Gesamtproteinextraktion und 2-D Gelelektrophorese-Methoden für

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine zweidimensionale Karte eines bakteriellen Proteoms zu erstellen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine bakterielle Kultur angezüchtet und die Proteine gewonnen werden. Anschließend werden die gewonnenen Proteine in einer einzigen Dimension entsprechend ihrem pH-Wert getrennt.

Bei der isoelektrischen Fokussierung nach der Trennung in der ersten Dimension werden die Proteine in der zweiten Dimension entsprechend ihrem Molekulargewicht weiter getrennt. Schließlich wird das Gel der zweiten Dimension gefärbt und die Proteine sichtbar gemacht. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die Unterschiede in der Proteinexpression mittels zweidimensionaler Elektrophorese zeigen.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der bakteriellen Pathogenese beantworten, beispielsweise welche Proteine unter bestimmten Bedingungen produziert werden und wie sich verschiedene bakterielle Isolate in der Proteinproduktion unterscheiden. Diese Informationen können dabei helfen, Kandidatenproteine zu identifizieren, die an der Virulenz beteiligt sein könnten. Nachdem eine 100 Milliliter große Kultur der kalten Milchbakterien bis zur stationären Phase gezüchtet wurde, überführen Sie 35 Milliliter in ein Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren 20 Minuten bei 4.500 ×g und vier Grad Celsius.

Resuspendieren Sie das Pellet in 35 Milliliter kalter PBS und wiederholen Sie die Zentrifugation. Nachdem Sie das Pellet in einem Milliliter kalter PBS resuspendiert haben, überführen Sie die Lösung in ein steriles 2-Milliliter-Mikroröhrchen und zentrifugieren erneut. Wiederholen Sie die Waschung in einem Milliliter kalter PBS, bevor Sie bei vier Grad Celsius und 14.000 G für eine Minute zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und geben Sie einen Milliliter P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F-Lösung hinzu. Überführen Sie das aufgelöste Pellet in ein 2-Milliliter-Schraubverschlussröhrchen, das etwa 0,5 Milliliter vorsterilisierter Glasperlen enthält.

Danach im Kühlschrank die Zellen durch drei Maliges Einwirken eines Mini-Bead-Beaters für jeweils eine Minute lyse, wobei die Probe nach jeder Runde auf Eis gestellt und eine Minute zentrifugiert wird, bevor der Überstand in ein steriles Polystyrolrohr mit einem Fassungsvermögen von fünf Milliliter überführt wird. Um die Ausbeute zu erhöhen, den Bead-Bashing-Vorgang zwei Mal mit einem zusätzlichen Aliquot an P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F wiederholen. Die Proben abziehen.

Danach, nach der Bestimmung der Proteinmenge, Aliquots zu je 200 Mikrogramm bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis sie zur Durchführung der ersten Dimension verwendet werden. Die isoelektrische Fokussierung oder IEF beginnt damit, die Strip-Halter mit einer Strip-Reinigungslösung zu reinigen. Anschließend die Strips mit Milli-Q-Wasser spülen.

Danach nach dem Trocknen verkehrt herum zum Trocknen ablegen, weisen Sie jeder Probe eine Nummer des Gelstreifenhalters zu. Geben Sie eine zuvor hergestellte 200-Mikrogramm-Probe in das seitliche Loch des Halters und verteilen Sie die Probe mithilfe einer Pipette entlang des Halters, wobei saubere Pinzette verwendet wird. Entnehmen Sie die Gelstreifen aus der Verpackung.

Entfernen Sie dann die Schutzschicht von den Gelstreifen, bevor Sie diese mit der rauen Seite nach unten langsam und gleitend anordnen, um die Streifen vom negativen zum positiven Ende hin anzufeuchten. Um Überhitzung zu vermeiden, legen Sie mit sterilisiertem Wasser angefeuchtetes Abdruckpapier auf die Elektrode und unter die Gelstreifen. Entfernen Sie Luftblasen und bedecken Sie die Streifen mit einer dünnen Schicht Mineralöl, um Austrocknung zu verhindern.

Stellen Sie die Gelstreifenhalter am IEF-Gerät ausgerichtet auf. Führen Sie die Proben mit dem hier aufgelisteten Programm durch. Die Gele können jederzeit während des letzten Schritts entnommen werden.

Wenn das Programm abgeschlossen ist, nehmen Sie die Streifen aus den Streifenhaltern heraus und verpacken Sie sie, sofern sie nicht sofort verwendet werden, in Frischhaltefolie und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis die zweite Dimension SDS-Gelelektrophorese durchgeführt wird. Nachdem Sie die Gießapparatur für die SDS-Gelelektrophorese zusammengestellt haben, bereiten Sie die Gel-Lösung in einem Kolben mit Vakuumanschluss und Rührstab vor, indem Sie Draqel 1,5-molares Tris-Puffer und MCU-Wasser im Verhältnis mischen und die Lösung 20 Minuten lang bei mäßiger Geschwindigkeit unter Vakuum entgasen. Sobald die Entgasung beendet ist, geben Sie 10 % SDS hinzu, indem Sie es vorsichtig an der Kolbenwand entlang pipettieren. Um die Bildung von Blasen zu vermeiden, fügen Sie anschließend frisch zubereitetes Ammoniumpersulfat und TEMED hinzu und rühren um.

Gießen Sie das Gel und lassen Sie es erstarren, dann lösen Sie DTT in der zuvor vorbereiteten Equilibrierungslösung auf. Entnehmen Sie die Streifen der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius, nehmen Sie die Verpackung ab und legen Sie die IPG-Streifen mit der Gel-Seite nach unten in den Puffer. Inkubieren Sie für 30 Minuten. Fügen Sie danach 4,5 Liter Elektrophoresepuffer in den Laufbehälter hinzu.

Danach mit einer Pinzette die Streifen aus der Gleichgewichtslösung nehmen und mit einem Papiertuch überschüssige Pufferlösung abtupfen. Die Gießvorrichtung für Gele auseinanderbauen und die Glasplatten mit warmem Wasser spülen. Nachdem das Wasser auf der Oberseite des Gels durch Laufpuffer ersetzt wurde, mit sauberen Pinzetten einen Streifen auf die lange Platte legen, wobei die Gel-Seite zu Ihnen zeigt.

Schmieren Sie den Streifen mit einem Puffer x ein und verwenden Sie einen Plastikstreifen, um den IPG-Streifen weiter nach unten gegen das Gel zu schieben, wobei alle Luftblasen zwischen Streifen und Gel entfernt werden. Geben Sie Agarose-Siegelungslösung auf die Oberseite des Streifens, um ihn an Ort und Stelle zu fixieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Streifen und senken Sie das Ganze anschließend in den Geltank ab.

Nachdem sichergestellt wurde, dass sich der Pufferstand im äußeren Behälter auf dem vorgesehenen Niveau befindet, befestigen Sie die obere Kammer. Setzen Sie den Rahmen für die obere Pufferkammer auf die Glasplatten und drücken Sie ihn nach unten. Füllen Sie den zweifach konzentrierten Laufpuffer in die obere Kammer bis zur mittleren Markierungslinie.

Fügen Sie dann den 1x Laufpuffer der äußeren Kammer hinzu, bis er die obere Markierungslinie erreicht. Setzen Sie den Deckel auf und schalten Sie das Elektrophoresegerät und das Netzteil ein. Führen Sie die Proben über Nacht bei 52 Volt, 96 Milliampere und fünf Watt durch.

Laufen Sie die Gele, bis sich die vorderen Linien einen Zentimeter vom unteren Rand entfernt befinden. Entfernen Sie nach der Laufzeit die Platten vom Gießgestell. Sobald die Gele von den Glasplatten gelöst sind, fixieren Sie sie mindestens eine Stunde oder über Nacht bei vier Grad Celsius in Lösung eins.

Überführen Sie die Gele anschließend in Fixierlösung zwei und schütteln Sie eine Stunde lang. Waschen Sie die Gele viermal mit Milli-Q-Wasser, jeweils 15 Minuten lang. Färben Sie die Gele danach mit Silbernitratlösung 30 Minuten lang oder bis zu 48 Stunden.

Nachdem die Gele eine Minute lang in Milli-Q-Wasser gewaschen wurden, überführen Sie sie in die Entwicklerlösung, bis das Gel angefärbt ist. Um die Reaktion nach etwa fünf bis 30 Minuten zu stoppen, überführen Sie die Gele 10 Minuten lang in die Stopplösung. Gezeigt ist hier ein mit Kumasi-Blau angefärbtes Gel von Gesamtzellproteinen, extrahiert aus ol dia multivorans.

Klinische Isolate, die entweder in LB oder in Hefe-Mannit-Bouillon gezüchtet und in der stationären Phase geerntet wurden. Der vergleichende Analyse der aus denselben Bakterienkulturen zu zwei verschiedenen Zeitpunkten extrahierten Proteinprofile zeigte ähnliche Bandenmuster, was auf erfolgreiche Proteinextraktionen hindeutet. In dieser Abbildung zeigt die zweidimensionale Gelelektrophorese-Analyse von 200 Mikrogramm Gesamtprotein von Bural dio, pseudo ein Aufkommen von mehr als 500 Spots, die einzeln mittels Massenspektrometrie identifiziert werden können.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Zytometrie angewendet werden, um quantitative und qualitative Unterschiede zwischen eng verwandten bakteriellen Isolaten zu bestimmen. Außerdem können Forscher durch eine Modifikation der Färbemethode die Identität von Proteinspots mittels Spot-Exzision und Massenspektrometrie ermitteln.