Name: Nanomechanics von Drug-Target-Interaktionen und Antibakterielle Widerstand Erkennung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-25T09:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Erfahren Sie, wie Nanomechanik mit Cantilever-Sensoren Antibiotikaresistenzen quantifiziert. Diese Methode misst mechanische Veränderungen bei Drug-Target-Interaktionen bakterieller Zellwandmodelle direkt.

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Joseph W. Ndieyira wurde vom Engineering and Physical Sciences Research Council (EPRSC), Interdisziplinäres Zentrum in der Nanotechnologie (IRC), der Royal Society (RS) und Biano Beratung (BNC) unterstützt. Wir danken, Alejandra Donoso Barrera, Dejian Zhou, Manuel Vögtli, Matthew Batchelor, Matthew A. Cooper, Torsten Strunz, Trevor Rayment und Gabriel Aeppli für hilfreiche Diskussionen.

1. Vorbereitung der Ausleger <ol><li> Mit Teflon Pinzette eintauchen ausgewählte Anzahl von Cantilever-Chips (je Ausleger beträgt 500 &amp;mgr; m lang, 100 um breit und 0,9 um dick) in eine frisch zubereitete Piranha-Lösung (bei ​​1:1 H 2 SO 4 und H 2 O 2) für 20 min . </li><li> Nach etwa 20 min entfernen Sie die Cantilever-Chips von Piranha-Lösung und spülen Sie sie gründlich mit VE-Wasser und sofort in eine frisch zubereitete Piranha-Lösung übertragen. Wiederholen Sie Schritt 1.1 oben, wenn die Chips Flecken von Schmutz ansonsten mit dem nächsten Schritt fortfahren enthalten. </li><li> Nach einer gründlichen Reinigung in VE-Wasser, mit reinem Ethanol spülen und trocknen die Cantilever-Chips auf einer Heizplatte bei 75 ° C, um jegliche Spuren von Wasser zu entfernen. Überprüfen Sie sie mit einem optischen Mikroskop, um ihre Sauberkeit zu bestätigen. </li><li> Übertragen Sie die gereinigt Cantilever-Chips zu einer Verdampfungskammer und abzupumpen, Targeting, um ein Vakuum zu erreichenDruck von 10 mbar -7. </li><li> Ist der gewünschte Unterdruck erreicht ist, Mantel einer Seite jeder Trägeranordnung mit einer 2 nm Titan erste dient als Haftschicht vor einer zusätzlichen Schicht von 20 nm Gold dick. Um ihre Stärke zu bestätigen, verwenden Quarz Monitor direkt über dem Ziel-, Quell platziert. </li><li> Lassen goldbeschichteten Ausleger Sensorchips in der Kammer für 1-2 Stunden unter Vakuum vor dem Öffnen kühlen. </li><li> Übertragen Sie die frisch verdampft Chips auf ein Vakuum Vorratsbehälter mit Argon gefüllt, um jede Form von Kontaminationen zu verhindern. </li></ol> 2. Cantilever Chip Funktionalisierung <ol><li> Zunächst ordnen Mikro-Kapillar-Röhrchen auf einem Funktionalisierung Stufe 2 gemäß der Ausleger Stellplatz von 250 um. </li><li> Dann injizieren 2 mM ethanolischen Lösungen von Thiol Oberfläche Zielmoleküle, dh Bakterien mucopeptides (D-Ala und D-Lac) und eine &#39;inert &#39;Alkanthiol endet in Triäthylenglykol (PEG) bekannt, molekularbiologische Adsorption widerstehen. Jedes der 16 Kapillare Schläuche sollte eine sortierte Oberfläche Einfangmoleküle Zufallsprinzip Benutzer Verzerrungen zu vermeiden bestimmt. </li><li> Weiter Inkubation für 20 min die Ausleger in der Mikrokapillaren mit Thiol enthaltenden Lösungen Oberfläche Erfassung Molekülen gefüllt. Stellen Sie sicher, dass die Lösungen der Oberfläche Einfangmoleküle auf jeden einzelnen Cantilever-Sensor zu vermeiden oder zu minimieren Kreuzkontaminationen beschränkt sind. Wenn dieser Prozess vollständig eingesetzt wird, sollte es systematisch verändern die frisch hergestellten Gold beschichteter Cantilever in chemisch aktiven Sensoren, indem SAMs von bakteriellen Mucopeptid Ziele auf Gold beschichtete Oberflächen als Rezeptoren bilden. </li></ol> 3. Lösung Vorbereitungen <ol><li> Löst 0,1 M mono-und di-basic Natriumphosphatsalzen in Reinstwasser (18,2 MOhm · cm spezifischer Widerstand) und mischen to ergeben einen pH-Wert von 7,4. </li><li> In 0,002% PS80 an die gepufferte Lösungen, um die Aggregation Auswirkungen durch unspezifische Wechselwirkungen von Medikamenten Moleküle an die Glaswaren zu minimieren. </li><li> Verdünnen Drogen mit frisch gepufferte Lösungen zu den gewünschten unterschiedlichen Konzentrationen, die Berechnung von K d ermöglichen. </li><li> Filtern Sie die frisch zubereiteten Arzneimittel-Lösungen mit 0,2 um Filter und beschallen für 5 min bei Raumtemperatur vor dem Spülen mit Argon. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang mit Drogen in gepuffert Serum mit ganzen Serum. Vortexen für 15 min mit zusätzlichen 5 min, um eine vollständige Löslichkeit zu gewährleisten. </li></ol> 4. Oberflächenspannung Erkennung <ol><li> Legen Sie eine funktionalisierte Cantilever Sensor-Chip in einem Flüssigkeitsstrom Zellkammer. </li><li> Richten des Laserpunkts auf das freie Ende eines jeden Sensors und bestätigen die Ausrichtung durch Erhitzen der Flüssigkeitskammer für 1 ° C. Alle acht Gold beschichteten Cantilever-Sensor-Arrays unterziehen sollten umfasssiven Abwärtsbiegen wegen der Bimetall-Effekt durch die Unterschiede in Wachstumsraten von Silizium und Gold verursacht. </li><li> Nach dem Erwärmen für ca. 10 min, erlauben die Ausleger für weitere 10 min abkühlen. </li><li> Berechnen Sie die Biege-Variation bei den maximalen Biege-Signale zwischen den einzelnen Cantilever-Sensoren und wenn die relative Standardabweichung der Biege-Signale ist ≤ 5%, dann akzeptieren die Ausrichtung als wünschenswert ansonsten wiederholen Sie den Vorgang. </li><li> Dann messen Sie die Resonanzfrequenzen aller acht Auslegern ihre Federkonstanten berechnen. Wenn die Änderung der Federkonstante zwischen jedem Ausleger Sensor innerhalb eines Chips ist ≤ 1%, dann nehmen die Chip mit einheitlichen mechanischen Eigenschaften bzw. ersetzen den Cantilever-Sensor-Chip. </li><li> Weiter, verwenden Sie einen fluidischen Systems (Modell Genie Plus) über eine Sechs-Wege-Ventil, um den Flüssigkeits-Austausch innerhalb der Durchflusszelle zu erreichen, während die Datenerfassung sollte durch die Verwendung eines automatisierten LabView so werdenftware. </li><li> Um die Daten zu überwachen Kragarmbiegung, verwenden Sie die folgenden Messprotokolle: i) injizieren entweder Pufferlösung oder Serum ohne Medikament zur Kontrollmessung dauernd für 5-30 min, um eine Basis zu schaffen; ii) injizieren Drogen Lösung für 30-60 min; iii) injizieren 10 mM HCl waschen für 10-60 min zu Arzneimittel-Komplex gebunden distanzieren; iv) schließlich injizieren einen weiteren Waschschritt mit Puffer-Lösung für 5-30 min ein anderes, um die Oberfläche Peptide zu regenerieren und die Grundlinie Signal wiederherzustellen. Achten Sie immer darauf, dass alle Signale unter konstanter Flüssigkeitsstrom von 30-180 ml / min und bei konstanter Temperatur von 25 ° C in einem temperierten Schrank erworben werden. </li><li> Die absolute Biegen Signale aller acht Ausleger sollten überwacht die serielle zeitmultiplexierter optischen Strahl-Verfahren mit einer einzigen Position Detektor werden. </li><li> Um die Biegung Signale von jedem Konzentration des Wirkstoffs zu analysieren, werden die resultierenden Differential Biegungen in einen Differential stres umgewandelts zwischen den oberen und unteren Seiten des Auslegers mit Stoney-Gleichung. </li></ol>

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt wird

Diese Ergebnisse zeigen, dass Cantilever-Array-Sensoren die Empfindlichkeit zu detektieren und zu quantifizieren Änderungen in Drogen-Ziel Bindungswechselwirkungen besonders in Vancomycin-Resistenz mit der Streichung eines einzelnen H-Bindung von der Droge Bindungstasche definiert. Wir zeigen eine nanomolar Nachweisempfindlichkeit Van in Übereinstimmung mit früheren Oberfläche Plasmon Resonance (SPR)-Studien 18,19, und zeigen, dass der Cantilever-Methode kann direkt nachzuweisen und zu quantifizieren Arzneimittelmoleküle im Blut in klinisch relevanten Konzentrationen als routinemäßig in der klinischen Praxis angewendet. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die unterschiedliche Oberflächenspannung durch ein Produkt Form der Gleichung (1), dh (i) eine chemische Begriff beschreibt die spezifische Droge-Zielbindungsstelle Ereignisse, und (ii) eine geometrische Begriff beschreibt die mechanische Verbindung zwischen chemisch umgesetzt werden können beschrieben werden Oberfläche Websites, was bedeutet, dass die lokalen chemischen Wechselwirkungen entkoppeln von der globalen Mechanikeral Wechselwirkungen des Auslegers. Während die chemische Bezeichnung von der klassischen Langmuir Adsorptionsisotherme gegeben ist, zeigt die geometrischen Begriff eine perkolativen Mechanismus der Drogen-Ziel induzierte Oberfläche Stress Veränderungen. Die kritische Schwelle pc ~ 10% (Abb. 5) notwendig war, um die differentielle Kragarmbiegung erkennen, zeigen, dass die Oberflächenspannung kollektiv transduziert, wenn eine relativ große Oberfläche Fraktion durch Antibiotikamoleküle belegt ist. Für p ≥ pc, die mechanische Verbindung zwischen chemisch umgewandelt Oberfläche Websites allmählich etabliert und die Kurzstrecken-abstoßenden Wechselwirkungen wie sterische Wechselwirkungen zwischen den Knoten des nanomechanischen Netzwerk ist in zunehmendem Maße nach unten Biegen der gesamte Ausleger. Es wird spekuliert, dass unsere nanomechanischen Versickerung Modell kann eine wichtige Rolle in der Glycopeptidantibiotikum Wirkungsweise in Echtzeit Bakterien spielen. Diese Ergebnisse unterstreichen die hohe Empfindlichkeit der Cantilever-Technologie für studying Antibiotika &quot;Wirkungsweise und stellen eine neue Recherche-Tool für das Studium Drogen, um das Verständnis der Vorgänge von Antibiotika auf der Nano-Skala zu verbessern, um zu informieren und ermöglichen Entdeckung starke Medikamente, um die Probleme von superbug Infektionen steuern. Um die Cantilever-System für reproduzierbare und empfindliche Messungen vorzubereiten, haben wir eine Reihe von Zielen in dem Protokoll angesprochen, vor allem für Probenbeladung in mikrofluidischen Zelle und Standard Operating Procedures, um quantitative nanomechanischen Erfassungen ermöglichen. Bedeutung der Cantilever-Technologie in Bezug auf bestehende Methoden Zusammenfassend weisen wir darauf hin, dass, während diese Technologie mehr als 25 Jahren vorgeschlagen wurde, hat es nicht den Weg in die Klinik gefunden, weil der Mangel an sorgfältige und wiederholte Messungen auf medizinisch relevante Ziele. Hier zeigen wir die Verfahren, die die Relevanz der Verwendung nanomechanischen Ausleger, um die Mechaniker untersuchen etablierenal Einfluss von Antibiotika auf der bakteriellen Zellwand Ziele und antibakterielle Widerstand zu detektieren. Herkömmliche Wirkstoff-Screening Methoden erfordern irgendeine Art von fluoreszierenden oder radioaktiven Markierung eines Reporter-Moleküls, um die Bindung eines Analyten an das Ziel, die oft in Verbindung mit einem kompetitiven Bindungstest oder enzymatische und Proteinassays 20 zu messen. Markierung von Biomolekülen ist nicht nur zeitaufwendig und teuer, aber das Etikett kann auch mit der molekulare Interaktion von Behinderung der Bindungsstelle stören, was zu falsch negativen. Darüber hinaus sind fluoreszierende Verbindungen oft hydrophobe, die Hintergrund-Bindung und Fehlalarmen führen kann. Aufgrund dieser Einschränkungen gibt es ein wachsendes Interesse an neuartigen kennzeichnungsfreien Techniken, die praktisch alle molekularen Komplex mit minimalem Assay-Entwicklung untersucht werden können. Die meisten etablierten Label-freie Oberfläche Technologien sind derzeit SPR und Quarzkristallmikrowaage (QCM). Im Gegensatz zu SPR diese Maßnahme the Dielektrizitätskonstante, ein Label - Freivorbauweise Technik erkennt die Oberflächenspannungen durch eine Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung, die direkt gemessen werden können nanomechanical Kräfte durch die spezifische Bindung von Liganden an Rezeptoren Oberfläche erzeugt wird. Die Einzigartigkeit dieser Sensoren ist, dass ihre Empfindlichkeit nicht auf der dielektrischen Eigenschaften von Masse Änderung aufgrund der Analyt-Bindung als in SPR und QCM sondern auf einem kleinsten induzierte Veränderung in-plane Oberfläche Stress verursacht verlassen, so dass die Technologie einzigartig geeignet, um zu studieren die nanomechanics der Wirkstoff-Moleküle in klinisch relevanten Konzentrationen Antibiotikum (3-27 uM) 17. Konsolen sind auch besonders gut für kleine Molekül (wie DNA-Fragmente und Drogen) Erkennung unter physiologischen Bedingungen einschließlich komplexer Umgebungen, die weitgehend die Grundlage der pharmazeutischen Industrie und wird daher als ergänzendes Instrument in der Wirkstoffforschung zu dienen geeignet sind. Cantilever-Technologie erfolgreich in die angewendetBereichen Genomik 3,5, Gassensoren 21, Proteomik 22 und Drogen 1. Außerdem Ausleger hergestellt werden unter Verwendung von kostengünstigen Silizium-Technologie und aufgrund ihrer Kompatibilität mit microfabrication Prozessen kann Ausleger für eine verbesserte Empfindlichkeit und Parallelisierung in großen Arrays von Sensoren für multiple drug Wirkstoff-Screening und ein höherer Durchsatz Informationen reichen Screeningtests miniaturisiert werden. Verbesserungen der Mess-und experimentelles Design ermöglicht eine Vielzahl von Interaktionen in Echtzeit, um vorab die Suche nach einer neuen Generation von Superdrugs um die Probleme der multiresistenten Infektionen bekämpfen analysiert werden. Kritische Schritte innerhalb des Protokolls Die Entwicklung von robusten Messprotokolle ist von zentraler Bedeutung für die Anwendungen dieser Technologie. Um eine ausreichende quantitative Wirkstoff-Target-Messungen zu erreichen und die niedrigste Konzentration von Antibiotika t bestimmenHut könnte in Puffer oder Blut nachgewiesen werden Serum, kritischen Schritte im Protokoll angesprochen wurden. Die erste Aufgabe besteht darin, Tuning und Optimierung Oberfläche Capture Chemie zu Cantilever Erkennung Spezifität und Sensitivität zu erhöhen. Unbestreitbar ist Oberflächenspannung Transduktion ein kollektives Phänomen, die einen relativ großen Teil der Oberfläche bedeckt, um die Konnektivität zwischen chemisch reaktiven Gebiete festzulegen. Wir zeigen, daß durch Variation der Dichte der Unterlage Peptide, eine kritische Schwelle ~ p ≥ 10%, bestimmt wird, wobei die Oberflächenspannung Skala in Abhängigkeit von Peptid Dichte und sonst Null (Fig. 5). Es ist wichtig, dass Experimente entwickelt, um die Gleichmäßigkeit der Spannung entlang der Ausleger zu untersuchen, um eine maximale Signal Auslenkungen für empfindliche Messungen zu gewährleisten. Darüber hinaus müssen effiziente Oberfläche Regeneration Protokolle vorhanden sein, wodurch mehrere Zyklus Messungen und die Kosten für jeden tes reduzierent. Bei der Gestaltung einer Aufnahmefläche mit Thiol hydrophoben Ende ist die Orientierung des Rezeptor-Moleküls und der Abstand zwischen ihnen wichtig, damit Selbstorganisation von dichten Packung durch Van-der-Waals-Wechselwirkungen zwischen den Molekülen um unspezifische Wechselwirkungen zu minimieren. Darüber hinaus sollte die Fängermoleküle enthalten ein Polyethylenglykol (PEG)-Linker, um ein Teil der Abtastmatrix um hydrophil zu sein, um das Einführen von Molekülen in der Analyt-Lösung zu verhindern, reagieren direkt mit dem unbeschichteten Goldoberfläche. Die PEG-Linker-Moleküle sind als Spacer wirken, um sterische reduzieren und ermöglichen die Lösung Analyten spezifisch mit den Oberflächen-Rezeptoren, um messbare Oberfläche Spannungsänderung induziert. Der Ausleger-Array-Sensor ist mit mindestens einem in situ Referenzmessung getestet werden und das Signal in Echtzeit dargestellt ist eine unterschiedliche Ablenkung, der durch Subtrahieren des absoluten Auslenkung des Cantilevers von dem Referenz sEnsing Ausleger. So ein Verweis Cantilever unbedingt Rechnung für unspezifische Wechselwirkungen wie Temperatur, Änderungen im Brechungsindex oder Wechselwirkungen auf der funktionalisierten Unterseite des Auslegers. Optimierung des Durchsatzes (~ 30-150 ml / min) ein entscheidender Schritt im Protokoll, da es den effizienten Austausch von Flüssigkeiten und eine ausreichende stationäre Lösung Massentransport von Materialien gewährleistet. Das Design einer Flüssigkeit Zelle muss ermöglichen optimale Lautstärke (5-80 ul) für schnelle Flussraten, um perfekte Flüssigkeit Austausch Stofftransportlimitierungen überwinden können. Die Strömungsgeschwindigkeit ist besonders kritisch, während der Durchführung kinetische Messungen 23. Großvolumige Flüssigkeitskammern erfordern unkontrollierbar hohen Strömungsgeschwindigkeiten zu großen Probenvolumen Anforderungen, die unnötig erhöht den Preis des Assays. Bisher haben wir Schwerkraft verwendet, um verschiedene Proben in der Messung Flüssigkeitskammer injizieren. Gravity-Flow hat den Vorteil, dass es does erfordern keine mechanischen Teile und daher nicht vorstellen zusätzliches Rauschen in das System. Allerdings ist seine erheblichen Nachteil, dass es nur funktioniert zuverlässig bei relativ hohen Flussraten (~ 200 ul / min). Offensichtlich würde eine niedrigere Fließgeschwindigkeit (≤ 1 ml / min) benötigen begrenzten Probenmengen pro Zeiteinheit, aber auf der anderen Seite macht es die Reaktionen viel langsamer und erfordert daher längere Kontaktzeiten. Darüber hinaus hat Schwerkraft eine große Varianz in ihre Fließgeschwindigkeit, wie es auf der Höhendifferenz zwischen dem Einlass und Auslass, die als Probelösungen während des Experiments verbraucht abnimmt abhängt. Um Schwerkraft-Flow-Probleme zu vermeiden, sollte eine Spritzenpumpe verwendet werden. Der Vorteil der Verwendung einer Spritzenpumpe ist, dass es einen konstanten Geschwindigkeit über einen langen Zeitraum ermöglicht die Versuche in einer kontrollierten Umgebung realisiert werden können. Einschränkungen des Protokolls Die größte Herausforderung bei der Erlangung einer reproduzierbaren eined spezifischen biologischen Detektion mit Cantilever-Sensoren besteht darin zu gewährleisten, dass die Eigenschaften des Rezeptors Schicht biochemisch &quot;aktiv&quot; und Uniform für jeden Test sind. Das Geheimnis experimentellen Erfolg in einer sorgfältigen Vorbehandlung des Sensorchips mit einem standardisierten Reinigung und Immobilisierung Protokoll mit chemischen Linker zur Ausrichtung der Rezeptormoleküle in ihre aktive Konformation. In unserem aktuellen Setup, funktionalisieren wir Cantilever-Arrays mit kleinen Glas-Kapillaren, die unterliegen einigen Nachteilen konnte und kann in manchen Fällen problematisch. Diese Glaskapillaren sind an beiden Enden offen ist und damit die Probe Lösungsmitteln leicht verdampfen. Zum Beispiel, wenn die Temperatur der Funktionalisierung Stufe nicht genau gesteuert werden, kann die Verdampfungsrate erheblich variieren zu verschiedenen Zeiten insbesondere bei Verwendung von flüchtigen Lösungsmitteln, wie Ethanol. Es besteht auch die Möglichkeit einer leichten Variation der Inkubationszeit von einem Ausleger einer anderen gIven, dass die Erfassung Flüssigkeiten nacheinander in die Kapillaren geladen werden müssen. Die andere limitierende Faktor Kapillare Funktionalisierung ist das Fehlen der Möglichkeit, sicherzustellen, dass Ausleger immer in die Kapillaren in genau der gleichen Weise eingefügt. Zusätzlich werden manchmal die Ausleger müssen sich geringfügig von der Kapillare gezogen wird, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, da die flüssigen Proben auf den Chip Körper fließen kann. Wir können diese Probleme durch den Einsatz von Inkjet-Spotter als Alternative Oberflächenbeschichtung Verfahren zur Beschichtung von Auslegern zu lösen. Während es die exakte Kontrolle der Probe Beschichtung mit der Möglichkeit der Skalierung für große Arrays erlauben würde, ist der Nachteil gemeinsam, dass die kleinen Tropfen, die auf den Auslegern abgeschieden werden kann innerhalb von Sekunden zu verdampfen und erfordert eine Umgebung mit kontrollierter Feuchtigkeit. Daher kann die Inkubationszeit nicht leicht angepasst werden, was möglicherweise für einige Anwendungen wünschenswert. Die subtile Zusammenspiel der Faktoren wie Probe volumen, Inkubationszeit und Verdunstung haben direkte Auswirkungen auf die Exposition der Ausleger zur Funktionalisierung Probe und muss darauf geachtet werden, um optimierte Oberflächenchemie für Cantilever-Assays zu gewährleisten werden, wie jede kleine Veränderung in der Rezeptor molekulare Dichte einen großen Einfluss auf den Ausleger haben wird Antwort. Experimental Design-Modifikationen (dh alternative Techniken oder Materialien) Um die große Herausforderung in den Erhalt reproduzierbarer Beschichtungsverfahren für die zukünftige Entwicklung des Auslegers Technologie zu überwinden, werden unterschiedliche Strategien erforderlich, das wäre Ausleger in mikrofluidischen Kanälen integriert zu verwenden. Die Idee ist, dass spezielle Cantilever-Chips sollten so gestaltet sein, dass jeder Ausleger in einen eigenen Kanal gebracht wird, damit in situ-Funktionalisierung Verfahren, bei denen die Kanäle einzeln angesprochen online. Diese experimentellen Design Modifikationen erlauben würde Beschichtungsprozess zu führened in einer kontrollierten und geschlossenen Umgebung, wo die Exposition gegenüber dem Lösungsmittel gerade durch die Inkubationszeit und Durchfluss für automatisierte Immobilisierung von Fänger-Moleküle auf Cantilever-Chips überwacht. Die gleichen Kanäle können dann für die tatsächliche Bindung Experimenten, bei denen alle Ausleger um den gleichen Analyten Lösung ausgesetzt sein könnten, verwendet werden. Neben dem Ausleger Funktionalisierung Verfahren würde die Cantilever Auslesemechanismus auch verbessert werden müssen. Die optische Strahlablenkung Verfahren ist sehr empfindlich, und es wurde erfolgreich in Atomic Force Microscopy (AFM)-Technologie für viele Jahre verwendet. Dennoch ist für die freistehende Cantilever Sensor-Anwendungen das optische Auslesen einige Nachteile hat, zum Beispiel ist es nicht erlaubt Messungen in undurchsichtige Flüssigkeiten wie Blut, kann die Ausrichtung eines Arrays von Lasern zeitaufwändig und mühsam und die aktuelle Konfiguration kann nicht unterscheiden zwischen Kippen und vertikale Ablenkungen. So ist die zukünftige Entwicklung der cantilever Technologie müssen Aspekte der allgemeinen Sensor-Design (zB Geometrien Cantilever) und dem Ausleger Auslesen für robuste Messprotokolle sowohl in den Feldern und Labor-Umgebungen zu betrachten. Manalis und Mitarbeiter 22 haben neuartige hohle Cantilever-Sensoren in dem die Ausleger über einen eingebetteten mikrofluidischen Kanal innerhalb des Strahls entwickelt, wodurch das Gerät in einem Vakuum mit hochwertigen Faktoren betrieben werden. In diesem Modus wirken Ausleger als Mikrowaage 22, und daher ist es nicht mehr notwendig, dass eine Asymmetrie zwischen den beiden Seiten in Bezug auf die Funktionalisierung, damit die Fängermoleküle Physisorption oder kovalent direkt an das Silizium gebunden sind, in der Regel mit SAMs oder Silane 24. Die Ausleger kann auch mit einer dünnen Polymerschicht, die dann mit Antikörpern konjugiert 25 zur Erfassung biochemischer modifiziert werden. Fehlerbehebung Eine gemeinsame Problem mit dem Cantilever-Messungen verbunden ist, die Einführung der Luftblasen in den mikrofluidischen Durchflusszelle. Es ist darauf zu achten, dass keine Luftblasen in die Flüssigkeit Zelle eingebracht werden, während der Montage des Chips werden. Signal Driften ist auch ein weiteres häufiges Problem durch die Unterschiede in der Temperatur der Proben verursacht. Die Ausleger müssen ins Gleichgewicht zu stabilisieren, bevor die Messungen vorgenommen werden. Alle Puffer, Analyten und Regeneration Lösungen müssen im selben Raum gelagert werden, da der Ausleger Instrument, um all die Lösungen, um die gleiche Temperatur haben. Obwohl die Spritzenpumpe sehr genau und extrem niedrigen Fließgeschwindigkeiten bereitstellen kann, ist es in der Regel mit mechanischen Geräusche in dem freitragenden Messungen verbunden. Es ist daher wichtig, eine einfache und effektive Rauschverminderung zu entwickeln, um unnötiges Rauschen in der Ablenksignale zu vermeiden. Lärmreduziereinrichtung besteht aus kleinen Flüssigkeitsreservoir zwischen der Spritzenpumpe und der Flüssigkristallzelle, die t absorbiert befindeter mechanische Geräusche von der Pumpe. Aufgrund der sensiblen Natur der optischen Detektor, sollte der Ausleger Messsystem idealerweise in einer geschlossenen Einrichtung, alle streunenden Lichter stören die optische Auslesen System blockieren betrieben werden. Außerdem kann die Qualität der Sensorschicht deutlich verringert, wenn eine große Anzahl von Waschschritten an den Auslegern Begrenzung der Lebensdauer der Sensor-Chip durchgeführt werden. Alternative oder zukünftige Anwendungen nach Beherrschung dieser Technik Ausleger mit SAMs Einstellung in eine Amino-oder Carboxyl-Gruppe beschichtet sind, wie pH-Sensoren verwendet werden. Die funktionellen Endgruppen protoniert oder deprotoniert je nach pH-Wert der Lösung und eine Oberflächenladung, die den Ausleger 24 zu biegen führt zu erzeugen. Da die Cantilever-Sensoren können Arzneimittel-Target-Wechselwirkungen mit der Destabilisierung der Zellwand von Bakterien 1,6,7 Leben verbunden worden sind, werden sie daher helfendas Suchen und für die Entwicklung einer neuen Generation von Antibiotika resistenten Infektionen zu bekämpfen. In Zukunft würde Cantilever verwendet als Mikrowaagen die Masse und Wachstumsraten von Einzelzellen 26 messen werden. Der Ausleger-Technik als nützlich erweisen, um die Untersuchung der zellulären Reaktionen auf verschiedene Wachstumsfaktoren oder Drogen. Es bietet auch eine neuartige Tool für die schnelle Erkennung von mehreren Biomarkern, die unmittelbare Relevanz in der medizinischen und Point-of-Care-Anwendungen hat. Angesichts der Vielseitigkeit, geringe Größe und Robustheit der Cantilever-Sensoren, bilden sie einen empfindlichen Monitor von schädlichen Umwelteinflüssen. Sie haben bereits ihre Empfindlichkeit bei der Erkennung giftigen und schädlichen Gasen, die aus dem Labor und industrielle Produktionsanlagen in die Umwelt, wie z. B. Flusssäure 27 oder Blausäure 28 entweichen kann demonstriert.

Die molekulare Erkennung Paradigma untermauert große Teile der Biologie und Medizin. In der Pharmakologie, zum Beispiel das Ziel ist, mit einem pathologischen Weg, indem sie auf eine zentrale Teilnehmer eines biochemischen Prozesses wie transglycoslyation oder Transpeptidierungsreaktion, die die Vernetzung der bakteriellen Zellwand katalysiert Peptide stören. Die Entwicklung von Arzneimitteln ist daher die Festlegung eines geeigneten Molekül, um eine bestimmte bakterielle Andockstelle gezielt um eine perfekte Passform zu induzieren reduziert. Ein klassisches Beispiel emuliert den Erfolg dieses Ansatzes ist, Vancomycin (Van), der die peptidoglycan Zellwand, ein konserviertes Strukturmerkmal eines Bakteriums zielt. In einer entstehenden Gram-positives Bakterium, besteht die Peptidoglycan Matrix von Peptiden zur Einstellung in der Sequenz Lysin-D-Alanin-D-Alanin, über einen C55-Linker Lipid 8-10 bezeichnet hier D-Ala angebunden. Diese freiliegenden Peptide auf der Peptidoglycanvorstufen sind wichtig, damit diemechanischen Schutz der Bakterienzellen vor rauen Kräfte und allem nicht in menschlichen Zellen vorkommt, was sie ideal Ziele für Antibiotika. Van spezifisch an den C-Terminus der bakteriellen Zellwand Peptide Bilden einer mittelstarke Van-Peptid Komplex wie in 1 gezeigt. Diese Wechselwirkung zwischen den belichteten und Van Peptide das Wirken der Transpeptidasen und Transglycosylasen, die die Vernetzung der Zellwände 1, wirksam unterbindet sie von Vernetzung und damit nanomechanically schwächt die Bakterienzelle, die zu ihrem Tod durch Bruch 1,6 katalysieren, 7. Die Entstehung von Vancomycin-resistenten Enterokokken (VRE) ist eine wachsende Problem im Gesundheitswesen 11 und weil die bakterielle Resistenz in Enterokokken entsteht durch die subtile Veränderung eines Amid-linkage einer Esterbindung 8, diese scheinbar einfache strukturelle Veränderungen an der Oberfläche des Bakteriums löscht eine einzelne Wasserstoff-Bindung von Van &#39;s Andockstelle mit anschließender Änderung der Bindungstasche. Wichtig ist dieses Verfahren ändert die Pentapeptid Terminal Alanin in Vancomycin empfindlich Enterococcus (VSE) an eine Lysin-D-Alanin-D-Laktat 10,12, hier bezeichnet D-Lac, was eine signifikante Reduktion der Van-D-Lac Bindungsaffinität drei Größenordnungen Rendering Van therapeutisch unwirksam gegen Enterokokkeninfektionen 1. Die alarmierende Zunahme von Antibiotika-resistenten Bakterien ist daher treibt die Entwicklung innovativer Ansätze zur Beschleunigung und zur Wiederherstellung der antibakteriellen Aktivität von Antibiotika oder die Entdeckung von mehr starke Medikamente gegen multiresistente Bakterien Infektionen. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Unsere Experimente mit frei stehenden Ausleger wird durch die Systeme wie Zellen, die chemische Energie in Bewegung nutzen inspiriert. Die Fähigkeit der Cantilever-Sensoren in chemische Energie in mechanische Bewegung zu übersetzen einzigartig macht Sonden erhebliche Vorteile für die Überwachung der mechanischen Störungen des bakteriellen Zellwand Ziele in Echtzeit. Die Cantilever-Sensoren benötigen keine Reporter &quot;Tags&quot; und Biomolekülen sind schnell in einer einstufigen Reaktion nachgewiesen. Sie können mehrere Medikamente parallel screenen unter physiologischen Umgebungen wie gepufferte Lösungen und ganze Serum. Darüber hinaus nutzt der Cantilever-Technologie in situ Referenzierung für differenzielle Messungen so dass sie spezifisch nachzuweisen Drogen-Target-Wechselwirkungen und die aufgrund ihrer Herstellung über Standard-Halbleiter-Verarbeitung Routen, sie zugänglich für die Massenproduktion und Parallelisierung für High-Throughput-Screening von Tausenden sind von Medikamenten pro Stunde. In insbesondere mehrere Ausleger Sensoranordnungen sind nützliche Werkzeuge zur Untersuchung Antibiotikaresistenz gegenüber Vancomycin - weil der Widerstand gegen Vancomycin ist im Wesentlichen ein mechanisches Problem 1,6,7. Die Reaktionen zwischen einem Modell bakteriellen Zellwand Ziel und Van in Lösung kann durch Beobachten der Änderungen in klinisch relevante Belastung durch Arzneimittel-Target-Bindungs-Wechselwirkungen hervorgerufen detektiert werden. Die erzeugte Spannung von Oberflächenreaktionen, die sich in einer freitragenden Biegen Signal wird optisch durch Bestrahlen Sensoren mit einem Laserstrahl analysiert. Außerdem durch Anpassung der aufnehmende Beschichtung von bakteriellen Oberfläche Zielmoleküle auf der Oberseite des Auslegers Sensor zu einer un-begrenzte Anzahl von Analyten (Van), die spezifische biochemische Wechselwirkungen zu schließen und die Biomechanik des Modells bakteriellen Zellwand-Matrix wird in Echtzeit überwacht. Abgesehen von der molekularen Erkennung Veranstaltung gibt es mehrere Faktoren, die Cantilever-Sensoren zu def kannlect, die zählen - Temperaturschwankungen, unspezifische Bindung oder Änderungen des Brechungsindex der Lösung. Um unspezifische Signale ausmachen, in situ differentielle Messungen durchgeführt werden, wo die Biegung sowohl der Mess-und Referenz-Ausleger kontinuierlich überwacht werden, um spezifische Wechselwirkungen zu analysieren. Darüber hinaus können die Nachweisempfindlichkeit von Cantilever-Sensoren, die auf den Oberflächenchemie und Geometrie abhängen durch Abstimmen der Flächendichte p (wobei p das Verhältnis der Fläche belegt durch die Erfassung Moleküle an die gesamte obere Oberfläche des Auslegers definiert ist, erhöht werden unter der gesamten Population von Molekülen, wie durch Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie (XPS) 1 bestimmt. Hier Dieses Protokoll beschreibt, wie Vancomycin oder einem anderen Antibiotikum Bindung an bakterielle Zellwand Vorläufer Analoga (mucopeptides) in klinisch relevanten Konzentrationen in gepufferter Lösung einnd Blutserum kann mit Label-freie Cantilever-Technologie erkannt werden. Frisches Gold-Oberflächen verwendet werden, da selbstorganisierten Monoschichten (SAMs) auf einfache Weise bilden stabile Schichten auf saubere gold 13,14 neigen. SAMs besteht typischerweise aus kurzen Moleküle mit einem Thiol-Einheit kovalent an die Goldoberfläche befestigt, während die gewünschte Erfassungseinheit am anderen Ende sich frei mit dem Analyten Ziele in Lösung zu interagieren. Thiole ein flexibles System zumal viele Thiolverbindungen mit unterschiedlichen chemischen Endgruppen sind im Handel erhältlich oder können leicht in einem Labor synthetisiert. Allerdings sollte darauf geachtet werden, sicherzustellen, dass Moleküle mit einer Thiolgruppe müssen die richtigen Endgruppen aufweisen, beispielsweise in einem Protein oder Peptid, Konjugation, sollte die Aminogruppe nach innen zur Reaktion mit der Carboxylgruppe des Thiol-Anteils auf das Gesicht angebunden Oberfläche auftreten. Hier waren die Thiole direkt konjugiert mit Tripeptid Mimetika von bakteriellen Lipid II aus dem bacterial Zellwand Ziele durch Festphasenverfahren synthetisiert mit handelsüblichen vorgespannt Wang-D-Ala und Wang-D-Lac-Harze und die Standard-Fmoc-Schutzgruppe Chemie 15. Obwohl diese Beschreibung Vancomycin fokussiert ist, kann es zu deutlich anderen Antibiotika erweitert werden und in der Tat sind weitere Studien von Forschern aus verschiedenen Bereichen vor allem in der Biochemie, Pharmakologie und Materialwissenschaften zu leicht nehmen dieses Protokoll für ihre eigenen Experimente eingeladen.

<table><tbody><tr><td>Scentris</td><td></td><td>Scentris, Veeco Instruments, Inc</td><td>Nicht in Produktion</td></tr><tr><td>Sechswegeventil</td><td></td><td>MVP, Hamilton, Reno, NV</td><td>Ermöglicht die Mehrfachkonzentrationsinjektion</td></tr><tr><td>EB-Verdampfer</td><td></td><td>BOC Edwards Auto 500, UK</td><td>Elektronenstrahl ist vorzuziehen, da die Ausleger durch thermische Erwärmungsprobleme verformt</td></tr> werden <tr><td>Lagerbehälter</td><td></td><td>Agar Scientific, UK</td><td>Hält goldbeschichtete Folien frisch</td></tr><tr><td>Glaskapillare</td><td></td><td>King Precision Glass, Claremont, CA, USA</td><td>Für die Kapillarfunktionalisierung der Cantilever-Arrays</td></tr><tr><td>Pump</td><td></td><td>Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA</td><td>Gut für die kontrollierte Durchflussrate von flüssigen Proben in mikrofluidischen Kanälen</td></tr><tr><td>0,2-4,5 &mu; m Filter</td><td>1511940001</td><td>Merck Millipore</td><td>Für die Probenfilterung</td></tr><tr><td>Cantilever-Chips</td><td></td><td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td><td>Hochempfindliches</td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch</td><td>10049-21-5</td><td>Sigma-Aldrich, Großbritannien</td><td>Für die Herstellung von Pufferlösungen</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>7558-79-4</td><td>Sigma-Aldrich, Großbritannien</td><td>Für die Herstellung von Pufferlösungen</td></tr><tr><td>Polysorbat 80 (PS80) oder Tween 80</td><td>9005-65-6</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>Wird in Pufferlösungen verwendet, um unspezifische Wechselwirkungen auf Glaswaren</td></tr><tr><td>zu verhindern DI-Wasser</td><td></td><td>Millipore Co., Billerica, MA, USA</td><td>Wird zur Herstellung von Lösungen</td></tr><tr><td>verwendet Ganzes Serum</td><td>GEM-700-110-H</td><td>Sera Laboratories International Ltd, UK</td><td>Wird in Messungen verwendet, die physiologische Bedingungen nachahmen</td></tr><tr><td>Vancomycin (Van)</td><td>1404-93-9</td><td>Sigma-Aldrich, Großbritannien</td><td>Verwendete Arzneimittel</td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>7664-93-9</td><td>Sigma-Aldrich, Großbritannien</td><td>Wird für die Reinigung von Glaswaren</td></tr> verwendet <tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>7722-84-1</td><td>Sigma-Aldrich, Großbritannien</td><td>Wird für die Reinigung von Glaswaren</td></tr><tr><td>verwendet D-Ala und D-Lac</td><td></td><td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td><td>Oberflächenrezeptoren, die auf dem Cantilever-Sensor beschichtet sind, um Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln und Zielen zu erkennen</td></tr><tr><td>LabView</td><td></td><td>National Instruments Co., Austin, TX, USA</td><td>Software für die instrumentelle Schnittstelle zur Ermöglichung kontrollierter Messungen</td></tr></tbody></table>

nanomechanics von drug-target-interaktionen und antibakterielle widerstand erkennung

Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

Der Cantilever-Sensor, der als Wandler von Reaktionen zwischen Modell bakteriellen Zellwand Matrix auf seiner Oberfläche und Antibiotika in Lösung immobilisiert wirkt, hat beträchtliches Potential in biochemischen Sensor-Anwendungen mit bisher nicht erreichter Empfindlichkeit und Spezifität 1-5 gezeigt. Die Arzneimittel-Target-Wechselwirkungen erzeugen Oberflächenspannung, wodurch der Ausleger zu biegen, und das Signal kann optisch analysiert werden, wenn es von einem Laser beleuchtet wird. Die Veränderung der Oberflächenspannung mit nanoskaligen Genauigkeit gemessen erlaubt Störungen der Biomechanik des Modells bakteriellen Zellwand zielt in Echtzeit verfolgt werden. Trotz bietet erhebliche Vorteile, haben mehrere Cantilever-Sensor-Arrays nie bei der Quantifizierung Drogen-Ziel Bindungswechselwirkungen angewendet worden. Hier berichten wir über die Verwendung von Silizium Cantilever-Arrays mit mehreren Alkanthiol selbstorganisierten Monoschichten imitiert bakteriellen Zellwand Matrix quantitativ zu stu beschichtetdy Antibiotikum Bindungswechselwirkungen. Um die Auswirkungen von Vancomycin auf die Mechanik der bakteriellen Zellwand Strukturen 1,6,7 verstehen. Wir entwickelten ein neues Modell 1, dass Kragarmbiegung von zwei unabhängigen Faktoren beschrieben werden vorgeschlagen: i) nämlich eine chemische Faktor, der durch eine klassische Langmuir-Isotherme gegeben wird, aus dem es berechnet die thermodynamische Dissoziationskonstante (K d) und ii) ein geometrischer Faktor ist, im wesentlichen ein Maß für die bakterielle Peptid-Rezeptoren sind auf dem Ausleger verteilt. Die Flächenverteilung von Peptid-Rezeptoren (p) verwendet wird, um die Abhängigkeit der Geometrie und der Ligand Belastung zu untersuchen. Es wird gezeigt, dass ein Schwellenwert von p ~ 10% entscheidend für Sensor-Anwendungen ist. Unterhalb dessen keine nachweisbare Biegesignal oberhalb dieser Wert steigt die Biegesignal nahezu linear und zeigt, dass Stress ist ein Produkt eines lokalen chemischen Bindung factor und ein geometrischer Faktor kombiniert die durch die mechanische Verbindung des reagierten Regionen und bietet ein neues Paradigma für die Gestaltung von mächtigen Agenten superbug Infektionen zu bekämpfen.

Der Stress Änderung unter Verwendung nanoskaliger Präzision mit beispielloser Empfindlichkeit gegenüber einer einzelnen H-Bindung Löschung, wird ausgenutzt, um die Störungen des Modells bakteriellen Zellwand Biomechanik in Echtzeit (2a-d) zu verfolgen. Die Grenze der Droge Nachweisempfindlichkeit für Van wurde durch serielles Verdünnen seine Konzentrationen in Schritten von 1000 um bis ≤ 10 nM, 10 nM enthüllt (~ 15 ng / ml) als die niedrigste nachweisbare Konzentration, die zu einem Durchschnitt von ~ -9 ± untersucht 2 nm wie die Differential-Biege-Signale (Abbildung 2c). Die Fähigkeit, Antibiotika unter physiologischen Umgebung zu erkennen wurde im Serum bei einer klinisch relevanten Konzentrationsbereich von 3-27 uM 17 untersucht. Beim Einspritzen von 7 um Van im Serum (90% fötalem Kälberserum + 10% Natriumphosphatpuffer, pH 7,4) in allen Ausleger unter identischen Bedingungen das Differenzsignal fürDAla in Serum 105 ± 4 nm, während für DLAC beschichteter Cantilever, kein Bücken beobachtet wurde (Abbildung 3). Die erheblichen Biege Signale für DAla beschichtet (Vancomycin anfällig) Ausleger beobachtet werden durch den starken Medikamenten-Target bindenden Wechselwirkungen verursacht. Doch für DLAC beschichtet (Vancomycin resistent) Ausleger, die Anwesenheit von Grundzustand Abstoßung der freien Sauerstoff-Paar und der reduzierten NH-Bindung in der Vancomycin-Bindungstasche 10,12 trägt zur Schwächung der Wirkstoff-Target bindenden Wechselwirkungen, die in weniger Ergebnisliste oder keine Kragarmbiegung, insbesondere für untere Vancomycin-Konzentrationen (Abbildung 3). Doch für hohe Vancomycin-Konzentration, beobachten wir messbare Signale für Biege DLAC. Darüber hinaus ist unser experimentelles Design wichtig für in situ Referenzierung wo alle ca.ntilevers sowohl DAla und DLAC beschichtet werden gleichzeitig an den gleichen Analyten in Echtzeit ausgesetzt. Um die genaue Rolle der Chemie und Geometrie verstehen, haben wir ein Modell 1 beschreibt die Korrelation zwischen Lösungsmittel Wechselwirkungen und Oberfläche Mechanik. Daraus ergibt sich die Oberflächenspannung: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/50719/50719eq1.jpg" /> für p&gt; pc und sonst Null (1) Der erste Term in Gleichung (1) ist die Langmuir Adsorptionsisotherme, Buchhaltung für Drogen-Zielbindungsstelle Ereignisse und der zweite Term ist die Kraft Gesetz Form beschreibt die große mechanische Folgen von gestressten Netzwerk-Bildung. Die Konstante a entspricht maximale Oberflächentemperatur Stress, wenn alle zugänglichen Bindungsstellen besetzt sind und K d ist die Oberfläche Gleichgewichtsdissoziationskonstante NachteileTant auf dem Ausleger. Die Analyse, wie in Abbildung 4 dargestellt ist das Ergebnis der globalen Anpassung von Gleichung (1) auf gemessenen Differenzdruck Stress-Signale überlagert enthüllen; a ~ 29,7 ± 1,0 bzw. 14,1 ± 3,0 mN / m und K d ~ 1,0 ± 0,3 oder 800 ± 310 uM für D-Ala oder DLAC Peptide, in denen A einem Maß der Oberflächenspannung, wenn alle zugänglichen Bindungsstellen besetzt sind. Die erhöhte Empfindlichkeit des Auslegers durch systematisches Variieren der Dichte p Peptid während der Überwachung der Spannung als eine Funktion von p während Antibiotikakonzentrationen 10, 100 befestigt ist, und 250 uM (5) abgestimmt ist. Das Verfahren wurde mit Spannung als Funktion von Van Konzentrationen wiederholt, wobei die Peptid-Dichten bei p ~ 100% festgelegt. &lt;img alt = &quot;Abbildung 1&quot; fo: content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg&quot; /&gt; Abbildung 1. Cantilever Nachweis von Antibiotika-Oberfläche Bindungswechselwirkungen. a) Schematische Darstellung eines Auslegers Sensoranordnung und der Modus durch die das Arzneimittel-Target-Wechselwirkungen nanomechanically erkannt werden. b) Die chemische Bindung Wechselwirkung zwischen einem Medikament Molekül (Van) und des bakteriellen Mucopeptid Analog-(D-Ala oder D-Lac). c) Der Mechanismus, mit dem ein mutiertes Vancomycin empfindlichen Bakterien (VSE) erwirbt Resistenz gegen Vancomycin durch das Löschen eines einzelnen H-Bindung in der Bindungstasche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig1large.jpg" target="_blank">Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig2.jpg" /&gt; Abbildung 2. Tracking der Störungen der Modell bakteriellen Zellwand Biomechanik in Echtzeit. a) Absolute Biege-Signale von D-Ala, D-Lac und PEG beschichteter Cantilever in Phosphat-Puffer und 250 pM Vancomycin. Die differentiellen PEG Referenzsignale in schwarze Linien dargestellt. B) differentielle Biegereaktion Signale von D-Ala und D-Lac beschichteter Cantilever in Phosphatpuffer und 250 um Vancomycin. C) Die Differenz Cantileverauslenkung von einer Dosis-abhängigen Signals als eine Funktion der Zeit in Gegenwart von Vancomycin-Konzentrationen in der Größenordnung von 10 nm (gelbe Linie), 100 nM (rot) und 1000 nm (dunkelrot Linie) sind. d) Die Differenz Cantileverauslenkung Signale für drei D-Ala beschichtet Cantilever-Sensoren als Funktion der Zeit in Gegenwart von 10nM Vancomycin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig2large.jpg" target="_blank">Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig3.jpg" /> Abbildung 3. Verfolgung der Störungen des Modells bakteriellen Zellwand Biomechanik in Echtzeit für einen D-Ala und D-Lac beschichteter Cantilever in Gegenwart von 7 um Vancomycin in Kälberfötusserum. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig4.jpg" /> Abbildung 4. Untersuchung der nanomechanics von Medikamenten-Target-Wechselwirkungen. Plot zeigt den gemessenen Differenzdruck Oberfläche Stress-Reaktion für D-Ala (schwarze Kreise) und D-Lac (rote Kreise) beschichteter Cantilever als Funktion von VancomycinKonzentration in der Lösung [Van]. Die Daten werden durch die Gleichung (1) (durchgezogene Linien) beschrieben. 1 <img alt="Abbildung 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig5.jpg" /> Abbildung 5. Optimierung nanomechanischer Nachweisempfindlichkeit von Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen, die durch die Untersuchung der Abhängigkeit der Rezeptor Belastung und Geometrie über gemischten Monoschichten. Gemessenen Differenzdruck Oberflächenspannung Antworten Cantilever-Sensoren in Abhängigkeit von D-Ala Flächendeckung, p in Gegenwart von festen Vancomycin Konzentrationen in Lösung bei 10 uM (schwarze Linie), 100 pM (rote Linie) und 250 pM (grüne Linie).

Erworbene Resistenz gegen Antibiotika ist ein großes öffentliches Gesundheitsproblem und wird derzeit von der WHO als eine der größten Bedrohungen des menschlichen Lebens rangiert. Hier beschreiben wir die Verwendung von Cantilever-Technologie antibakterielle Widerstand, kritisch für die Entwicklung neuartiger leistungsfähige Mittel gegen Multidrug-resistente Bakterien zu quantifizieren.

Nanomechanics von Drug-Target-Interaktionen und Antibakterielle Widerstand Erkennung

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Änderungen der mechanischen Eigenschaften von darunterliegenden modellhaften bakteriellen Zellzielen infolge von Bindungsinteraktionen mit Wirkstoffen zu messen und die antibakterielle Resistenz zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst 20 Nanometer dünner Goldfilm auf eine Seite des vorher gereinigten Konsolen-Sensorarrays aufgebracht werden. Im zweiten Schritt werden geeignete Oberflächenziele auf sechs der Konsolensensoren selbstorganisiert, wobei sie phänotypische Merkmale von medikamentensensiblen und medikamentenresistenten Bakterien nachahmen. Die verbleibenden beiden Konsolensensoren werden mit irrelevanten modellhaften bakteriellen Targets bestückt, um als Messkontrollen zu dienen.Anschließend werden die Cantilever-Sensorarrays in eine Flüssigkeitsströmungskammer geladen. Der letzte Schritt besteht darin, Arzneimittellösungen in klinisch relevanten Konzentrationsbereichen herzustellen und jede Arzneimittelkonzentration nacheinander über die Cantilever-Sensorarrays zu injizieren. Schließlich wird fokussiertes Laserlicht auf die freien Enden der Cantilever-Sensorarrays gelenkt, um Cantilever-Auslenkungen anzuzeigen, die durch Änderungen der Oberflächenspannung infolge von Bindungswechselwirkungen zwischen dem Wirkstoff und seinem Ziel entstehen.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie Oberflächenplasmonenresonanz und Quarz-Kristall-Mikrowaage liegt darin, dass sie die durch Bindungswechselwirkungen von Wirkstoffen an Zielstrukturen erzeugte Oberflächenspannung erfasst, indem spezifische anomechanische Kräfte gemessen werden, die durch die Bindung jedes Wirkstoffs an die Oberflächenziele entstehen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Pharmakologie zu beantworten, beispielsweise bezüglich der Geschwindigkeit, Effizienz und Genauigkeit der Dosierung. In der Regel haben Personen, die neu in diesem Bereich sind, Schwierigkeiten aufgrund der zeitraubenden Probenjustierung.Doch kürzlich haben wir einen neuartigen Auslesemechanismus entwickelt, der keine anfängliche Probenausrichtung erfordert, und in Zukunft wird die Anwendung dieser Methode viel einfacher und benutzerfreundlicher sein. Beginnen Sie damit, mit einem Paar Teflon-Pinzetten einen Cantilever-Chip 20 Minuten lang in eine frisch zubereitete Parama-Lösung einzutauchen. Die in diesem Experiment verwendeten Cantilever sind 500 Mikrometer lang, 100 Mikrometer breit und 0,9 Mikrometer dick.Nach 20 Minuten entfernen Sie den Cantilever und spülen ihn gründlich mit entionisiertem Wasser ab. Untersuchen Sie den gereinigten Chip mit einem optischen Mikroskop auf Verunreinigungen. Legen Sie Chips mit verbliebenem Staub oder Schmutz erneut in frische Piranha-Lösung für zusätzliche 20 Minuten.Nach einer gründlichen Reinigung in entionisiertem Wasser den Chip in reinem Ethanol spülen und anschließend auf einer Heizplatte bei 75 Grad Celsius etwa 30 Sekunden lang trocknen, um Wasserreste vollständig zu entfernen. Danach erneut mit einem optischen Mikroskop überprüfen, um die Sauberkeit zu bestätigen. Den gereinigten Cantilever-Chip in eine Verdampfungskammer überführen, die mit Titan- und Goldquellen beladen ist.Pumpen Sie so lange, bis ein Vakuumdruck von 1 × 10⁻⁷ mbar erreicht ist. Sobald das erforderliche Vakuum erreicht ist, beschichten Sie eine Seite jedes Cantilever-Arrays mit einer zwei Nanometer dicken Schicht aus Titan. Richten Sie dann das System so ein, dass eine 20 Nanometer dicke Goldschicht auf dem Titan abgeschieden wird, der als Haftvermittlerschicht dient.Überprüfen Sie die Dicke jeder Schicht mit einem Quarz-Kristall-Monitor, der direkt über der Targetquelle positioniert ist. Sobald die korrekte Dicke erreicht ist, lassen Sie die mit Gold beschichteten Cantilever-Chips zur Abkühlung unter Vakuum für eine bis zwei Stunden in der Kammer, bevor Sie diese öffnen. Danach überführen Sie den Cantilever-Sensorchip in ein Vakuumlagergefäß, das mit Argon gefüllt ist, um jegliche Kontamination zu verhindern.Die Cantilever-Chips können hier unbegrenzt gelagert werden. Falls jedoch kein Lagervorrat zur Verfügung steht, muss der Chip unmittelbar vor dem Experiment verwendet werden. Ordnen Sie Mikrokappillarrohre entsprechend der Cantilever-Teilung von 250 Mikrometern in Kanäle auf einer Funktionalisierungsstufe an.Danach mit einem Glasobjektträger ausrichten und mit einer Klemme fixieren, um eine Bewegung während des Experiments zu verhindern. Anschließend stellen Sie zwei Millimolar-Lösungen von folierten Oberflächenrezeptoren her, die aus zellwandgebundenen Zielstrukturen von antibiotikasensiblen und antibiotikaresistenten Bakterien bestehen, unter Verwendung von reinem Ethanol. Danach platzieren Sie jeweils einen separaten Cantilever in jede der Mikrokapillarrohre.Stellen Sie sicher, dass die Lösungen der Oberflächen-Captiv-Moleküle auf jeden einzelnen Cantilever-Sensor beschränkt bleiben, um eine Kontamination zu vermeiden. Weisen Sie dann eine Mischung dieser Oberflächen-Captiv-Moleküle zufällig den Mikrokappillarrohren zu und geben Sie anschließend acht Mikroliter der zugeordneten Lösungen der Oberflächenziele in die jeweiligen Röhrchen. Lassen Sie die Cantilever 20 Minuten lang in den Lösungen inkubieren.Während dieser Zeit werden die frisch hergestellten, goldbeschichteten Cantilever durch die Selbstorganisation bakterieller Mukopeptid-Ziele in einer Monoschicht auf ihren goldbeschichteten Oberflächen zu chemisch aktiven Sensoren. Lösen Sie zunächst 0,1 molare mono- und dibasische Natriumphosphatsalze in ultrareinem Wasser und mischen Sie die Lösung, um einen pH-Wert von 7,4 einzustellen; filtrieren Sie die Lösung anschließend mit 0,2-Mikron-Filtern. Geben Sie dann 0,002 % Polysorbat 80 zur gepufferten Lösung hinzu.Dies minimiert Aggregations-Effekte, die durch unspezifische Wechselwirkungen von Wirkstoffmolekülen mit dem Glasgerät verursacht werden. Verdünnen Sie anschließend Vancomycin und Orin mit frisch gepufferten Lösungen auf die gewünschte Konzentration von 100 Pikomolar bis 250 Mikromolar, um die Berechnung der KD zu ermöglichen. Vortexen und sonifizieren Sie die Proben, um eine vollständige Auflösung des Wirkstoffs im Puffer und Serum sicherzustellen, und bestimmen Sie, ob die Wirkstoffwirkung durch Serumproteine modifiziert wird. Wiederholen Sie dieses Verfahren mit denselben Wirkstoffkonzentrationen, fügen Sie diesmal jedoch volles Serum hinzu.Versetzen Sie die Serumproben außerdem während des Mischens insgesamt 20 Minuten lang im Vortex, um eine vollständige Löslichkeit der Wirkstoffe sicherzustellen. Spülen Sie die Lösungen abschließend mit Argon, um die Detektion von Oberflächenspannungen an den Cantilevern zu beginnen. Laden Sie zuerst die acht funktionalisierten Cantilever-Sensoren auf dem Chip in eine Flüssigkeitsdurchflusszelle. Als Nächstes richten Sie den Laserpunkt auf das freie Ende jedes Sensors aus. Bestätigen Sie die Ausrichtung, indem Sie die Flüssigkammer um ein Grad Celsius erwärmen. Alle acht goldbeschichteten Cantilever-Sensorarrays werden aufgrund des bimetallischen Effekts, der durch die unterschiedlichen Ausdehnungsraten von Silizium und Gold verursacht wird, eine kompressive Abwärtsbiegung erfahren.Nach etwa 10 Minuten Erhitzen berechnen Sie die Biegevariation bei den maximalen Biegesignalen zwischen einzelnen Cantilever-Sensoren. Wenn die relative Standardabweichung der Signale kleiner oder gleich 5 % ist, akzeptieren Sie die Ausrichtung als erwünscht. Andernfalls wiederholen Sie den Prozess nach erneuter Ausrichtung.Lassen Sie die Cantilever 10 Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen, um eine Gleichgewichtseinstellung zu gewährleisten. Messen Sie anschließend die Resonanzfrequenzen aller acht Cantilever und berechnen Sie ihre Federkonstanten. Wenn die Abweichung der Federkonstante zwischen den einzelnen Cantilever-Sensoren kleiner oder gleich 1 % beträgt, akzeptieren Sie die Kalibrierung.Alternativ ersetzen Sie das verbindliche fluiddynamische System des Cantilever-Chipsensors, wie hier die Spritzenpumpe über ein Sechs-Wege-Ventil mit dem empfangenden Chip. Stellen Sie die Durchflussrate des Systems auf eine konstante Geschwindigkeit zwischen 30 und 180 Mikrolitern pro Minute ein und richten Sie das gesamte System in einem temperaturgeregelten Schrank bei 25 Grad Celsius ein. Beginnen Sie anschließend mit der Injektion von entweder Puffer oder Serum allein, ohne Wirkstoff, um eine Kontroll-Basislinienmessung über eine Dauer von fünf bis 30 Minuten aufzuzeichnen.Starten Sie die Software für die automatisierte Laboransicht, um die Auslenkungsdaten von jedem der Konsolen gleichzeitig zu erfassen. Überwachen Sie die absoluten Biegesignale aller acht Konsolen mithilfe einer seriellen zeitmultiplexierten optischen Strahlmethode mit einem einzigen positionsempfindlichen Detektor. Sobald die Basislinie erfasst wurde, injizieren Sie eine Wirkstofflösung für 30 bis 60 Minuten nach der Testprobe.10 Millimolar HCL-Waschung wird 10 Minuten bis eine Stunde lang injiziert, um eventuell gebundene Arzneimittelkomplexe zu dissoziieren. Mit diesem System ist hier eine nanoskalige Präzision und beispiellose Empfindlichkeit gegenüber dem Fehlen einer einzelnen Wasserstoffbrücke möglich. Die Veränderung am Ende einer Peptidkette von D-Alanin zu D-Lactat führt zu einer signifikanten Verringerung der Vancomycin-Bindung, wodurch Bakterien mit der DLAC-Sequenz gegenüber dieser Therapie resistent werden. Bei Untersuchungen mit variierenden Konzentrationen des Wirkstoffs an der mit D-Alanin endenden Peptidkette zeigte Vancomycin eine dosisabhängige Wirkung, wobei etwa 10 Nanomolar die niedrigste nachweisbare Konzentration war.Die Fähigkeit dieses Systems, Antibiotika in einer physiologischen Umgebung nachzuweisen, wurde weitergehend im Serum bei einer klinisch relevanten Konzentration von sieben µM untersucht. Während die mit D-Alanin beschichteten Cantilever unter diesen Bedingungen weiterhin eine beträchtliche Biegung zeigten, wiesen die mit DLAC beschichteten keine auf. Mithilfe von Datenpunkten aus mehreren Arzneimittelkonzentrationen lassen sich Modelle erstellen, die die Bindungsereignisse zwischen Arzneimittel und Zielstruktur beschreiben.Die hier gezeigten Anpassungslinien kombinieren die Langurenabsorption, die Isotherme und einen Term zur Beschreibung der mechanischen Auswirkungen auf großer Skala, die durch die Bildung belasteter Netzwerke entstehen. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in wenigen Minuten durchgeführt werden, um die Effizienz und Genauigkeit der Arzneidosierung sowie Anzeichen bakterieller Resistenz zu überprüfen, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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