Bezeichnung des metabolisch aktiven Bakterien im Darm der Generalist Spodoptera littoralis Über DNA Stable Isotope Probing Mit ¹³ C-Glucose

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, eine effiziente Methodik zu beschreiben, die zur phylo genetischen Charakterisierung der stoffwechselaktiven Bakterien im Darm eines Insekts eingesetzt wird. Dies wird erreicht, indem dem Insekt zunächst C13-markierte Glukose zugeführt wird, um die DNA der stoffwechselaktiven Bakterien in seinem Darm isotopisch anzureichern. Der nächste Schritt besteht darin, die DNA der im Darm vorhandenen Bakteriengemeinschaft zu extrahieren.

Der dritte Schritt besteht darin, die DNA der stoffwechselaktiven Spezies, die das C 13 eingebaut hat, herauszutrennen. Die DNA wird dann phylogenetisch identifiziert und durch Pyrosequenzierung für die vorhandenen Spezies quantifiziert. Auf diese Weise werden die metabolisch aktiven Bakterienarten identifiziert, aus denen die im Insektendarm vorhandene Gemeinschaft besteht.

Der Darm eines mehrzelligen Organismus ist also eine geniale Erfindung, um die metabolischen Fähigkeiten von Mikroorganismen zu nutzen, um komplexe organische Substanz aufzulösen oder zu lösen, damit sie schließlich als Nährstoffe für den Insektenwirt dienen kann. Um das System zu verstehen, müssen wir erstens analysieren, wer da draußen ist, und zweitens, wer welche Stoffwechselaktivitäten hat. Wenn wir diese Daten haben, können wir den Fluss von Metaboliten und Abbauprodukten zwischen den abbauenden Mikroorganismen und dem Insektenwirt rekonstruieren.

Diese Methode kann uns helfen, Schlüsselfragen im Bereich der mikrobiellen Ökologie zu beantworten, insbesondere in Bezug auf die Art und Weise, wie diese Mikroben mit ihrem Wirt interagieren. In diesem Sinne könnten wir mehr wissen und klären und definieren, welche Funktionen diese Organismen für ihren Wirt erfüllen. Diese Methode kann jedoch einen Einblick in die allgemein aktiven Darmbakterien geben.

Durch die Verfolgung der Glukose kann sie auch an anderen Kohlenstoffquellen durchgeführt werden, z. B. an der Markierung der Cellose, um aktive Bakterien zu identifizieren, die am Verdauungsprozess des Ocrantennährstoffs beteiligt sind. Bewahren Sie Op Liter, Eier und Petrischalen bei Raumtemperatur auf, bis sie schlüpfen. Setzen Sie dann die frisch geschlüpften Larven in eine saubere Plastikbox um und ziehen Sie sie auf einer künstlichen Diät bei 23 bis 25 Grad Celsius unter einem langen Tagesregime mit 16 Stunden Beleuchtung und acht Stunden Dunkelheit auf, nach einigen Tagen bringen Sie neun bis 15 gesunde Larven des zweiten Stadiums aus der Aufzuchtbox in einzelne Petrischalen mit frischer C 13-Glukose

Künstliche Diät mit Stacheln, pro Behandlung werden mindestens drei Replikate von jeweils drei Larven benötigt. Verwenden Sie eine künstliche Ernährung, die die gleiche Menge an nativer Glukose wie eine natürliche Nahrungsquelle wie Baumwolle liefert, um die Kontrollgruppe zu füttern. In den nächsten 24 Stunden.

Erneuern Sie häufig die künstlichen Diäten. Beginnen Sie damit, die Larven mit einer weichen Pinzette in ein Becken mit destilliertem Wasser zu bringen, um große Ablagerungen zu entfernen. Dann in eine neue, saubere Schüssel umfüllen, um die Insekten zu betäuben und zu töten.

Legen Sie sie auf Eis und senken Sie die Temperatur in einer Kühlbox auf minus fünf Grad Celsius. Desinfizieren Sie dann die toten Insekten mit 70%igem Ethanol und tauchen Sie sie für die Sektion in PBS. Die Werkzeuge müssen zusätzlich mit 70% Ethanol gereinigt werden.

Beginnen Sie mit Schnitten in der Nagelhaut entlang der rechten und linken Seite. Beginnen Sie am Kopf und enden Sie am Anus. Entfernen Sie das gesamte Exoskelett, die malischen Tubuli und den Fettkörper.

Ersetzen Sie dann den Puffer vor dem Öffnen des Darms durch den Darm, der von den anderen Geweben isoliert ist. Verarbeiten Sie den gesamten Darm oder Abschnitte für den Darm, den Mitteldarm oder den Hinterdarm. Je nach wissenschaftlicher Fragestellung.

Übertragen Sie das Darmgewebe ohne PBS in ein kleines steriles Röhrchen und bewahren Sie es im Gefrierschrank auf. Vor der DNA-Extraktion trocknen Sie die Proben je nach Größe des Gewebes 30 bis 90 Minuten lang bei 45 Grad Celsius in einem Vakuumkonzentrator. Als nächstes zerkleinern Sie das getrocknete Gewebe mit einem sterilen Kunststoff-Pelé, um die genomische DNA mit einem Kit für die Boden-DNA-Extraktion zu extrahieren.

Bestimmen Sie dann die Konzentration der endgültigen entgangenen DNA mit einem Spektralphotometer. Verifizieren Sie eine erfolgreiche Extraktion der mikrobiellen metagenomischen DNA aus dem Insektendarm, indem Sie einen diagnostischen PCR-Assay mit den bakteriellen allgemeinen Primern 27 F und 1, 492 R für die Diagnose vorbereiten. Lassen Sie fünf Mikroliter jedes PCR-Produkts etwa 20 Minuten lang auf einem 1%igen Agros-Gel bei 300 Volt und 115 Milliampere laufen.

Die korrekte Größe der Amplikons beträgt 1,5 Kilobasen. Ziehen Sie die extrahierte DNA, die jedem experimentellen Replikat entspricht, zusammen. Halten Sie diejenigen mit und ohne C13-Glukose getrennt.

Normalisieren Sie die DNA-Konzentrationen, um sicherzustellen, dass jede Probe gleichmäßig zu ihrem Pool beiträgt. Für den Ultrazentrifugationsprozess eignet sich eine Endkonzentration von 500 bis 5.000 Nanogramm DNA. Überprüfen Sie die zu erwartende Konzentration mit dem Spektralphotometer in einem sterilen 15-Milliliter-Schraubverschlussröhrchen.

Richten Sie den Verlauf mittel ein. Kombinieren Sie die quantifizierte DNA mit 4,8 Millilitern Cäsiumchloridlösung. Füllen Sie das Volumen dann mit sechs Millilitern Gradientenpuffer auf.

Füllen Sie die Mischungen vorsichtig in 5,1-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen um. Füllen Sie die Schläuche mit einer Spritze und einer Nadel bis zum Halsansatz und vermeiden Sie das Pumpen oder die Bildung von Luftblasen. Fügen Sie in jedem Lauf mindestens einen leeren Gradienten ohne DNA ein.

Um als Referenzgradient zu fungieren, wählen Sie Röhrenpaare aus und gleichen Sie sie auf 10 Milligramm aus. Bringen Sie einen Tubenaufsatz auf jede Tube an und stellen Sie sicher, dass sie auslaufsicher sind, indem Sie die Tube umdrehen und mit der Hand mäßigen Druck ausüben. Verwenden Sie einen nahezu vertikalen Rotor mit acht Vertiefungen.

Verschließen Sie die Rotorvertiefungen vorsichtig und laden Sie den Rotor gemäß den Anweisungen des Herstellers in die Ultrazentrifuge. Schleudern Sie die DNA bei 50.000 U/min bei 20 Grad Celsius unter Vakuum für 40 Stunden herunter. Wählen Sie die maximale Beschleunigung und die Verzögerung ohne Bremsen.

Entfernen Sie zwei Tage später die Röhrchen vorsichtig mit einer Pinzette vom Zentrifugenrotor. Legen Sie sie in ein Gestell, ohne die gebildeten Gradienten zu stören und verarbeiten Sie die Rohre sofort. Zuerst wird eine HPLC mit einer Flussrate von 850 Mikrolitern pro Minute äquilibriert.

Befestigen Sie dann das Ultrazentrifugenröhrchen an einem Klemmständer und stechen Sie mit einer 23-Gauge-1-Zoll-Nadel, die an einer Spritze befestigt ist, in den Boden des Röhrchens. Stechen Sie also vorsichtig mit einem Control Miner in die Oberseite des Rohrs ein, um die Form, den Gradienten und die Praxis im Voraus nicht zu stören und eine erfolgreiche PSA-Bewegung zu gewährleisten. Führen Sie anschließend die am Pumpenschlauch befestigte Nadel in die Oberseite des Röhrchens ein, wo sich keine Flüssigkeit befindet, und sammeln Sie Tropfen von unten direkt in sterile 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen, sammeln Sie alle 30 Sekunden eine Fraktion für 425 Mikroliter pro Fraktion.

In diesem Beispiel werden 12 Brüche aus jedem Gradienten erfasst. Messen Sie anschließend die Dichte jeder abgetrennten Fraktion auf einer Analysenwaage. Fahren Sie mit der DNA-Wiederherstellung und der Pyro-Sequenzierung fort, indem Sie das Textprotokoll 24 Stunden lang konsultieren.

10 Millimolare C 13-Glukose wurde in der Ernährung von SSOP-Litern ergänzt. Larve. Die gleiche Menge an normaler Glukose wurde dem Futter der Kontrollinsekten zugesetzt. Als nächstes wurde DNA aus der Bakteriengemeinschaft des Insektendarms extrahiert.

Auf einem Elektrophorese-Gel bestätigte ein starkes Band genomischer DNA oben eine erfolgreiche DNA-Extraktion, eine diagnostische PCR. Die Verwendung von bakteriellen Universalprimern zeigte das Vorhandensein von bakterieller DNA, die quantitative Pyrosequenzierung wurde direkt an den repräsentativen SIP-Gradienten durchgeführt, um die Abstammungslinie der Spezies und ihre relative Häufigkeit aufzudecken. Insgesamt wurden 120.045 qualitativ hochwertige Lesevorgänge mit einer durchschnittlichen Länge von 404 OTs generiert.

Das Pyro-Sequenzierungsprofil zeigte eine erhöhte Abundanz bestimmter Spezies, einschließlich Enterokokken und Panto, in der markierten Probe im Vergleich zu der in der Kontrollgruppe. Daher gelten diese Bakterien als metabolisch aktiv und verdienen weitere Studien. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, eine angemessene Kontrolle in die CYP-Analyse einzubeziehen.

Was also die Auswirkungen des Hintergrunds abziehen würde, die Kontamination im Haarblitz und sicherstellen würde, dass die Bakterienvielfalt und -häufigkeit, die auftauchen oder verschwinden, kein Artefakt der Masse selbst sind. Nach diesem Verfahren können Methoden wie die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung verwendet und durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. In diesem Fall wird auf die Lokalisierung und Anordnung der Bakterien im Darm des Insekts geachtet.