Zellbasierte Assay-Protokoll für die prognostische Prognose der idiopathischen Skoliose Mit Cellular dielektrischer Spektroskopie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Prognose der idiopathischen Skoliose entsprechend der funktionellen Gruppierung der Patienten vorherzusagen, indem ihre PBM C'S-Reaktion auf die GPCR R-Aktivierung mittels zellulärer dielektrischer Spektroskopie gescreent wird. Dies wird durch die Kultivierung von pbmc in Gegenwart von Phyto-Hämagglutinin oder PHA erreicht, um die Zellzahl zu erweitern. Die Zellexpansion erfolgt in einer Röhre, die in einer Schräglage gehalten wird.

In einem zweiten Schritt werden die Zellen mit OSTEOPONTIN oder OPN behandelt, wodurch die Aktivität des GI-Proteins erhöht oder verringert wird. Je nach Patient wird die Zellsuspension nach der Behandlung in die Mikroplatte überführt. Anschließend werden die Zellen mit GI- oder GS-GPCR-Agonisten stimuliert, um die daraus resultierenden Impedanzänderungen zu bestimmen.

Die Ergebnisse liefern kinetische Reaktionen für alle Wells und integrierte Reaktionen werden dann auf der Grundlage von Impedanzänderungen quantifiziert. Die Auswirkungen dieser Technik gehen weit über die reine Diagnose hinaus. Zum ersten Mal können wir also frühzeitig als symptomatische Patienten erkennen, die gefährdet sind, an Skoliose zu erkranken, und da wir jetzt wissen, wer eine Skoliose entwickeln wird oder in welchem Stadium sie sich befindet, können wir neue Therapien anbieten, um sie zu behandeln.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Röntgenexposition besteht darin, dass diese Technik die Vorhersage der Progno-Osteopathen-Skoliose ermöglicht, ohne dass Covid gemessen werden muss und ohne Gesundheitsrisiko. Das Neueste, die Technik, wird jetzt unsere Forschungsassistentin Nita Franco sein, das Auftauen von gefrorenen Aliquoten von mononukleären Zellen des peripheren Blutes in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad. Mit einer sterilen Pipette wird die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 15 Millilitern vollständigem Medium und Zentrifuge überführt.

Die Zellen saugen den Überstand ab. Suspendieren Sie dann das Zellpellet vorsichtig in einem Milliliter PHA-Medien, vervollständigen Sie das Volumen auf 20 Milliliter mit der gleichen Medienkappe und locker das Rohr, damit Luft eindringen kann. Inkubieren Sie die Röhre über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator, damit sich ruhende Lymphozyten in schnell proliferierende Lymphoblasten verwandeln können.

Ziehen Sie die Verschlüsse vollständig fest und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration. Suspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in einem Milliliter des vollständigen Mediums.

Vervollständigen Sie das Volumen mit dem gleichen Medium auf 20 Milliliter und verschließen Sie das Röhrchen, kultivieren Sie es locker über Nacht, um die Zellzahl zu erweitern. Nach zwei Wäschen mit 10 Millilitern RPMI 1640 resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 600 Mikrolitern RPMI 1640. Messen Sie die Zellkonzentration und -viabilität mit einem automatisierten Zellzähler und einem Viabilitätsanalysator.

Geben Sie dann ein entsprechendes Volumen von RPMI 1640 hinzu, um es auf eine Zellkonzentration von 1,5 mal 10 bis den fünften Zellen pro 20 Mikroliter einzustellen. 100 Mikroliter der Suspension werden in zwei sterile 1,5-Milliliter-Orph-Röhrchen überführt. Geben Sie rekombinantes Osteopontin in einem Röhrchen bis zu einer Endkonzentration von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter hinzu.

Geben Sie das gleiche Volumen PBS in das zweite Röhrchen. Mischen Sie jede Bedingung vorsichtig, indem Sie zweimal mit einer sterilen Pipette von 100 Mikrolitern pipettieren. Geben Sie anschließend fünf Mikroliter RPMI 1640 in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte und zentrifugieren Sie die Platte drei Minuten lang bei 200 GS, um alle Luftblasen zu entfernen und die Zellen vom Röhrchen auf die Mikroplatte zu übertragen.

Pipettieren Sie einmal vorsichtig auf und ab, um eine gleichmäßige Suspension der Zellen zu gewährleisten. 40 Mikroliter Zellsuspension pro Well in Quad-Duplikat für unbehandelte Zellen und in Duplikaten für ROPN- oder PBS-behandelte Zellen aussäen. Lassen Sie die Zellplatte fünf Minuten lang unter der sterilen Haube, damit die Zellen ruhen und sich gleichmäßig auf dem Boden der Vertiefung absetzen können.

Um die Wirkung der OPN-Kultur zu optimieren, werden die Zellen 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator in einem Kohlendioxid-Inkubator die Kulturen bei Raumtemperatur für etwa 30 Minuten äquilibriert. Bereiten Sie in der Zwischenzeit einen Milliliter 100 mikromolares Somatostatin und Isoproterenol in RPMI 1640 vor. Füllen Sie die Verbundplatte, indem Sie 20 Mikroliter in geeignete Vertiefungen abgeben.

Decken Sie die Verbundplatte mit einer aushärtbaren Versiegelung ab. Legen Sie die Pipettenspitzen und die Verbundplatte in das CDS-basierte System ein. Benennen Sie die Platte in der CDS-basierten Gerätesoftware.

Gehen Sie zur Protokollliste und wählen Sie das entsprechende Protokoll aus, um das Protokoll zu starten. Klicken Sie auf Start. Das integrierte Fluidiksystem gibt die Verbindungen gleichzeitig in alle Vertiefungen.

Das CDS-basierte System sammelt die Daten automatisch 15 Minuten lang, nachdem die Zellviabilität der Verbindung zwischen allen Proben vergleichbar war, mit konstanten Werten im Bereich von 86 bis 96 %. Im Gegensatz dazu wurden hohe Schwankungen bei den Zellzahlen festgestellt. Von den 32 verwendeten Proben wiesen zwei eine unzureichende Anzahl von Zellen auf und wurden nicht klassifiziert. Dieses Beispiel zeigt die funktionelle Klassifikation nach dem Grad des Ungleichgewichts zwischen GI- und GI-Signalwegen.

Die Auswertung des OPN-Effekts als Reaktion auf die GI-Stimulation hatte ergeben, dass OPN das Ansprechen bei den Patienten 353 und 371 erhöhte. Im Gegensatz dazu war das Ansprechen bei den Patienten 345 und 382 um mehr als 50 % und bei Patienten 370 nach ROPN-Behandlung um weniger als 50 % reduziert. So konnten wir nach unseren Klassifikationskriterien die Patienten 353 und 371 in FG einteilen, Patienten 300 von 45 und 382 in FG zwei und Patient 370 in FG drei.

Parallel dazu wurden alle Patienten auf ihr Ansprechen auf die Stimulation von GI-Proteinen untersucht und mit Kontrollpersonen verglichen. Erwartungsgemäß waren alle Patienten weniger ansprechend als Kontrollpersonen. Patienten, die in dieselbe funktionelle Gruppe eingeteilt wurden, zeigten ein ähnliches Maß an maximalem Ansprechen.

Die Klassifikation einer großen Kohorte von SC-Patienten, die in unserer Spezialklinik am San Justine Hospital regelmäßig durchgeführt wurde, hat ergeben, dass die drei Funktionsgruppen ähnlich verteilt waren. Bei den mittelschweren Fällen überwog die FG zwei bei den schweren Fällen. Nachdem Sie auf dieses Video gewartet haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Patienten mit Hilfe der zellulären dielektrischen Spektroskopie in zwei, drei funktionelle Gruppen einteilen.