Gesamtproteinextraktion und 2-D Gelelektrophorese-Methoden für Burkholderia Arten

Mitglieder der Gattung Burkholderia sind Erreger von klinischer Bedeutung. Wir beschreiben ein Verfahren zur bakteriellen Gesamtproteinextraktion unter Verwendung mechanischer Aufbruch-und 2-D-Gelelektrophorese für nachfolgende Proteomanalyse.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine zweidimensionale Karte eines bakteriellen Proteoms zu erstellen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Bakterienkultur gezüchtet und die Proteine geerntet werden. Anschließend werden die geernteten Proteine in einer einzigen Dimension nach ihrem pH-Wert getrennt.

Durch die isoelektrische Fokussierung nach der Trennung in der ersten Dimension werden die Proteine in der zweiten Dimension weiter nach ihrem Molekulargewicht getrennt. Schließlich wird das Gel der zweiten Dimension gefärbt und die Proteine werden visualisiert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die durch zweidimensionale Elektrophorese Unterschiede in der Proteinexpression zeigen.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der bakteriellen Pathogenese zu beantworten, z. B. welche Proteine unter bestimmten Bedingungen produziert werden und wie sich verschiedene bakterielle Isolate in der Proteinproduktion unterscheiden. Diese Informationen können helfen, Kandidatenproteine zu identifizieren, die an der Virulenz beteiligt sein könnten. Nachdem Sie eine 100-Milliliter-Kaltmilchkultur in die stationäre Phase gebracht haben, geben Sie 35 Milliliter in ein Zentrifugenröhrchen und schleudern Sie sie 20 Minuten lang bei 4.500 g und vier Grad Celsius.

Reanimation, suspendieren Sie das Pellet in 35 Millilitern kaltem PBS und wiederholen Sie die Zentrifugation. Nachdem Sie das Pellet in einem Milliliter kaltem PBS suspendiert haben, geben Sie die Lösung in ein steriles Mikroröhrchen mit zwei Millilitern und schleudern Sie es erneut. Wiederholen Sie die Wäsche in einem Milliliter kaltem PBS, bevor Sie bei vier Grad Celsius und 14.000 g schleudern. Entsorgen Sie eine Minute lang den Überstand und fügen Sie einen Milliliter P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F-Lösung hinzu und geben Sie das gelöste Pellet in ein zwei Milliliter Schraubverschlussröhrchen mit etwa 0,5 Millilitern vorsterilisierten Glasperlen.

die Zellen aufzubrechen, verwenden Sie dann im Kühlraum dreimal für jeweils eine Minute einen Mini-Perlenbeader, indem Sie die Probe nach jeder Rundzentrifuge eine Minute lang auf Eis legen, bevor Sie den Überstand in ein steriles Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen überführen. Um die Ausbeute zu erhöhen, wiederholen Sie das Bead-Bashing zweimal mit einem zusätzlichen Aliquot von P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F. Ziehen Sie die Proben.

Lagern Sie dann nach der Untersuchung der Proteinmenge 200 Mikrogramm Aliquots bei minus 80 Grad Celsius, bis sie für die erste Dimension verwendet werden können. Bei der isoelektrischen Fokussierung oder IEF wird zunächst eine Streifenreinigungslösung verwendet, um die Streifenhalter zu reinigen. Spülen Sie die Streifen anschließend mit milli Q Wasser ab.

Lassen Sie sie dann nach dem Trocknen auf dem Kopf stehend trocknen und ordnen Sie jeder Probe eine Gelstreifenhalternummer zu. Laden Sie eine zuvor vorbereitete 200-Mikrogramm-Proteinprobe in die seitliche Vertiefung des Streifenhalters und verteilen Sie die Probe mit der Pipette mit einer sauberen Pinzette entlang des Halters. Ziehen Sie die Gelstreifen aus der Verpackung.

Entfernen Sie dann die Schutzschicht von den Gelstreifen, bevor Sie sie mit der rauen Seite nach unten in einer langsamen Gleitbewegung auskleiden, um die Streifen vom negativen Ende zum positiven Ende nass zu machen. Um ein Ausbrennen zu vermeiden, legen Sie mit sterilisiertem Wasser angefeuchtetes Löschpapier auf die Elektrode und unter die Gelstreifen. Entfernen Sie Luftblasen und überziehen Sie sie mit einer dünnen Schicht Mineralöl, um ein Austrocknen zu verhindern.

Richten Sie die Gelstreifenhalter an der IEF-Maschine aus. Führen Sie die Beispiele mit dem hier aufgeführten Programm aus. Die Gele können im letzten Schritt jederzeit entfernt werden.

Wenn das Programm abgeschlossen ist, entfernen Sie die Streifen von den Streifenhaltern und decken Sie sie, sofern sie nicht sofort verwendet werden, in Plastikfolie ab und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis sie bereit sind, die zweitdimensionale SDS-Seite durchzuführen. Nach dem Zusammenbau der Gel-Rollenvorrichtung für die SDS-Seite bereiten Sie die Gellösung in einem Kolben mit einer Vakuumspitze und einem Rührstab vor, indem Sie Dracaquel 1,5 molaren Tris-Puffer und MCU-Wasser hinzufügen, mischen und entgasen Sie die Lösung. bei mäßiger Geschwindigkeit mit dem Vakuum für 20 Minuten. Wenn das Vakuum beendet ist, fügen Sie der Gellösung 10 % SDS hinzu, indem Sie sie an der Seite des Kolbens entlang pipettieren. Um Blasenbildung zu vermeiden, fügen Sie dann frisch zubereitetes Ammonium pro Sulfat und Temid hinzu und rühren Sie um.

Gießen Sie das Gel hinein und lassen Sie es aushärten, dann lösen Sie DTT in der zuvor vorbereiteten Äquilibrierungslösung auf. Nehmen Sie die Streifen aus der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius, wickeln Sie sie aus und legen Sie die IPG-Streifen mit dem Gel nach unten in den Puffer und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang. Geben Sie anschließend 4,5 Liter Elektrophoresepuffer in den laufenden Tank.

Entfernen Sie dann mit einer Pinzette die Streifen aus der Äquilibrierungslösung und verwenden Sie ein Papiertuch, um den überschüssigen Puffer abtropfen zu lassen. Zerlegen Sie die Gelgießvorrichtung und waschen Sie die Glasplatten mit warmem Wasser. Nachdem du das Wasser auf der Oberseite des Gels durch einen Laufpuffer ersetzt hast, lege mit einer sauberen Pinzette einen Streifen auf die lange Platte, wobei die Gelseite zu dir zeigt.

Schmieren Sie den Streifen mit einem x Puffer und schieben Sie den IPG-Streifen mit einem Kunststoffstreifen weiter nach unten gegen das Gel, wobei Sie alle Luftblasen zwischen dem Streifen und dem Gel entfernen. Geben Sie Agarro-Dichtungslösung auf die Oberseite des Streifens, um ihn an Ort und Stelle zu versiegeln. Nachdem Sie den Vorgang für alle Streifen wiederholt haben, senken Sie ihn in den Geltank.

Nachdem Sie sichergestellt haben, dass sich die eine x Pufferebene in der äußeren Kammer auf der vorgesehenen Höhe befindet, befestigen Sie die obere Kammer. Den Rahmen für die obere Pufferkammer auf die Glasplatten setzen und nach unten drücken. Geben Sie die zwei x laufenden Puffer in die obere Kammer bis zur Mittellinie.

Fügen Sie dann den einen x laufenden Puffer in die äußere Kammer ein, bis er die obere Linie erreicht. Setzen Sie den Deckel darauf und schalten Sie die Elektrophoreseeinheit und das Netzteil ein. Lassen Sie die Samples über Nacht bei 52 Volt, 96 Milliampere und fünf Watt laufen.

Lassen Sie die Gele laufen, bis die Führungslinien einen Zentimeter vom Boden entfernt sind. Entfernen Sie nach der Laufzeit die Platten von der Rolle. Sobald die Gele von den Glasplatten entfernt sind, fixieren Sie sie mindestens eine Stunde lang oder über Nacht bei vier Grad Celsius in Lösung eins.

Übertragen Sie dann die Gele auf Fixlösung zwei und rocken Sie eine Stunde lang. Waschen Sie die Gele viermal für jeweils 15 Minuten in Milli Q Wasser. Verwenden Sie dann Silbernitratlösung, um die Gele 30 Minuten oder bis zu 48 Stunden lang zu färben.

Nachdem Sie die Gele eine Minute lang in Milli Q Wasser gewaschen haben, geben Sie sie in die Entwicklerlösung, bis das Gel fleckig ist. Etwa fünf bis 30 Minuten, um die Reaktion zu stoppen, übertragen Sie die Gele, um die Lösung für 10 Minuten zu stoppen. Hier ist ein Kumasi Blues Färbegel aus Ganzzellproteinextraktionen aus ol dia multivorans zu sehen.

Klinische Isolate, die entweder in LB- oder Hefe-Mannitol-Bouillon gezüchtet und in stationärer Phase geerntet werden. Eine vergleichende Analyse der Proteinprofile, die bei zwei verschiedenen Gelegenheiten aus denselben Bakterienkulturen extrahiert wurden, zeigte ähnliche Bandenmuster, was auf erfolgreiche Proteinextraktionen hinweist. In dieser Abbildung zeigt die 2D-Gelelektrophorese-Analyse von 200 Mikrogramm Gesamtprotein aus Bural dio, Pseudo, eine Häufigkeit von mehr als 500 Flecken, die einzeln durch Massenspektrometrie identifiziert werden können.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Zytometrie durchgeführt werden, um quantitative und quantitative Unterschiede zwischen eng verwandten Bakterienisolaten zu bestimmen. Darüber hinaus können Forscher mit einer Modifikation der Färbemethode die Identität von Proteinflecken durch Spot-Exzision und Massenspektrometrie bestimmen.