Erkennen Somatische Genetische Veränderungen in Tumorproben von Exon-Abscheidung und-Massively Parallel Sequencing

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, somatische Mutationen in krebsassoziierten Genen von Zellen aus Tumorgewebe unter Verwendung von barcodierten Multiplex-DNA-Bibliotheken zu identifizieren, gefolgt von einer massiv parallelen Sequenzierung. Dies wird erreicht, indem zunächst barcodierte Sequenzierungsadapter an DNA-Fragmente gebunden werden, die aus konservierten Tumoren isoliert wurden. Der zweite Schritt des Verfahrens ist die Hybridisierung mit kundenspezifischen biotinylierten Oligonukleotiden, die komplementär zu allen Proteinbeschichtungsexons von 279 Onkogenen und Tumorsuppressorgenen sind.

Der dritte Schritt besteht darin, eine massiv parallele Sequenzierung der Barcode-Pools aus den erfassten Bibliotheken durchzuführen. Der letzte Schritt besteht darin, die Sequenzdaten nach krebsassoziierten Veränderungen für die 279 Zielgene zu durchsuchen. Dieses Verfahren kann Sequenzmutationen, kleine Insertionen, kleine Deletionen, Veränderungen der Kopienzahl und ausgewählte strukturelle Veränderungen aufdecken.

Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden bestehen darin, dass sie es ermöglicht, ganze Exons sowohl auf die häufigen als auch auf die seltenen Mutationen zu untersuchen, zusätzliche genomische Veränderungen wie Kopienzahlverluste und -gewinne zu identifizieren und eine höhere Sensitivität in heterogenen Proben zu erreichen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Krebsgenomik zu beantworten, z. B. was sind die wichtigsten Treibermutationen bei verschiedenen Krebsarten und korrelieren diese Mutationen in klinischen Proben mit den Ergebnissen oder dem Ansprechen auf zielgerichtete Therapien? Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose und Behandlung von Krebs, da Mutationen prospektiv identifiziert und verwendet werden können, um Patienten zu geeigneten Therapien und klinischen Studien zu führen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da ein Bienenreinigungsschritt schwer zu erlernen ist, da beim Waschen und Vermeiden von DNA von den Kügelchen eine Vorsichtstechnik erforderlich ist. Bereiten Sie den Endreparatur-Mastermix vor. Mischen Sie die entsprechenden Volumina, um 50 Mikroliter pro Probe zu erhalten. Aliquotieren Sie die 50 Mikroliter jeder reinen DNA in separate Vertiefungen einer ID-Platte mit sechs Vertiefungen.

Geben Sie dann 50 Mikroliter des vorbereiteten Endreparatur-Mastermixes zu jeder Reaktion und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 20 Grad Celsius in einem Thermocycler, um die Reaktion zu reinigen. Geben Sie zunächst 200 Mikroliter AMP pure XP Kügelchen in jede Probe und pipettieren Sie das gesamte Volumen vorsichtig 10 Mal mit einer Mehrkanalpipette auf und ab. Inkubieren Sie die Platte anschließend 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Schieben Sie dann die Platten auf den Magnetständer und lassen Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gehen. Entfernen und entsorgen Sie nach dem Entfernen vorsichtig den größten Teil des Überstands und achten Sie darauf, die Perlen nicht zu stören. Es kann sein, dass etwas Flüssigkeit in den Vertiefungen verbleibt.

Geben Sie dann vorsichtig 200 Mikroliter frisch zubereitetes 80%iges Ethanol zu jeder Probe und inkubieren Sie die Platte 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur. Pipettieren Sie das Ethanol vorsichtig weg und wiederholen Sie den Waschgang noch einmal. Lassen Sie den Teller anschließend bei Raumtemperatur trocknen, bis der gesamte Alkohol entweicht.

Nun resuspendieren Sie die getrockneten Kügelchen in 44,5 Mikrolitern sterilem Wasser. Lassen Sie jede Probe mit dem letzten Auswurf 10 Mal vorsichtig durch die Pipette fließen. Spülen Sie alle Perlen ab, die an der Seite der Vertiefung befestigt sind.

Inkubieren Sie nun die in Wasser suspendierten Kügelchen zwei Minuten lang bei Raumtemperatur und stellen Sie sie dann fünf Minuten lang auf den Magnetständer, bis die Vertiefungen klar sind. Übertragen Sie abschließend vorsichtig 42 Mikroliter des klaren Überstands in jede Vertiefung, die die Probe enthält, in eine neue Vertiefung. Die Proben können nun bis zu einer Woche bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

Beginnen Sie mit der Zubereitung des D-Tailing-Mastermixes in einem sterilen Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie acht Mikroliter des vorbereiteten DA-Tailing-Mastermixes in jede Vertiefung der endreparierten DNA. Dann inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Thermocycler, um die Reaktion zu reinigen.

Verwenden Sie das gleiche Verfahren, das im vorherigen Abschnitt beschrieben wurde, mit dem doppelten Volumen und schließen Sie mit Resus ab, indem Sie die Kügelchen in 33,75 Mikrolitern sterilem Wasser suspendieren. Zu diesem Zeitpunkt können die Proben dann bis zu einer Woche bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Um fortzufahren, bereiten Sie einen Ligations-Mastermix für 15 Mikroliter pro Reaktion vor.

Geben Sie 15 Mikroliter des Ligations-Mastermixes in jede Vertiefung, die die D-Schwanz-DNA enthält. Fügen Sie anschließend 1,25 Mikroliter der entsprechenden 25 Mikromolaren hinzu. Nächster Flex-Barcode-Adapter.

Für jede Probe sollte ein separater Barcode-Adapter verwendet werden. Sobald die Adapter geladen sind, inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei 20 Grad Celsius. Führen Sie nun mit 50 Mikrolitern Kügelchen eine Reinigung nach der Adapterligation durch und resuspendieren Sie die Probe in sterilem Wasser auf 50 Mikroliter.

Führen Sie dann den Reinigungsvorgang ein zweites Mal durch und schließen Sie mit 23 Mikrolitern Wasser ab. Zu diesem Zeitpunkt können die Proben dann bis zu einer Woche bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Der nächste Schritt besteht darin, jede Probe in der Bibliothek zu amplifizieren, was im Textprotokoll über das Auftauen von Eis, den universellen und Index-Oligonukleotidblockern, der CCAP easy Library und den flinken Gen-Capture-Komponenten, zu denen der con TNA Two X-Hybridisierungspuffer und die Hybridisierungskomponente gehören, detailliert beschrieben ist.

A.Bereiten Sie nun einen ein-millimolaren Pool von Index-Oligonukleotidblockern her, der den spezifischen barcodierten Adaptersequenzen entspricht, die bei der Bibliotheksvorbereitung verwendet werden. Kombinieren Sie einen Mikroliter von jedem Blocker und wirbeln Sie sie 10 Sekunden lang zusammen. Bereiten Sie in einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen die Auffangmischung vor, die aus fünf Mikrolitern Conte A zu einem Milligramm pro Milliliter, zwei Mikrolitern Universalblocker und zwei Mikrolitern des Blockerpools besteht. Fassen Sie 24 Barcode-Bibliotheken in einer einzigen Reaktion zusammen.

Fügen Sie dem Capture-Mix insgesamt ein bis drei Mikrogramm gepoolte Barcode-Sequenzbibliothek hinzu. Stanzen Sie 15 bis 20 Löcher in die Kappe mit einer Nadelgeschwindigkeit von 20 oder weniger und vakuumieren Sie die Mischung in einem DNA-Vakuumkonzentrator bei 60 Grad Celsius, bis sie vollständig trocken ist. Rehydrieren Sie anschließend die Mischung in Hybridisierungspuffer und Hybridisierungskomponente A.Decken Sie die Löcher in der Kappe mit Klebeband ab und wirbeln Sie die Probe 10 Sekunden lang ein.

Dann zentrifugieren Sie die Mischung 10 Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit. Inkubieren Sie die Mischung nun kurz bei 95 Grad Celsius, um die DNA zu denaturieren. Anschließend erfolgt eine 10-sekündige Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit bei Raumtemperatur in einem 0,2-Milliliter-PCR-Streifenröhrchen, mischen Sie 2,25 Mikroliter ccap Easy Library Capture-Sonden mit dem gleichen Volumen an sterilem, nukleasefreiem Wasser.

Mischen Sie dann bei der Zentrifugenreaktion in das Röhrchen und lassen Sie das Gesamtvolumen 10 Mal vorsichtig durch eine Pipettenspitze fließen. Inkubieren Sie nun das 0,2-Milliliter-Röhrchen in einem Thermocycler bei 47 Grad Celsius für 48 bis 96 Stunden. Halten Sie die Deckeltemperatur des Thermocyclers bei 57 Grad Celsius, um eine Verdunstung zu verhindern und die Reaktionstemperatur Tage später zu stabilisieren.

Verwenden Sie die Schritte zum Waschen und Bergen der erfassten DNA. Anschließend wird ein modifiziertes Nimble-Gen-Protokoll von Roche verwendet, um das Finish der eingefangenen DNA zu amplifizieren, indem die amplifizierte erfasste DNA mit dem Qubit-Assay mit hoher Empfindlichkeit quantifiziert wird. Ein Pool von 24 barcodierten Sequenzbibliotheken, die 12 Tumornormalpaare enthielten, wurde mit Sonden von 279 Krebsgenen erfasst und als zwei mal 75 sequenziert.

Basenpaar-Reads auf einer einzigen Spur eines HighSeq 2000-Flusszelltumors und normaler Bibliotheken wurden in einem Verhältnis von zwei zu eins gepoolt. Das IGV-Bild zeigt die Spezifität der Sequenzabdeckung an den EGFR-Exons bei Lungenkrebs; graue Balken stellen einzigartige Sequenz-Reads dar. Die heterozygote T-2-G-Mutation auf der rechten Seite war in 24 % der Reads vorhanden, was darauf hindeutet, dass es sich um eine somatische L-8-58R-Aminosäuresubstitution handelt.

Keine der Reads von normalem Lungengewebe zeigte diese TTA G-Mutation, einige Indels in einem kolorektalen Krebstumor, normales Paar zeigten eine somatische Frameshift-Insertion in einem PC oder eine somatische Frameshift-Deletion von sieben Basenpaaren. In TP 53 wurden auch Veränderungen der Kopienzahl zwischen Tumor-Normalpaaren beobachtet. Jeder Datenpunkt repräsentiert ein einzelnes Exon von 279 Zielgenen.

Gewinne und Verluste bei der Kopienzahl werden aus Zu- und Abnahmen der Tumorsequenzabdeckung abgeleitet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechseinhalb Stunden für die gemeinsame Nutzung der Bibliotheksvorbereitung und in 48 bis 96 Stunden für die Capture-Hybridisierung durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Assays ist es äußerst wichtig, während der Bibliotheksvorbereitung auf Verunreinigungen zu achten, da dies die Datenanalyse beeinträchtigen kann. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Sanger-Sequenzierung und die Fragmentanalyse durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten wie: Wie validiere ich eine fragwürdige Veränderung? Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie DNA-Bibliotheken mit Barcodes vorbereiten und die Exxon-Erfassung für diese gepoolten Bibliotheken durchführen.