetische Ursache von Morbus Hirschsprung 13. Um besser zu studieren, NCC und ENS Entwicklung, erzielten wir eine transgene Mauslinie - mit Namen Gata4p [5 kb]-GFP 14 -, in dem Migrations NCC mit Green Fluorescent Protein (GFP) markiert. Als nächstes perfektioniert ein ex vivo Zellmigrationsassay, durch andere Gruppen 11,12,15 aus veröffentlichten Arbeiten ausgelegt, die jetzt ermöglicht eine präzise Quantifizierung der ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren, wie GDNF.

<table><tbody><tr><td>DMEM Pulver</td><td>Wisent</td><td>219-010-XK</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Bioshop</td><td>SOB999</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip Vakuumfiltrationssystem in Biotechnologiequalität (0,22 Mikron)</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin-Lösung, 100x</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Wisent</td><td>095-150</td><td>Hochwertiges</td></tr><tr><td>Kollagen I</td><td>BD biosciences</td><td>354236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Bioshop</td><td>SHY700</td><td>Verdünnt aus 10 N Stamm, dann sterilfiltriert</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Cedarlane</td><td>CLCYT305</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon 24-Well-Platte</td><td>BD Biowissenschaften</td><td>353047</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Präparierschere</td><td>Fisher Scientific</td><td>089515</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Petrischale aus Glas</td><td>VWR</td><td>89000-306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td> für Zellkulturen <td>Leica</td><td>M125</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzetten</td><td>Fine Science Werkzeuge</td><td>11251-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Klinge</td><td>in</td> Biotechnologiequalität Feder <td>21</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Allzweck Instant Krazy Kleber Stift</td><td>Krazy Glue</td><td>KG824</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HM 650V Mikrotom mit vibrierender Klinge</td><td>Thermo Scientific</td><td>920110</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Tabelle der spezifischen Reagenzien und Ausrüstung.</td></tr></tbody></table>

eine quantitative assay für zellmigration murine enteric neuralen vorläuferzellen

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Neuralleistenzellen (NCC) sind eine vorübergehende und multiZellPopulation, die aus dem dorsalen Neuralrohr stammt und ausgiebig wandert in den Entwicklungswirbeltierembryo. Neben der Bereitstellung von peripheren Neuronen und Glia, NCC erzeugen Melanozyten sowie die meisten der Schädel-Gesichtsskeletts. NCC Migration und Differenzierung wird durch eine Kombination ihrer axialen Ursprung entlang des Neuralrohrs und ihrer Ausrichtung auf regional unterschiedliche extrazelluläre Signale gesteuert. Ein solcher Beitrag der extrazellulären Liganden bei der Bildung des enterischen Nervensystem (ENS), einem komplexen Netzwerk von miteinander verbundenen neuralen Ganglien, die lokal steuert (unter anderem) Darmmuskelbewegung und Darmmotilität besonders deutlich. In einem rostral Schwanz fashion - - über die gesamte Länge des zukünftigen Darm meisten der ENS wird aus einer kleinen Anfangs Pool von NCC, die eine lange Reise, um zu kolonisieren verpflichten abgeleitet. Unter mehreren Signalwege bekanntbeeinflussen ente NCC Kolonisation wird GDNF / RET-Signalisierung als wichtigste anerkannt. Tatsächlich ist zeitlich und räumlich gesteuert Sekretion des RET-Liganden GDNF durch den Darm Mesenchym vor allem für die Attraktivität und Anleitung von RET-exprimierenden ente NCC nach und in der embryonalen Darm verantwortlich. Hier beschreiben wir ein ex vivo Zellmigrationsassay unter Verwendung einer transgenen Mauslinie, die über fluoreszenzmarkierten NCC, die genaue Quantifizierung von ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren, einschließlich GDNF ermöglicht.

Die folgenden Ergebnisse sind repräsentativ dafür, was mit dem hier beschriebenen (1)-Technik erhalten werden. Die Verwendung von Wachstumsfaktoren (dh GDNF) stimuliert die Migration der GFP-exprimierenden ente NCC aus dem Darm in das Explantat und Kollagen-Gel (Abb. 2). Obwohl einige Zellen kommen aus dem Explantat in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren, sind diese meist nicht GFP-markierten und für passive Eintrag. Es ist notwendig, die Scheibe von dem Darm Kollagen-Gel, um die...

Wir stellen ein ex vivo-Assay, der die Zellmigration präzise Quantifizierung der ente Neuralleistenzellen Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren ermöglicht.

Eine quantitative Assay für Zellmigration Murine Enteric neuralen Vorläuferzellen

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Migrationspotenzial enterischer neuronaler Vorläuferzellen in Gegenwart verschiedener Wachstumsfaktoren zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die von fluoreszierenden Neurokrestzellen besiedelten embryonalen Dünndärme von Mäusen präpariert werden. Der zweite Schritt besteht darin, mit einem vibrierenden Mikrotom 200 µm dicke Schnitte der Därme anzufertigen.Anschließend werden diese Schnitte auf einem Kollagengel, das Wachstumsfaktoren enthält, inkubiert. Im letzten Schritt werden die Schnitte abgezogen, um die darunterliegenden wandernden Zellen freizulegen. Abschließend kommt die Fluoreszenzmikroskopie zum Einsatz, um das Muster der wandernden Zellen innerhalb des Kollagengels sichtbar zu machen.Mit dieser Methode kann eine zentrale Frage der Entwicklungsbiologie beantwortet werden, beispielsweise durch ein besseres Verständnis des Zusammenspiels zwischen verschiedenen Signalwegen, die der Bildung des peripheren Nervensystems zugrunde liegen. 12 Tage nach dem Auffinden eines Vaginalpfropfens wird die weibliche Maus euthanasiert und die Gebärmutter entfernt; die Gebärmutter wird in eine Glaspetrischale mit Eis gegeben. Unter einem Stereomikroskop wird die Gebärmutter mit kaltem PBS quer zwischen den einzelnen Dottersackanschwellungen durchtrennt, um jede Embryonenimplantationsstelle zu isolieren; mit feinen Pinzetten wird die Muskelschicht der Gebärmutter entfernt.Öffnen Sie den Eingeweidesack und das Amnion, um das Embryo freizulegen. Achten Sie darauf, die Blutgefäße vorsichtig zu durchtrennen, die das Embryo mit dem Eingeweidesack verbinden, da sie mit den sich entwickelnden Därmen verflochten sind. Danach setzen Sie geschlossene Pinzetten in die Bauchhöhle direkt oberhalb der dunkelroten Leber ein und öffnen Sie sie.Dadurch entsteht eine Queröffnung in der Bauchhöhle. Ziehen Sie die geöffnete Pinzette zum hinteren Ende des Embryos, um den Bauch vollständig zu öffnen. Öffnen Sie danach das Bindegewebe hinter der Leber und ziehen Sie die Eingeweide heraus.Darauf achten, die Därme nicht zu verletzen. Den Dickdarm an einer beliebigen Stelle durchtrennen, um den Darmtrakt vom restlichen Embryo zu lösen. Den Schwanzabschnitt für spätere Verwendung aufbewahren.Lösen Sie das Bindegewebe vom Blinddarm und anschließend vom Darmtrakt, wobei Sie sorgfältig darauf achten, das rostrale Ende des Dünndarms nicht zu verletzen. Entfernen Sie Leber und Magen sowie das Mesenterium, die Nephros und die Genitalleisten, falls vorhanden. Isolieren Sie abschließend das Dünndarmsegment, indem Sie Blinddarm und Colon sowie das verbleibende Bindegewebe abschneiden.Wie zuvor darauf achten, den Darm nicht zu verletzen. Den Dünndarm vor der Einbettung so kurz wie möglich bei Raumtemperatur in PBS aufbewahren. Nachdem das Embryo am Hals durchtrennt wurde, die Anzahl der Schwanzsomite erfassen, um das Entwicklungsstadium des Embryos genau bestimmen zu können.Bevor Sie mit der Präparation von Embryonen fortfahren, lösen Sie 1,5 Gramm Agaros in 100 Milliliter PBS auf und halten Sie die Lösung bei 50 Grad Celsius. Bereiten Sie die Einbettform vor, indem Sie eine 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhre längs schneiden, um etwa ein Viertel der Röhrenwand zu entfernen. Gießen Sie die geschmolzene Agaroslösung in die Form und lassen Sie sie abkühlen, bis sie nur noch leicht warm anfühlt.Wenn bereit, halten Sie den Darm mit einer Pinzette am gefalteten rostralen Ende fest und ziehen Sie ihn sehr langsam entlang der Länge der Form durch das Agar. Dies hilft, den Darm gerade zu halten, während das Agar aushärtet. Lassen Sie das Gewebe los, sobald es dem Vorschub zu widerstehen beginnt, und behalten Sie die rostrale Orientierung des Darms im Auge. Stellen Sie anschließend die Form für zwei bis drei Minuten in einen Kühlschrank, damit sie vollständig aushärtet.Nach dem Aushärten die Agarose aus der Form nehmen und die überschüssige Agarose an beiden Enden abschneiden, wobei die Schnitte senkrecht zum Darm verlaufen sollen. Das rostrale Ende des Agarose-Blocks mit der Metalloberfläche eines Mikrotoms verkleben und die überschüssige Agarose an allen Seiten abschneiden. Anschließend die Metalloberfläche in der Kammer des vibrierenden Mikrotoms befestigen.Falls erforderlich, justieren Sie den Winkel des Stages, sodass der Darm möglichst vertikal steht. Bedecken Sie die Probe mit eiskaltem PBS, bevor Sie die Mikrotomschneide bis auf wenige Millimeter unter die Pufferoberfläche absenken. Wenn bereit, stellen Sie 200 µm dicke transversale Schnitte des distalen Dünndarms her. Dafür sorgen, dass jeder Agroschnitt einen vollständigen Darmabschnitt enthält. Die frisch geschnittenen Schnitte vorsichtig auf ein zuvor vorbereitetes Kollagengel geben. Einen Schnitt in die Mitte jedes Wells legen, um die Migration von Neuralleistenzellen aus den Auberginen zu ermöglichen, und die Schnitte drei Tage lang inkubieren.Nach dieser Zeit die Schnitte vorsichtig mit einer Pinzette von dem Kollagengel abnehmen, wobei darauf geachtet werden muss, das darunterliegende Gel nicht zu beschädigen. Um sicherzustellen, dass das Zellwanderungsmuster nicht gestört wird, ist es wichtig, das Kollagengel während der anschließenden Inkubations- und Waschschritte nicht direkt zu berühren. Zunächst die Zellen mit 500 Mikrolitern 4 % PFA pro Mulde eine Stunde lang bei Raumtemperatur fixieren.Als Nächstes ersetzen Sie das Fixiermittel durch jeweils 500 Mikroliter DPI-Lösung pro Mulde und inkubieren 10 Minuten lang. Entfernen Sie die DPI-Lösung vorsichtig bei Raumtemperatur und waschen Sie jede Mulde dreimal mit jeweils 500 Mikrolitern PBS über jeweils fünf Minuten. Zuletzt fotografieren Sie die fluoreszierenden Zellen, die im Kollagengel in jeder Mulde eingebettet sind.In diesem Beispiel wurden Wachstumsfaktoren verwendet, um die Migration von GFP-exprimierenden enterischen Neurokrustzellen zu stimulieren. Die gestrichelte Linie markiert die ungefähre Größe und Lage des Explants. Bevor es vom Gel entfernt wurde, zeigte sich, dass die Anzahl und Ausbreitung von GFP-exprimierenden Zellen, die aus dem intestinalen Explant auswanderten, unter behandelten im Vergleich zu unbehandelten Bedingungen signifikant größer war.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie das Migrationspotenzial enterischer neuronaler Vorläuferzellen bestimmt werden kann, indem Dünnschnitte des Darms auf einem Kollagengel mit Wachstumsfaktoren inkubiert werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir zeigen, dass die Überexpression des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR) die Beweglichkeit der neuralen Stammzellen (NSCs) unter Verwendung eines neuartigen Agarosegel basierten mikrofluidischen Gerät verbessert. Diese Technologie kann ohne weiteres auf andere Säugetierzellen Systeme, bei denen Zellen Quellen sind rar, wie menschliche neurale Stammzellen, und die Umdrehung um Zeit ist von entscheidender Bedeutung.

Die Beurteilung Neural Stem Cell Motilität Mit einem Agarosegel-basierte Mikrofluidikvorrichtung

Dieses Protokoll beschreibt eine organotypischen Slice-Assay für die postnatale Gehirn und hochauflösenden Zeitraffer-Bildgebung von Neuroblasten Migration in der rostralen wandernde Stream optimiert.

Ein organotypischen Assay für High-Resolution Time-Lapse Imaging neuronaler Migration in der postnatalen Gehirn

In diesem Protokoll zeigen wir, wie Sie benutzerdefinierte Kammern, die die Anwendung eines Gleichstrom elektrisches Feld an Zeitraffer-Aufnahmen von erwachsenen Gehirn abgeleitete neurale Vorläuferzellen Translokation während Galvanotaxis ermöglichen ermöglichen konstruieren.

A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field

Dieses Video demonstriert den Neurosphären-Migrationsassay für neuronale Vorläuferzellen – ein In-vitro-Assay zur Untersuchung der Migrationsreaktion von neuronalen Vorläuferzellen aus der Neurosphäre – mittels mikroskopischer Analyse.

NPC Neurosphere Assay: Ein in vitro Assay zur Beurteilung der Migrationsreaktion von neuralen Vorläuferzellen aus der Neurosphäre

Hier beschreiben wir eine Schwann-Zellen (SC) Migration Assay, in dem SCs sind in der Lage zu entwickeln entlang erstreckt Axone.

Analyse Murine Schwann Zell Entwicklung entlang wachsenden Axone

Neuroblast Migration ist ein entscheidender Schritt in der postnatalen Neurogenese. Das hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um die Rolle der Regulatoren der Neuroblast Kandidat Migration durch den Einsatz von DNA / kleine Haarnadel-RNA (shRNA) Nukleofektion und eine 3D-Migrationsassay mit Neuroblasten aus dem Nagetier postnatale rostralen Migrationsstrom getrennt zu untersuchen.

Nucleofection von Nagerneuroblasten zu Neuroblast Migrationsstudie<em&gt; In-vitro-</em

Die Transplantation von neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellen (NPCs) hält große Versprechungen in der regenerativen Neurologie. Die systemische Verabreichung von NPCs ist in effektive, invasiv und therapeutisch sehr wirksam Protokoll wandte sich Stammzellen im Gehirn und Rückenmark von Nagern und Primaten durch experimentelle chronisch entzündliche Schädigung des zentralen Nervensystems betroffen zu liefern.

Die systemische Injektion von Neural Stem / Progenitor-Zellen in Mäusen mit chronischer EAE

Der Übergang von Epithel zu Mesenchym (EMT) ermöglicht es Krebserkrankungen, invasiv zu werden. Zur Untersuchung der EMT wird ein auf neuralen Stammzellen (NSC) basierendes In-vitro-Modell beschrieben, das frei von Serum und Enzymen ist. Dieses standardisierte System ermöglicht die quantitative und qualitative Bewertung der Zellmigration, der Gen- und Proteinexpression. Das Modell eignet sich für die Wirkstoffforschung.

Ein Enzym- und Serumfreie Neural Stem Cell Culture Modell für EMT Investigation Geeignet für Drug Discovery

Neurodevelopmental Prozesse wie Proliferation, Migration und Neurit Auswuchs bei neuropsychiatrischen Erkrankungen oft gestört sind. So präsentieren wir Protokolle, um schnell und reproduzierbar Diese Entwicklungsstörungen Prozesse im menschlichen iPSC-abgeleitete NPCs zu beurteilen. Diese Protokolle ermöglichen auch die Bewertung der Auswirkungen der relevanten Wachstumsfaktoren und Therapeutika auf NPC-Entwicklung.

Schnelle Erkennung von Entwicklungsstörungen Phänotypen in menschlichen neuronalen Vorläuferzellen (NPCs)

Wir präsentieren drei einfache In-vitro-Assays – den Fernmigrations-Assay, den Co-Kultur-Migrations-Assay und den Chemo-Attraktions-Assay,der die Funktionen menschlicher Stammzell abgeleiteter periventrikulärer Endothelzellen und deren Interaktion mit GABAerge Interneurons.

Migration, Chemo-Attraktion und Co-Culture-Assays für menschliche Stammzell-abgeleitete Endothelzellen und GABAerge Neuronen

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Viele Gene sind an diesem Prozess beteiligt. Dieses Protokoll stellt die Technik für die Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen vor.

Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Erfahren Sie, wie Sie die Migration enterischer neuraler Vorläuferzellen quantitativ analysieren. Diese ex vivo-Methode nutzt Fluoreszenzmikroskopie und Kollagen-Gele, um Zellwanderung unter Wachstumsfaktoren zu untersuchen.

Eine quantitative Assay für Zellmigration Murine Enteric neuralen Vorläuferzellen

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