Ein Mantel Bettwäsche Seed-Test zur Genetisch erkunden

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen Samenschalen-Bettierungs-Assay zusammenzustellen, um zu untersuchen, wie der Endosperm die Samenkeimung bei Arabidopsis unter verschiedenen Umweltbedingungen auf genetischer und in-vitro-Ebene steuert. Dies wird erreicht, indem im ersten Schritt eine Spritzennadel und abgestumpfte Pinzette verwendet werden, um vorsichtig den Samen, die Samenschale und den Embryo aus Arabidopsis-Samen zu dissezieren. Im zweiten Schritt werden die dissezierten Samenschalen vorsichtig auf ein Keimmedium übertragen.

Danach werden die Samenschalen zu einer einzigen runden Schicht zusammengefügt. Im letzten Schritt werden die Embryonen in der Mitte des zusammengestellten Samenschalenbetts angeordnet, ebenfalls als einzelne runde Schicht.

Der Endosperm spielt eine wesentliche Rolle bei der Kontrolle der Samenkeimung in unseren ab-Sekunden-Samen. Und der Samenkapselbiege-Test ist ein in-vitro-genetisches Systemverfahren, um die molekulargenetischen Komponenten der in dem Endosperm aktiven Signalwege zur Kontrolle der Samenkeimung zu identifizieren. Im Allgemeinen haben Einzelpersonen bei dieser Methode Schwierigkeiten, da es schwierig ist, das Embryo schnell zu dissezieren, ohne es zu beschädigen.

Das Alter des Setzmaterials ist ebenfalls wichtig, da es mit der Zeit seine Fähigkeit verliert, die Zellbestimmung zu steuern. Geben Sie zunächst 50 bis 60 Mikroliter reife, trockene Arabidopsis-Samen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie dann ein Milliliter 70 %igen Ethanol zum Röhrchen hinzu und schütteln Sie die Samen bei Raumtemperatur im Vortex oder bei 1200 U/min. Zentrifugieren Sie das Röhrchen nach 10 Minuten drei Sekunden lang bei 4.000 × g, um die Samen am Boden des Röhrchens zu sammeln.

Danach mit einer Vakuumsaugspitze vorsichtig den Ethanol abpipettieren, wobei die Samen am Boden des Röhrchens verbleiben. Nun ein Milliliter steriles destilliertes Wasser zu den Samen geben und diese anschließend weitere 10 Minuten schütteln. Nach erneutem Abzentrifugieren der Samen die Überstände abpipettieren und erneut ein Milliliter steriles destilliertes Wasser zum Röhrchen hinzufügen, wobei sichergestellt werden muss, dass die Wasserströmung die Samen gleichmäßig im gesamten Röhrchen suspendiert.

Danach den Probenglas in ein Reagenzglasgestell stellen, damit sich die Samen am Boden des Glases absetzen können. Nach etwa 30 Sekunden das Wasser vorsichtig abpipettieren, um die Samen zu platzieren. Zunächst 30 Milliliter frisch zubereitetes Keimmedium mit einer Temperatur von 50 Grad Celsius in eine 100 Millimeter große Petrischale geben. Die Samen in 200 Mikroliter steriler, destillierter Wasser resuspendieren und anschließend mit einer 1-Milliliter-Mikropipettenspitze auf die Oberfläche des Keimmediums überführen.

Aspirieren Sie das Wasser um die Samen herum und lassen Sie die Petrischale mit den Samen anschließend offen im laminaren Luftstromtisch zur weiteren Trocknung stehen. Schließen Sie nach zwei Stunden die Petrischale und lassen Sie die Samen weitere 90 Minuten im Abzug. Stellen Sie nun ein Stereomikroskop in den Abzug.

Geben Sie 30 Milliliter Keimmedium in eine andere 100-Millimeter-Petri-Schale und legen Sie dann zwei rechteckige, aneinandergrenzende Watman-3-Millimeter-Papiere auf die Oberfläche des Mediums. Der schwierigste Schritt dieses Verfahrens ist die Dissektion der Samen, da diese sehr dünn sind; daher ist äußerste Vorsicht erforderlich, um den Embryo nicht zu beschädigen, wenn der mit einer sterilen stumpfen Dumont-Zange Nummer fünf gehaltene Samen geschnitten wird.

Übertragen Sie die Samen auf die Papiere, wobei die Pinzette geschlossen gehalten wird. Drücken Sie vorsichtig einen einzelnen Samen in das Papier. Verwenden Sie nun die Nadelspitze einer 29-Gauge-Insulinspritze, um die Samenschale entlang der längsten halben Hauptachse so nahe wie möglich an der Stelle zu schneiden, an der die Keimblätter mit der Radikula verbunden sind.

Verwenden Sie dann die Pinzette, um den Samen gegen das Papier zu drücken. Üben Sie erneut Druck an der Spitze der Cains nahe der Spitze des Radikels aus, um den Embryo aus der Samenschale zu lösen und ein Keimlingsassay mit Samenschalenbettierung aufzubauen. Legen Sie zunächst ein 3,5 mal 5 Zentimeter großes Stück steriles Nylonnetz in eine weitere frisch gegossene 100 Millimeter Petrischale mit Keimmedium.

Verwenden Sie dann die Spritze, um die Embryonen und Samenschalen vorsichtig auf die metallischen Kanten der Pinzette zu schieben, und übertragen Sie das Pflanzengewebe auf das Nylonnetz. Stellen Sie mit Hilfe der Pinzette und der Spritze eine einzelne, kreisförmige Schicht der Samenschalen her, wobei darauf zu achten ist, dass die Schalen möglichst eng beieinander liegen und die Öffnungen der Samenschalen nach oben zeigen. Platzieren Sie anschließend die Embryonen in einer einzelnen, kreisförmigen Schicht in der Mitte des Samenschalenbetts, wobei sichergestellt werden muss, dass auch die Embryonen möglichst eng beieinander liegen.

Schließlich die Seaco-Bettungs-Assays unter kontinuierlichem Licht bei 20 bis 21 Grad Celsius inkubieren, was mit früheren Ergebnissen übereinstimmt. Samen eines Kaninchen-OpSys-Mutanten, die nicht in der Lage sind, Gierillin oder GA-defiziente Mutanten zu synthetisieren, können 80 Stunden nach der Sameninhibition nicht keimen. Im Gegensatz dazu und in weiterer Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen führt die Entfernung der Samenschale zum Wachstum des Embryos der GA-defizienten Mutante, es sei denn, OB-CIC-Säure oder eine BA ist im Medium vorhanden, was darauf hindeutet, dass das Endosperm der GA-defizienten Mutanten eine BA in Richtung des Embryos freisetzt, um dessen Keimung zu blockieren.

In dieser Aufnahme wird 80 Stunden nach der Sameninhibition ein Samenschalen-Bett-Assay mit GA-defizienten mutierten Embryonen auf einem Bett aus 80 GA-defizienten mutierten Samenschalen gezeigt. In Übereinstimmung mit unserer Hypothese hemmen GA-defiziente mutierte Samenschalen das Wachstum von GA-defizienten mutierten Embryonen. Hier wird ein Samenschalen-Bett-Assay mit GA-defizienten mutierten Embryonen, die auf einem Bett aus GA-defizienten mutierten Samenschalen kultiviert wurden, die ebenfalls nicht in der Lage sind, ABA zu synthetisieren, 80 Stunden nach der Sameninhibition dargestellt. Wie erwartet können die mutierten Samenschalen das Wachstum der GA-defizienten mutierten Embryonen nicht blockieren.

Ebenso waren GA-defiziente Mutantenembryonen, die auf einem Bett aus GA-defizienten Mutantensamhüllen kultiviert wurden, die den DELI-Faktor RGL2 fehlten, nach dieser Methode außerstande, das Wachstum der GA-defizienten Mutantenembryonen zu blockieren. Andere Verfahren, wie beispielsweise die Analyse der Genexpression aus Samhüllen und aus Samen isolierten Embryonen, können durchgeführt werden, um die genetischen Wechselwirkungen mithilfe der Samhüllen-Badmethode zu untersuchen. Sobald die Technik beherrscht ist, sollte sie Forschern auf dem Gebiet der Samenkeimung ermöglichen, zu erforschen, wie die Samhülle das embryonale Wachstum als Reaktion auf Umweltreize in unserer Art reguliert.