Name: Zellbasierte Assay-Protokoll für die prognostische Prognose der idiopathischen Skoliose Mit Cellular dielektrischer Spektroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-16T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Erfahren Sie die zellbasierte Assay-Methode mit zellularer dielektrischer Spektroskopie zur Vorhersage der Prognose idiopathischer Skoliose. Diese Technik ermöglicht die funktionelle Klassifizierung von Patienten ohne Röntgenstrahlenbelastung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus La Fondation Yves Cotrel de l&#39;Institut de France, Paris, Frankreich (Dr. Moreau) unterstützt wird, die kanadischen Institutes of Health Research (Grant PP2-99466 Dr. Moreau) und Fourth Dimension Spine LLC , New York, USA (Forschungsstipendium an Dr. Moreau).

Das gesamte Verfahren wird unter sterilen der biologischen Haube ausgeführt und alle Lösungen und Geräte in Kontakt mit Zellen müssen steril sein. 1. Vorbereitung wichtiger Lösungen <ol><li> Werden die Lösungen gemäß Tabelle 1. </li><li> Halten ausgewogene Salzlösung (BSS) bei Raumtemperatur und allen anderen Lösungen bei 4 ° C bis zum Zeitpunkt der Verwendung. </li><li> Warm kalt Medien auf 37 º C im Wasserbad für einige Minuten vor der Verwendung. </li></ol> 2. Vorbereitung und Lagerung von PBMCs <ol><li> Sammeln Sie 10 ml Vollblut in EDTA-behandelten Sammelröhrchen zu zwei Teilmengen von PBMCs vorbereiten mit 5 ml für jedes Aliquot. </li><li> Übertragungs 5 ​​ml Vollblut aus der EDTA-behandelte Sammelröhrchen in ein 50 ml Röhrchen. </li><li> Gleiches Volumen von BSS und mischen Probe durch vorsichtiges Pipettieren auf und ab. </li><li> Platz 3 ml Ficoll in zwei 15 ml Falcon-Röhrchen. </li><li> Vorsichtig Schicht 4,5 mlvon Blut-Gemisch verdünnt über den Ficoll in jeder Röhre. </li><li> Lassen Sie die Röhrchen Ruhe für bis zu 5 min, um eine klare Trennung von Blut und Ficoll begünstigen. </li><li> Zentrifugieren der Röhrchen bei 400 × g für 30 min bei Raumtemperatur ohne Bremse. </li><li> Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge zu entfernen, um die Schichtung nicht stören. Die PBMCs sind an der BSS / Ficoll-Schnittstelle sichtbar. </li><li> Ernten Sie die trübe Schicht von PBMCs an der Schnittstelle der beiden Rohre mit einer Pipette und übertragen auf ein neues 50-ml-Tube. </li><li> 20 ml Vollmedium. </li><li> Das Röhrchen bei 288 x g für 7 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration. </li><li> Zellpellet in 500 ul zusätzlichen Medien. </li><li> Gleiches Volumen des Einfrierens Medien. </li><li> Übertragen der Zellsuspension auf eine Kryoröhrchen. </li><li> Legen Sie die Kryoröhrchen in ein cryofreezing Behälter mit Isopropanol. </li><li> Lagern Sie den Gefrierbehälter bei -80 ° C über Nacht. </li><li> Transfer die gefrorenen PBMC Aliquot von flüssigem Stickstoff zur Langzeitlagerung. </li></ol> 3. Functional Test 1. Tag 1 <ol><li> Platzieren Aliquot von flüssigem Stickstoff in einem Wasserbad bei 37 ° C für eine Minute oder bis abgetaut. </li><li> Übertragen der Zellsuspension in ein 50 ml-Röhrchen mit einer sterilen Pipette. </li><li> 15 ml komplette Medien-und Spin die Zellen nach unten bei 200 xg für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration. </li><li> Leicht suspendieren Zellpellet in 1 ml PHA Medien. </li><li> Füllen Sie das Volumen auf 20 ml mit der gleichen Medien. </li><li> Das Röhrchen locker, damit die Luft gelangen. </li><li> Verlassen das Rohr über Nacht bei 37 ° C in einem CO 2-Inkubator, damit Ruhe Lymphozyten in schnell proliferierenden Lymphoblasten zu transformieren. </li></ol> 2. Tag 2 <ol><li> Nehmen Sie die Röhre aus dem Inkubator, die Verschlüsse vollständig und drehen Sie die Zellen nach unten bei 200 xg für 5 minbei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration. </li><li> Sanft auszusetzen Zellpellet in 1 ml Vollmedium. </li><li> Füllen Sie das Volumen auf 20 ml mit der gleichen Medien. </li><li> Das Röhrchen locker, damit die Luft gelangen. </li><li> Verlassen das Rohr über Nacht bei 37 ° C in einem CO 2-Inkubator, um die Zellzahlen zu erweitern. </li></ol> 3. Tag 3 <ol><li> Holen Sie sich das Rohr aus dem Inkubator, die Verschlüsse vollständig und drehen Sie die Zellen nach unten bei 200 xg für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration. </li><li> Waschen der Zellen zweimal mit 10 ml RPMI-1640 durch Zentrifugation bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Resuspendieren vorsichtig das Zellpellet in 600 ul RPMI-1640. </li><li> Messen Sie die Zellkonzentration und Lebensfähigkeit, mit einem automatisierten Zellzähler und Lebensfähigkeit-Analysator. </li><li> Hinzufügen geeigneten Volumen RPMI-1640 zu einer Zellkonzentration von 1,5 × 10 5 Zellen/20 &amp;mgr; l einzustellen. </li&gt; <li> Gönnen Zellen mit rekombinanten OPN (rOPN) oder Vehikel (PBS) in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. <ol><li> Transfer von 100 &amp;mgr; l der Zellsuspension in zwei sterile 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Hinzufügen rOPN in ein Rohr bis zu einer Endkonzentration von 0,5 ug / ml. </li><li> Ein gleiches Volumen PBS in der zweiten Röhre. </li><li> Vorsichtig mischen jede Bedingung, die durch Auf-und Abpipettieren zweimal mit einer sterilen Pipette eingestellt auf 100 ul. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die kleine Probe 96-Well-Mikroplatten. <ol><li> In 5 ul RPMI-1640 in jede Vertiefung. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 200 g für 3 min, um Luftblasen zu entfernen. </li></ol></li><li> Samen der unbehandelten Zellen als auch Zellen mit rOPN oder PBS behandelt. <ol><li> Vor der Übertragung der Zellen von Rohr zu Mikro sanft auf und ab pipettieren einmal, um eine gleichmäßige Suspension der Zellen zu gewährleisten. </li><li> In 40 ul Zellsuspension pro Well in vierfacher Ausfertigung für die unbehandelten Zellen, in zweifacher Ausfertigung für rOPN oder PBS behandelten Zellen. ReFER für den Entwurf 1. Diese Konstruktion ermöglicht es 12 Patienten auf der Mikrotiterplatte getestet werden. </li><li> Lassen Sie die Zelle Platte unter dem sterilen Abzug für 5 Minuten, sodass die Zellen, um sich auszuruhen und, bevor sie in den Inkubator absetzen gleichmäßig auf den Boden der Mulde. </li></ol></li><li> Inkubiere die Platte für 18 Stunden bei 37 ° C in einem CO 2-Inkubator, um die Wirkung von OPN zu optimieren. </li></ol> 4. Tag 4 <ol><li> Führen Sie die Platte mit Verbindungen. <ol><li> Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und lassen Sie es bei Raumtemperatur für etwa 30 min. </li><li> Bereiten 1 ml 100 uM Somatostatin und Isoproterenol in RPMI-1640 durch Zugabe von 10 ul der Stammlösung (10 mM) in 990 ul RPMI-1640. </li><li> Füllen Sie die Verbindung Platte durch den Verzicht auf 20 ul in entsprechenden Vertiefungen, wie in Abbildung 2 angegeben. </li><li> Decken Sie die Verbindung mit einem vorgeschnittenen Platte Stechdichtung, Veränderungen in Verbindung Konzentration vor durch Verdunstung zu vermeidenoder während der Inkubation in der CDS-basierten System. </li><li> Wägezelle Platte, Pipettenspitzen, und die Verbindung Platte in den CDS-basierten System. </li><li> Nennen Sie die Platte in der CDS-basierten Gerätesoftware. </li><li> Wählen Sie das entsprechende Protokoll. Die für die Klassifizierung mit PBMCs bearbeitet Protokoll &quot;Agonist Non-adhärenten Zellen Kleine Probenplatte RT 15 min&quot; genannt. Gehen Sie auf die Protokoll-Box und wählen Sie dieses Protokoll in der Liste der Protokolle </li><li> Starten Sie das Protokoll, indem Sie auf &quot;Start&quot;. </li><li> Die integrierten Flüssigkeitssystem gleichzeitig addiert die Verbindungen zu allen Vertiefungen durch Injizieren 5 ul pro Vertiefung in einer Endkonzentration von 10 &amp;mgr; M in einem Gesamtvolumen von 50 &amp;mgr; l zu erreichen. </li><li> Die CDS-basierten System sammelt automatisch die Daten für 15 min nach Zugabe der Verbindung. </li></ol></li><li> Datenanalyse <ol><li> Wählen niedrigen und hohen Frequenzbereiche bei der Berechnung der extrahierten Werte für die nicht zu benutzenadhärenten Zellen. </li><li> Wählen Driftkorrektur, um die lineare Veränderung der Ausgangsimpedanzmessungen über die Zeit zu korrigieren. </li><li> Wählen Sie die Datenfilterung, um Variationen in der kinetischen Gangmessung durch elektronische Rauschen und Verbindung zusätzlich zu reduzieren. </li><li> Wählen Sie die Max-Min-Methode für das Gesamtanalysezeit. </li><li> Exportieren von Daten in Excel unter der Option Plattenformat. </li><li> Berechnen delta G (&amp;Dgr; G) durch Subtrahieren der durchschnittlichen Größe der Reaktion auf Stimulation Gi (RMGI) aus dem Mittelwert der Antwort Größenordnung Gs Stimulation (RMG) unter Verwendung der folgenden Formel: &amp;Dgr; G = RMGI - RMGs </li><li> Der prozentuale Anteil der fache Wirkung (Fe) von OPN auf Gi-vermittelte Reaktion durch Division der durchschnittlichen Größe der Antwort auf Gi Stimulation in Gegenwart von OPN (RmGiOPN) mit der mittleren Größe der Reaktion auf die Stimulation in Anwesenheit von PBS (GI RmGiPBS) unter Verwendung der folgenden Formel: Fe = 100 x (RmGiOPN / RmGiPBS) </li><li> Siehe TLage 2, um Patienten zu klassifizieren. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kane, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%3A+a+call+for+a+statement+of+terms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop.+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence: a call for a statement of terms.</a> Clin Orthop. Relat Res. 126, 43-46 (1977).</li>
<li>Bunnell, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+screening+for+scoliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">Selective screening for scoliosis.</a> Clin Orthop Relat Res. 434, 40-45 (2005).</li>
<li>Asher, M. A., Burton, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adolescent+idiopathic+scoliosis%3A+natural+history+and+long+term+treatment+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Scoliosis%22%5BJournal%5D)">Adolescent idiopathic scoliosis: natural history and long term treatment effects.</a> Scoliosis. 1 (1), 2(2006).</li>
<li>Fong, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meta-analysis+of+the+clinical+effectiveness+of+school+scoliosis+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">A meta-analysis of the clinical effectiveness of school scoliosis screening.</a> Spine (Phila Pa 1976). 35 (10), 1061-1071 (2010).</li>
<li>Chowanska, J., Kotwicki, T., Rosadzinski, K., Sliwinski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((School+screening+for+scoliosis%3A+can+surface+topography+replace+examination+with+scoliometer%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Scoliosis%22%5BJournal%5D)">School screening for scoliosis: can surface topography replace examination with scoliometer?</a> Scoliosis. 7 (9), 1748-7161 (2012).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoliosis+imaging%3A+what+radiologists+should+know%5BTitle%5D)+AND+%22Radiographics%22%5BJournal%5D)">Scoliosis imaging: what radiologists should know.</a> Radiographics. 30 (7), 1823-1842 (2010).</li>
<li>Wong, H. K., Hui, J. H., Rajan, U., Chia, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+scoliosis+in+Singapore+schoolchildren%3A+a+prevalence+study+15+years+into+the+screening+program%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Idiopathic scoliosis in Singapore schoolchildren: a prevalence study 15 years into the screening program.</a> Spine. 30 (10), 1188-1196 (2005).</li>
<li>Nachemson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long+term+follow-up+study+of+non-treated+scoliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Scand%22%5BJournal%5D)">A long term follow-up study of non-treated scoliosis.</a> Acta Scand. 39 (4), 466-476 (1968).</li>
<li>Enneking, W. F., Harrington, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+changes+in+scoliosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Joint+Surg%22%5BJournal%5D)">Pathological changes in scoliosis.</a> J. Joint Surg. 51 (1), 165-184 (1969).</li>
<li>Miller, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cause+and+natural+history+of+adolescent+idiopathic+scoliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop.+Clin.+North+Am%22%5BJournal%5D)">Cause and natural history of adolescent idiopathic scoliosis.</a> Orthop. Clin. North Am. 30 (3), 343-3452 (1999).</li>
<li>Nash, C. L. Jr, Gregg, E. C., Brown, R. H., Pillai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risks+of+exposure+to+X-rays+in+patients+undergoing+long-term+treatment+for+scoliosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Am%22%5BJournal%5D)">Risks of exposure to X-rays in patients undergoing long-term treatment for scoliosis.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 61 (3), 371-400 (1979).</li>
<li>Akoume, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+screening+test+for+idiopathic+scoliosis+using+cellular+dielectric+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Cell-based screening test for idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy.</a> Spine. 35 (13), 601-608 (2010).</li>
<li>Verdonk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dielectric+spectroscopy%3A+a+label-free+comprehensive+platform+for+functional+evaluation+of+endogenous+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Cellular dielectric spectroscopy: a label-free comprehensive platform for functional evaluation of endogenous receptors.</a> Assay Drug Dev. Technol. 4 (5), 609-6019 (2006).</li>
<li>Peters, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cellular+dielectric+spectroscopy%2C+a+whole-cell%2C+label-free+technology+for+drug+discovery+on+Gi-coupled+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cellular dielectric spectroscopy, a whole-cell, label-free technology for drug discovery on Gi-coupled GPCRs.</a> J. Biomol. Screen. 12 (3), 312-319 (2007).</li>
<li>Peters, M. F., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cellular+impedance+assays+for+detection+of+GPCR+pleiotropic+signaling+and+functional+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Evaluating cellular impedance assays for detection of GPCR pleiotropic signaling and functional selectivity.</a> J. Biomol. Screen. 14 (3), 246-255 (2009).</li>
<li>Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+label-free+biosensors+for+pharmacological+screening+with+cell-based+functional+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8 (2), 219-227 (2010).</li>
<li>Akoume, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted+Gi-coupled+receptor+signaling+occurs+in+adolescent+idiopathic+scoliosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Disrupted Gi-coupled receptor signaling occurs in adolescent idiopathic scoliosis.</a> J. Clin. Invest. , Submitted (2013).</li>
</ol>

Diese Arbeit führte zu mehreren Patenten halten von Sainte-Justine University Hospital und viele andere sind in mehreren Ländern angemeldet. Fourth Dimension Spine LLC ist exklusiver Lizenznehmer von Sainte-Justine University Hospital.

Wir haben eine detaillierte Prozedur eines zellbasierten Prognosetest für idiopathische Skoliose, die für mononukleare periphere Blutzellen (PBMCs) wurden frisch isolierte oder konservierte für bis zu einem Jahr in flüssigem Stickstoff eingefroren beschrieben. Da mit frisch isolierten PBMCs ist umständlich beim Testen große Anzahl von Personen wurde das Verfahren mit gefrorenen PBMCs, die eine praktische Alternative in der klinischen Einstellung bieten vorgestellt. Doch Probleme mit Zellverklumpung nach dem Auftauen wurden die auftreten, wenn gefrorene PBMCs wurden ursprünglich verwendet, was manchmal zu Inter-Assay-Variabilität. Um Assay-Reproduzierbarkeit zu maximieren, empfehlen wir, die Vermeidung von Frost-Tau-Zyklus und mit der gefrorenen Probe nur einmal. Das Verfahren ist sehr einfach und ermöglicht eine genaue Erfassung von defekten Gi-Protein-Funktion in einer kurzen Zeit. Mit diesem Verfahren können asymptomatisch und skoliotischen Kinder leicht eingestuft werden, ihre klinischen Ergebnisse besser vorherzusagen, ohne Gefahr für ihre Gesundheit. HoWever, bei der Durchführung Einstufung nach dem Grad der maximalen Reaktion auf Gi-Stimulation im Vergleich zu den gesunden Kontrollpersonen 12, mehrere Anforderungen für die Kontrollpersonen sollten erfüllt werden. In der Tat, um einen angemessenen Vergleich Kohorte haben, die Kontrollpersonen müssen Alter und Geschlecht abgestimmt sein, nicht auf jede Art von Medikamenten zu sein, und bieten privaten Informationen wie Vergangenheit einzelne / familiäre Krankengeschichte. Diese Anforderungen können ein wichtiges Hindernis für die Einstellung von Kontrollpersonen darstellen. Daher Klassifikation durch Ausführen der Grad der Ungleichheit zwischen Ansprechen auf Gi und G-Protein-Stimulation bei demselben Individuum ist ideal, um die Notwendigkeit der Verwendung von Steuersubjekten zu beseitigen. Die Verwendung der CDS-basierten System, um dieses Prognosetest durchzuführen ist im Hinblick auf gleichzeitig eine Gi-und Gs-vermittelte Zellreaktionen im gleichen Assay signifikant. Obwohl viele Patienten ohne Uhr klassifiziert werdenbiguity mit der für diesen Test festDynamikBereich, eine kleine Anzahl von Patienten werden Werte an der Grenze der Bereiche zeigen, wie die Ergebnisse des vorliegenden Berichts dargestellt. Diese Personen zu unterscheiden, haben wir die Bewertung der Wirkung von OPN auf Gi Reaktion auf Stimulation durch den Nachweis, dass OPN induziert eine differentielle Wirkung auf Gi-vermittelte zelluläre Antwort auf die drei funktionellen Gruppen eingeführt. Tatsächlich haben wir festgestellt, dass in Gegenwart von OPN, Gi Antwort auf Erhöhungen der Stimulations FG1, FG2, während es in und FG3 abnimmt, in einem höheren Ausmaß in FG2. Trotz der hohen Kosten von OPN ist die Verwendung dieses Chemokin wichtig, eindeutigen Fällen zu unterscheiden, und somit die Genauigkeit der Klassifizierung Assay. Hat dieser Test jedoch den Nachteil, daß ein Minimum von 1,5 × 10 5 Zellen pro Vertiefung erforderlich ist, um die zelluläre Antwort mit der CDS-basierten System unter unseren experimentellen Bedingungen beobachtet. Bestimmte Patientenproben nicht eine ausreichende Anzahl von habenZellen getestet werden. In diesem Fall ist es notwendig, die Patienten für weitere Blutentnahme, die für die Medizin-und Laborpersonal besorgniserregend für Familien und frustrierend sein kann zu erinnern. Prospektive Studien werden in unserem Labor geplant, um dieses Problem anzugehen. Dennoch setzt das aktuelle Protokoll auf einfache und bewährte Methoden, um Zellen herzustellen, während der Tests mit einem validierten markierungsfreie System 13, 14, um Antworten der Zellen zu überwachen automatisiert. Die Testplattform ist relativ preiswert, wenn sie mit genetischen Plattform für die Prognose von anderen Krankheiten verfügbar verglichen. Auch die Kosten für alle Einwegmaterialien, einschließlich der Blutsammelröhrchen, Tipps, die besondere Elektroden Mikrotiterplatten, sowie konische und Eppendorf-Röhrchen, nicht sehr teuer ist und bei weniger als 3.000 $ geschätzt, um eine Prüfung auf etwa tausend Patienten abzuschließen. Obwohl diese Schätzung nicht enthalten vor allem Kosten für die Vorbereitung von Probenund die Durchführung der Prüfung, bleibt dieser Test deutlich günstiger als Next-Generation-Sequencing-Plattformen. Bemerkenswert ist nicht nur die Kosten gegenüber genetischen Plattformen, aber insbesondere auf dem Gebiet der AIS verwandt ist, ist die Kosten für radiologische Bildgebung verbunden. Heute sind mehr als eine Million Kinder in den USA etwa 100.000 Kinder in Kanada mit idiopathischen Skoliose diagnostiziert, und die Gesamtkosten der Diagnose und Überwachung von Kindern, die von der Skolioseröntgenaufnahme als 2,5 Milliarden Dollar pro Jahr in Nordamerika. Somit wäre zu erwarten zellbasierten Assay-Verfahren für Routineuntersuchungen und Überwachung von Kindern mit idiopathischen Skoliose ohne Gesundheitsrisiko und kostengünstiger zu sein.

Idiopathische Skoliose ist eine Fehlstellung der Wirbelsäule unbekannter Ursache in der Regel als eine seitliche Krümmung größer als 10 Grad begleitet von einer Wirbelrotation 1 definiert. Die Krankheit betrifft 4% der pädiatrischen Population und wird am häufigsten im Alter zwischen 9 und 13 Jahren zwischen 2,3,4 diagnostiziert. Die Diagnose ist in erster Linie der Ausgrenzung und erst nach Ausschluss anderer Ursachen von Wirbelsäulenverformung, wie etwa Wirbelfehlbildung, neuromuskuläre Erkrankungen oder syndromale gemacht. Traditionell wird die trunkal Asymmetrie von Adams Vorbeugen Test ergab, und mit Skoliometer während der körperlichen Prüfung 5 gemessen. Die Diagnose kann dann durch radiologische Beobachtung der Kurve und der Winkelmessung unter Verwendung des Cobb-Methode 6 bestätigt werden. Einmal diagnostiziert, ist das Hauptanliegen für Ärzte in der Verwaltung skoliotischen Kinder, ob die Kurve weiter voran. Tatsächlich ist der Kurvenverlauf oft unvorhersehbar undist häufiger bei Mädchen als bei Jungen beobachtet, 7. Wenn unbehandelt, kann die Kurve dramatisch fortschreiten, wodurch erhebliche körperliche Missbildung und sogar Herz-Lungen-Probleme. Diese Manifestationen lebensbedrohlich werden, wenn die Kurve 70 ° 8,9 übersteigt. Die aktuellen Behandlungsmöglichkeiten zu verhindern oder zu stoppen Kurvenverlauf sind Verstrebungen und Chirurgie. In der Regel ist für die Reizkurven zwischen 25-40 ° empfohlen, während der Operation ist für Kurven größer als 45 ° oder reagieren nicht auf Verstrebungen vorbehalten. Ungefähr 10% der Kinder mit idiopathischer Skoliose diagnostiziert Kurvenverlauf erfordern korrigierende Eingriffe 10. Derzeit gibt es keine bewährte Methode oder Test zur Verfügung, um diese Kategorie von Patienten zu identifizieren. Dementsprechend werden alle Kinder diagnostiziert, mehrere Röntgenaufnahmen über mehrere Jahre unterzogen, in der Regel, bis sie Skelettreife zu erreichen. Es wird geschätzt, dass die typischen Patienten mit Skoliose wirdetwa 22 radiologischen Untersuchungen über einen Zeitraum von 3 Jahren 11. Wegen der möglichen Gefahr der Mehrfachröntgenuntersuchungen, die alternative Ansätze, durch die Durchführung der Prognose der idiopathischen Skoliose ohne dass Kinder auf ionisierende Strahlung sind stark erwünscht. Mit der Absicht, diesen Bedarf haben wir vorher eine zellbasierte Screening-Test entwickelt als prognostischer Test, um die asymptomatischen Kindern früher erkennen die Gefahr der Entwicklung idiopathischen Skoliose. Der Test sagt die klinischen Ergebnisse in beiden betroffenen Kinder asymptomatisch und durch Untersuchung der Funktionszustand der Gi-Proteine ​​und Klassifizieren von Kindern in drei Funktionsgruppen (FG1, FG2 und FG3) entsprechend dem Grad der maximalen Reaktion auf Stimulation 12 Gi-Protein, wie durch CDS gemessen -basierten System. Dieses System wird weitgehend verwendet, um die Signaltransduktion durch G-Proteine ​​in verschiedenen Zelltypen 13,14,15,16 beurteilen. Es liefert Informationen über dieGesamt integriert Reaktion der Zellen auf die Außenreize durch Messen von Änderungen in der Impedanz nach der Aktivierung von Zelloberflächenrezeptoren. Zellen werden in Mikrotiterplatten ausgesät, die Elektroden enthalten, am Boden der Vertiefungen und das System legt eine kleine Spannung, die extrazelluläre und trans Ströme induzieren. Nach Injektion der Verbindung in den Brunnen, sind Zelloberflächenrezeptoren stimuliert und Signaltransduktion Ereignisse eintreten, die zu zellulären Veränderungen, die den Fluss von extrazellulären und transzellulären Ströme beeinflussen und damit die gemessene Größe beeinflussen. Mit diesem Ansatz werden die Skoliosepatienten und Kinder ein höheres Risiko der Entwicklung von Skoliose sind weniger auf Gi-Protein Stimulation, wenn sie mit gesunden Kontrollpersonen verglichen und die Einstufung auf dem Prozentsatz der Reduktionsgrad relativ zur Kontrollgruppe basiert. Die Klassifizierungsbereiche sind zwischen 10 und 40% für FG3, 40 und 60% für FG2, und 60 und 90% für FG1 12 befestigt. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; In jüngerer Zeit haben wir diesen Ansatz zeigt, dass die drei funktionellen Gruppen eindeutig entsprechend dem Profil des Ungleichgewichts zwischen Abhängigkeit und Gi Gs Stimulation unterschieden werden modifiziert. Tatsächlich fanden wir, dass als Reaktion auf Stimulation Gi überwog in FG3, während keine offensichtliche Ungleichgewicht in FG2 beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten FG1 Vorherrschaft für die Reaktion auf Gs Stimulation. Darüber hinaus haben wir den Beweis, dass die Patienten FG2 gehören, sind mehr an der Gefahr der fortschreit bis zur Operation benötigen 17 vorgesehen. Die Präzision dieser Einstufungstest weiter durch den Nachweis einer Differenz Wirkung von Osteopontin (OPN) auf Gi Reaktion auf Stimulation unter funktionellen Gruppen verbessert. Hier dokumentieren wir die einzelnen Schritte der experimentellen und analytischen Verfahren dieser Funktionsprüfung, wie sie derzeit in unserem Labor durchgeführt.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Wisent, Inc</td><td>350-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Therno Scientific Hyclone</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17144003</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Phytohämagglutinin</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>10576-015</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes Osteopontin</td><td>R& D Systems, Inc</td><td>1433-OP/CF</td><td></td></tr><tr><td>Somatostatin</td><td>Tocris</td><td>1157</td><td></td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>Tocris</td><td>1743</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent, Inc</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pipettenspitzen</td><td>Axygen Scientific</td><td>301-06-451</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Eppendorf-Röhrchen</td><td>Ultident</td><td>24-MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konisch Röhrchen</td><td>VWR International</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Cellkey kleine Probe 96W Mikroplatte</td><td>Molekulare Geräte</td><td>1026496</td><td></td></tr><tr><td>Cellkey Spitzen</td><td>Cybio</td><td>OL3800-25-559N</td><td></td></tr><tr><td>Vorgestanzte durchstechbare Dichtungen</td><td>Excel Scientific, Inc</td><td>XP-100<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Vicell XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>731050</td><td>Automatisierter Zellzähler</td></tr><tr><td>Zellkulturhaube</td><td>Forma Scientific</td><td>1284</td><td>Klasse II</td></tr><tr><td>Lagerung von flüssigem Stickstoff</td><td>Thermo Scientific</td><td>CY5093570</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>VWR International</td><td>89032-204</td><td></td></tr><tr><td>Standardlichtmikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMIL LED</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>51019557</td><td>5% CO2 bei 37 &Grad; C</td></tr><tr><td>Zentrifuge mit niedriger Drehzahl</td><td>Thermo</td><td>Scientific 75004364</td><td></td></tr><tr><td>Cellkey-System</td><td>Molekulare Bauelemente</td><td>1019185</td><td>CDS-basiertes Instrument</td></tr></tbody></table>

zellbasierte assay-protokoll für die prognostische prognose der idiopathischen skoliose mit cellular dielektrischer spektroskopie

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

Dieses Protokoll beschreibt die experimentelle und analytische Verfahren für einen Assay auf Zellbasis in unserem Labor als Funktionstest zur Vorhersage der idiopathischen Skoliose bei asymptomatischen betroffenen Kinder und vorauszusagen. Der Test besteht aus der Bewertung der Funktionszustand und Gi Gs-Proteine ​​in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs), die durch Mobil dielektrischen Spektroskopie (CD), unter Verwendung eines automatisierten CDS-basierten Instrument und die Klassifizierung von Kindern in drei Funktionsgruppen (FG1 , FG2, FG3) in Bezug auf das Profil des Ungleichgewichts zwischen dem Grad der Reaktion auf und Gi Gs-Proteine ​​Stimulation. Die Klassifizierung wird durch die unterschiedliche Wirkung von Osteopontin (OPN) auf Reaktion auf Stimulation Gi zwischen Gruppen und die starke Progression der Krankheit wird durch FG2 verwiesen bestätigt. Ungefähr wird ein Volumen von 10 ml Blut benötigt, um PBMCs durch Ficoll-Gradienten und Zellen extrahiert werden dann in flüssigem Stickstoff gelagert. Die ausreichende Anzahl von PBMC zur Durchführung des Assays nach zwei Tagen Zellkultur erhalten. Im Wesentlichen werden die Zellen zunächst mit phytohemmaglutinin (PHA) inkubiert. Nach 24 h Inkubation wird das Medium durch eine PHA-freien Kulturmedium für zusätzliche 24 Stunden vor der Zellaussaat und OPN-Behandlung ersetzt. Zellen werden dann spektroskopisch ihre Reaktionen auf Somatostatin und Isoproterenol, die jeweils zu aktivieren und Gi Gs-Proteine ​​durch ihre verwandten Rezeptoren gescreent. Sowohl Somatostatin und Isoproterenol gleichzeitig mit integrierter Fluidik-System injiziert und die Reaktionen der Zellen werden für 15 min überwacht. Der Assay kann mit frischem oder gefrorenem PBMCs durchgeführt werden und das Verfahren wird in 4 Tagen abgeschlossen.

Lebensfähigkeit der Zellen war bei allen Proben mit Werten konsistent in dem Bereich von 86 und 96% vergleichbar. Im Gegensatz dazu wurden große Schwankungen bei den Zellzahlen unter den Proben (Tabelle 3) beobachtet. Von den 32 Proben, zwei hatten unzureichende Anzahl von Zellen und nicht klassifiziert. Ein Beispiel der Ergebnisse der Funktionsklasse nach dem Grad des Ungleichgewichts zwischen Gs und Gi-Signalisierung ist in Fig. 3 gezeigt. Die vertikale Achse dieser Figur ist in drei Abschnitte Abgrenzung der funktionellen Gruppen mit dynamischen Bereiche als&gt; +10 FG3 fest zwischen +10 und -10 für FG2 &lt;-10 für FG1 unterteilt, und schließlich. Unter 30 Patienten hier getestet wurden 14, 6, und 5 Patienten deutlich in FG3 klassifiziert, FG2, FG1 und jeweils während fünf Patienten, insbesondere 345, 353, 370, 371 und 382 wurden bei der Grenzbereiche. Die Bewertung der Auswirkungen auf die OPN Reaktion auf Stimulation Gi hatte ergeben, dass OPN erhöht die Antwort in pa353 und 371 Patienten. Im Gegensatz dazu war die Antwort von mehr als 50% der Patienten 345 und 382 und von weniger als 50% der Patienten 370 folgenden rOPN Behandlung reduziert. Also, nach unseren Einstufungskriterien (Tabelle 2), waren wir in der Lage, Patienten, 353 und 371 in FG1 kategorisieren, 345 und 382 Patienten in FG2 und Patienten 370 in FG3. Parallel dazu wurden alle Patienten für ihre Reaktion auf Gi-Protein Stimulation gezeigt und im Vergleich zu Kontrollpersonen. Wie erwartet, waren alle Patienten weniger auf als Kontrollpersonen und Patienten in der gleichen funktionellen Gruppe durch unser neues Verfahren klassifiziert zeigten ähnliche Niveaus der maximalen Reaktion (Abbildung 5). Darüber hinaus Unterschiede zwischen den Patienten der einzelnen funktionellen Gruppe war im Einklang mit unseren klassischen Bereich der Klassifikation 12, Validierung unserer neuen Verfahren. Die Klassifizierung einer großen Kohorte von Patienten skoliotischen regelmäßig in unserem Spezialklinik in Sainte-Justine-Krankenhaus verfolgt hat, ergab, dass die dreifunktionellen Gruppen wurden in ähnlicher Weise bei den mittelschweren Fällen verteilt, während der FG2 vorherrschend war unter schweren Fällen (Abbildung 6), Identifizierung von Patienten in diese funktionelle Gruppe kategorisiert wie ein höheres Risiko für schwere Fortschreiten der Krankheit und darauf hinweist, dass diese Klassifizierung Test sinnvoll sein, in der Prognose der idiopathischen Skoliose. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="5"> Lösung A </td><td> Wasserfreie D-Glucose </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 0,05 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 0,98 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5,4 mM </td></tr><tr><td> Tris </td><td> 145 mM </td></tr><tr><td> Lösung B </td><td> NaCl </td><td> 140 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> Balanced Salt Solution (BSS) </td><td> Lösung A </td><td> 1 Volumen </td></tr><tr><td> Lösung B </td><td> 9 Volumen </td></tr><tr><tdrowspan = &quot;3&quot;&gt; Komplette Medien </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika-Antimykotikum </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td rowspan="3"> Ergänzende Medien </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika-Antimykotikum </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td rowspan="4"> Einfrieren Medien </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika-Antimykotikum </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 20% </td></tr><tr><td rowspan="4"> PHA Medien </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika-Antimykotikum </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Phytohämaglutinin </td><td> 1% </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. WesentlicheLösungen. <table border="1"><tbody><tr><td> Dynamische Bereiche mit &amp;Dgr; G </td><td> Funktionelle Gruppen </td><td> Dynamische Bereiche mit Fe </td></tr><tr><td> &amp;Dgr; G &lt;-10 </td><td> FG1 </td><td> Fe&gt; 100% </td></tr><tr><td> -10 &lt;&amp;Dgr; G &lt;10 </td><td> FG2 </td><td> Fe &lt;50% </td></tr><tr><td> &amp;Dgr; G&gt; 10 </td><td> FG3 </td><td> 50% &lt;Fe &lt;95% </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Kategorisierung von funktionellen Gruppen nach mit &amp;Dgr; G und Fe etablierten dynamischen Bereichen. <table border="1"><tbody><tr><td> Patienten </td><td> Die Lebensfähigkeit (%) </td><td> Zellkonzentration (× 10 6 / ml) </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 343 </td><td> 88,7 </td><td> 11,64 </td><td></td></tr><tr><td> 344 </td><td> 90,5</td><td> 13,6 </td><td></td></tr><tr><td> 345 </td><td> 94,4 </td><td> 8,54 </td><td></td></tr><tr><td> 346 </td><td> 94,3 </td><td> 25.79 </td><td></td></tr><tr><td> 347 </td><td> 94,2 </td><td> 27.36 </td><td></td></tr><tr><td> 348 </td><td> 94,6 </td><td> 8,52 </td><td></td></tr><tr><td> 349 </td><td> 91,2 </td><td> 0,82 </td><td> Unzureichende Anzahl von Zellen </td></tr><tr><td> 350 </td><td> 90,3 </td><td> 8,92 </td><td></td></tr><tr><td> 352 </td><td> 92,6 </td><td> 8,28 </td><td></td></tr><tr><td> 353 </td><td> 91,3 </td><td> 12.75 </td><td></td></tr><tr><td> 354 </td><td> 86,9 </td><td> 7,62 </td><td></td></tr><tr><td> 355 </td><td> 91,2 </td><td> 7,51 </td><td></td></tr><tr><td> 356 </td><td> 90,3 </td><td> 9,36 </td><td></td></tr><tr><td> 358 </td><td> 95,1 </td><td> 16.94 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> 359 </td><td> 92,3 </td><td> 13.89 </td><td></td></tr><tr><td> 360 </td><td> 89,4 </td><td> 7,67 </td><td></td></tr><tr><td> 361 </td><td> 93,5 </td><td> 7,84 </td><td></td></tr><tr><td> 365 </td><td> 86,5 </td><td> 2.2 </td><td> Unzureichende Anzahl von Zellen </td></tr><tr><td> 368 </td><td> 92,6 </td><td> 15.69 </td><td></td></tr><tr><td> 369 </td><td> 93,4 </td><td> 10,9 </td><td></td></tr><tr><td> 370 </td><td> 92,5 </td><td> 19.93 </td><td></td></tr><tr><td> 371 </td><td> 88,8 </td><td> 10.68 </td><td></td></tr><tr><td> 374 </td><td> 93,9 </td><td> 16.86 </td><td></td></tr><tr><td> 376 </td><td> 92,9 </td><td> 15,67 </td><td></td></tr><tr><td> 377 </td><td> 93,1 </td><td> 9,99 </td><td></td></tr><tr><td> 378 </td><td> 93,6 </td><td> 13.57 </td><td></td></tr><tr><td> 379 &lt;/ Td&gt; <td> 92,6 </td><td> 19,86 </td><td></td></tr><tr><td> 380 </td><td> 91,1 </td><td> 8,46 </td><td></td></tr><tr><td> 381 </td><td> 93,9 </td><td> 14,82 </td><td></td></tr><tr><td> 382 </td><td> 92,1 </td><td> 23.06 </td><td></td></tr><tr><td> 383 </td><td> 92,9 </td><td> 11.82 </td><td></td></tr><tr><td> 384 </td><td> 89,1 </td><td> 7,73 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Prozent Lebensfähigkeit und Zellkonzentration als mit einem automatisierten Zellzähler und Lebensfähigkeit Analysator bestimmt. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig1.jpg" /> Abbildung 1. Entwurf für Zellaussaat. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig2.jpg" /> 2.Entwerfen Sie für die Abgabe Verbindungen. <img alt="Fig. 3" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig3.jpg" /> Abbildung 3. Dynamischer Bereich der funktionellen Klassifikation mit der CDS-basierten System. Graph zeigt Werte für den Grad des Ungleichgewichts zwischen Reaktionen auf Gs und Gi Stimulation in PBMCs von Patienten mit idiopathischer Skoliose erhalten. -Werte wurden durch die CDS-basiertes System in Antwort auf 10 uM Somatostatin und Isoproterenol gemessen. Jeder Punkt stellt den &amp;Dgr; G der beiden Reaktionen in zweifacher Ausfertigung. <img alt="Fig. 4" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig4.jpg" /> Abbildung 4. Wirkung von rOPN auf Antwort auf Gi Stimulation in PBMCs. 18 h wurden die Zellen unter Serummangel in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,5 ug / ml rOPN und dann mit 10 angeregt<html> 56, M von Somatostatin-Gi-vermittelte zelluläre Antwort auslösen. Daten im Diagramm wurden vom Maximum-Minimum-Impedanz erzeugt und entsprechen dem Mittelwert der Reaktion im Duplikat. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig5.jpg" /> Abbildung 5. Funktionszustand von Gi-Protein in PBMCs von Kontrolle und scoliostic Themen. PBMCs von Probanden und Patienten wurden skoliotischen steigenden Konzentrationen von Somatostatin an Gi-Proteine ​​über endogene Somatostatin-Rezeptor stimulieren ausgesetzt. Die zelluläre Reaktion wurde durch CDS-basiertes System, wie in dem Abschnitt Verfahren beschrieben, gemessen. Kurven wurden von Maximum-Minimum-Impedanz erzeugt. Jede Kurve stellt die nichtlineare Regression. Daten wurden auf maximale Antwort in Zellen aus der Kontrollgruppe normalisiert und jeder Punkt entspricht dem Mittelwert der Reaktion im Duplikat./ 50768/50768fig5large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen. <img alt="Fig. 6" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig6.jpg" /> 6. Verteilung funktioneller Gruppen unter den verschiedenen Phasen der Skoliose. Eine große Kohorte von 794 Patienten mit Skoliose moderat (Krümmungen zwischen 10-44 ° C) und 162 schwere (Krümmung größer als 45 °) Fällen regelmäßig in Sainte-Justine-Krankenhaus folgte, wurden nach dem Grad des Ungleichgewichts zwischen Reaktion auf Gi und Gs klassifiziert Stimulation. Reaktionen wurden durch die CDS-basiertes System in Antwort auf 10 uM Somatostatin und Isoproterenol gemessen.

Eine strukturierte Protokoll für ein Assay auf Zellbasis als Funktionstest zur Vorhersage der idiopathischen Skoliose vorher mit Mobil dielektrischen Spektroskopie (CDS) dargestellt. Der Assay kann mit frischem oder gefrorenem peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) durchgeführt werden und das Verfahren wird in 4 Tagen abgeschlossen.

Zellbasierte Assay-Protokoll für die prognostische Prognose der idiopathischen Skoliose Mit Cellular dielektrischer Spektroskopie

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Prognose einer idiopathischen Skoliose anhand der funktionellen Einteilung von Patienten vorherzusagen, indem die Reaktion der PBMCs auf die Aktivierung von GPCRs mittels zellulärer dielektrischer Spektroskopie untersucht wird. Dies wird erreicht, indem PBMCs in Gegenwart von Phytohämaggglutinin oder PHA kultiviert werden, um die Zellzahl zu erhöhen. Die Zellvermehrung erfolgt in einem Rohr, das in geneigter Position gehalten wird.Als zweiten Schritt werden die Zellen mit OSTEOPONTIN oder OPN behandelt, wodurch die GI-Proteinaktivität erhöht oder verringert wird. Abhängig von den Patienten nach der Behandlung wird die Zellsuspension in die Mikrotiterplatte überführt. Anschließend werden die Zellen mit GI- oder GS-GPCR-Agonisten stimuliert, um die resultierenden Impedanzänderungen zu bestimmen.Die Ergebnisse liefern kinetische Antworten für alle Vertiefungen, und integrierte Antworten werden anschließend anhand von Impedanzänderungen quantifiziert. Die Bedeutung dieser Technik geht weit über eine reine Diagnose hinaus. So können wir erstmals asymptomatische Patienten, die gefährdet sind, eine Skoliose zu entwickeln, in einem frühen Stadium erkennen. Da wir nun wissen, bei wem eine Skoliose auftreten wird und in welchem Stadium sie sich befinden, können wir neue Therapien zur Behandlung anbieten.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der Röntgenbestrahlung besteht darin, dass mit ihr eine progno Osteopathie Skoliose vorhergesagt werden kann, ohne dass eine Messung von covid erforderlich ist und ohne gesundheitliche Risiken. Als Neuestes wird die Technik nun von unserer wissenschaftlichen Mitarbeiterin Nita Franco durchgeführt, Auftauen einer gefrorenen Aliquotte peripherer mononukleärer Blutzellen in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Unter Verwendung einer sterilen Pipette die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Gefäß überführen, das 15 Milliliter komplettes Medium enthält, und zentrifugieren.Die Zellen aspirieren das Überstand. Anschließend das Zellpellet vorsichtig in einem Milliliter PHA-Medium suspendieren, das Volumen mit dem gleichen Medium auf 20 Milliliter auffüllen und den Tuben verschließen, wobei der Verschluss locker sein sollte, um Luftzutritt zu ermöglichen. Den Tuben über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator inkubieren, damit ruhende Lymphozyten sich in schnell proliferierende Lymphoblasten umwandeln können.Schließen Sie die Verschlüsse vollständig und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen. Suspendieren Sie das Zellenpellet vorsichtig in einem Milliliter komplettem Medium.Füllen Sie das Volumen mit dem gleichen Medium auf 20 Milliliter auf und verschließen Sie das Röhrchen locker, um die Zellen über Nacht kultivieren zu lassen und die Zellzahl zu erhöhen. Nach zwei Waschschritten mit jeweils 10 Milliliter RPMI 1640 resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 600 Mikroliter RPMI 1640. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und -viabilität mithilfe eines automatisierten Zellzählgeräts und eines Viabilitätsanalysators.Anschießend eine geeignete Menge RPMI 1640 hinzufügen, um eine Zellkonzentration von 1,5 × 10⁵ Zellen pro 20 µL einzustellen. 100 µL der Suspension in zwei sterile 1,5-mL-Eppendorf-Röhrchen überführen. In einem Röhrchen rekombinantes Osteopontin bis zu einer Endkonzentration von 0,5 µg/mL hinzufügen.Geben Sie ein gleiches Volumen PBS zu dem zweiten Reagenzglas hinzu. Mischen Sie jede Bedingung vorsichtig durch zweimaliges Pipettieren mit einer sterilen Pipette, die auf 100 Mikroliter eingestellt ist. Fügen Sie anschließend fünf Mikroliter RPMI 1640 in jedes Loch einer 96-Loch-Platte hinzu, zentrifugieren Sie die Platte bei 200 ×g für drei Minuten, um Luftblasen zu entfernen, und übertragen Sie die Zellen vom Reagenzglas in die Mikroplatte.Pipettieren Sie vorsichtig ein Mal auf und ab, um eine gleichmäßige Zellsuspension sicherzustellen. Säen Sie 40 Mikroliter Zellsuspension pro Vertiefung in vierfacher Duplikat für unbehandelte Zellen und in doppelter Ausführung für ROPN- oder PBS-behandelte Zellen aus. Lassen Sie die Zellplatte fünf Minuten lang unter dem sterilen Haube stehen, damit sich die Zellen erholen und sich gleichmäßig auf den Boden der Vertiefung absetzen können.Um die Wirkung der OPN-Kultur zu optimieren, inkubieren Sie die Zellen 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator und stellen die Kulturen anschließend etwa 30 Minuten lang auf Raumtemperatur ein. Bereiten Sie in der Zwischenzeit ein Milliliter 100 Mikromolar Somatostatin und Isoproterenol in RPMI 1640 vor. Füllen Sie die Verbindungsschale, indem Sie 20 Mikroliter in die entsprechenden Vertiefungen abgeben.Decken Sie die Verbindungsschale mit einem aushärtbaren Siegel ab. Laden Sie die Pipettenspitzen und die Verbindungsschale in das CDS-basierte System ein. Benennen Sie die Schale in der Software des CDS-basierten Geräts.Wechseln Sie zur Protokollliste und wählen Sie das geeignete Protokoll aus, um es zu starten. Klicken Sie auf „Start“. Das integrierte Fluidiksystem gibt die Verbindungen gleichzeitig in alle Vertiefungen ab.Das auf CDS basierende System sammelt automatisch Daten für 15 Minuten nach der Zugabe der Verbindung; die Zellviabilität war zwischen allen Proben vergleichbar, mit Werten im Bereich von 86 bis 96 %. Im Gegensatz dazu wurden starke Schwankungen bei der Zellanzahl festgestellt. Unter den 32 verwendeten Proben wiesen zwei eine unzureichende Anzahl an Zellen auf und wurden daher nicht klassifiziert. Dieses Beispiel zeigt die funktionelle Klassifizierung entsprechend dem Ausmaß der Diskrepanz zwischen GI- und GI-Signalgebung.Die Bewertung des OPN-Effekts als Reaktion auf die GI-Stimulation zeigte, dass OPN die Reaktion bei den Patienten 353 und 371 erhöhte. Im Gegensatz dazu wurde die Reaktion bei den Patienten 345 und 382 um mehr als 50 % und beim Patienten 370 um weniger als 50 % nach ROPN-Behandlung verringert. Entsprechend unseren Klassifizierungskriterien konnten wir die Patienten 353 und 371 der FG eins, die Patienten 345 und 382 der FG zwei sowie den Patienten 370 der FG drei zuordnen.Gleichzeitig wurden alle Patienten auf ihre Reaktion auf die Stimulation mit GI-Proteinen untersucht und mit Kontrollpersonen verglichen. Wie erwartet zeigten alle Patienten eine geringere Reaktionsfähigkeit als die Kontrollpersonen. Patienten, die derselben Funktionsgruppe zugeordnet wurden, wiesen ähnliche Werte der maximalen Reaktion auf.Die Klassifizierung einer großen Kohorte von SC-Patienten, die regelmäßig in unserer Spezialambulanz am San-Justine-Krankenhaus betreut werden, hat gezeigt, dass die drei funktionellen Gruppen gleichmäßig verteilt waren. Bei moderaten Fällen war die FG zwei vorherrschend, bei schweren Fällen hingegen dominierte sie. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Patienten mithilfe der zellulären dielektrischen Spektroskopie in zwei bzw. drei funktionelle Gruppen einteilt.

cell-based-assay-protocol-for-prognostic-prediction-idiopathic

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Die ECIS / Taxis-System ist ein automatisiertes Echtzeit-Assay misst die zelluläre Chemotaxis. In diesem Assay verschieben Zellen unter einer Schicht aus Agarose auf ein Ziel Elektrode ankommt. Zelluläre Bewegung wird durch das Einsetzen des Widerstands in Wechselstrom 0 gemessen.

Messung zellulärer Chemotaxis mit ECIS / Taxis

Dieses Video beschreibt die Messung der Kontraktion der Aorten-Glattmuskelzellen (SMC) mit Hilfe der elektrischen Zell-Substrat-Impedanzmessung (ECIS). ECIS misst die Fortbewegung von Zellen und ist eine zuverlässige Methode zur Messung von Kontraktionen.

Messung der SMC-Kontraktion in vitro: Eine nicht-invasive Methode zur Bewertung der Kontraktion von glatten Muskelzellen mit Hilfe der elektrischen Zell-Substrat-Impedanzmessung

Dieses Protokoll Bewertungen Elektro Zell-Substrat-Impedance Sensing, eine Methode zur Quantifizierung der Zellhaftung, Proliferation, Motilität und zellulären Antworten auf pharmakologische und toxische Stimuli erfassen und analysieren die Impedanzspektrum von adhärenten Zellen. Nachweis endothelialer Permeabilität und Bewertung der Zell-Zell-und Zell-Substrat-Kontakte sind hervorgehoben.

Elektro-Zell-Substrat-Impedance Sensing zur Quantifizierung der endothelialen Proliferation, Barrierefunktion und Beweglichkeit

Hier präsentieren wir Sauerstoffgradientenektacytometrie, eine schnelle und reproduzierbare Methode zur Messung der Deformierbarkeit roter Blutkörperchen in Proben von Patienten mit Sichelzellerkrankungen unter kontrollierter Deoxygenierung und Reoxygenierung. Diese Technik bietet eine Möglichkeit, rote Blutkörperchen Sichel zu studieren und Dieelzell-Krankheit Behandlung Wirksamkeit zu überwachen.

Charakterisierung des Sicklings bei kontrollierter automatisierter Deoxygenierung mit Sauerstoffgradientektacytometrie

Hier beschreiben wir die optische Erfassung und Charakterisierung von Aktionspotentialen aus induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten mit einem modularen Hochgeschwindigkeits-Photometriesystem.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Dieser Artikel stellt eine Strategie zum Erstellen von Finite-Elemente-Modellen von faserigen leitfähigen Materialien vor, die einem elektrischen Feld (EF) ausgesetzt sind. Die Modelle können verwendet werden, um den elektrischen Input abzuschätzen, den Zellen, die in solchen Materialien ausgesät sind, erhalten, und die Auswirkungen der Änderung der Materialeigenschaften, der Struktur oder der Ausrichtung des Gerüsts zu bewerten.

Finite-Elemente-Modellierung einer zellulären elektrischen Mikroumgebung

Die Analyse von Veränderungen der kontraktilen Funktion und der zellulären Integrität von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten ist von immenser Bedeutung für die nicht-klinische Arzneimittelentwicklung. Ein hybrides 96-Well-Zellanalysesystem adressiert beide Parameter in Echtzeit und physiologisch für zuverlässige, für den Menschen relevante Ergebnisse, die für einen sicheren Übergang in klinische Stadien erforderlich sind.

Hybridzell-Analysesystem zur Beurteilung struktureller und kontraktiler Veränderungen von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten für die präklinische kardiale Risikobewertung

Dieses Protokoll beschreibt die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften von krebsartigen und nicht-krebsartigen Zelllinien in vitro. Konservierte Unterschiede in der Mechanik von Krebszellen und normalen Zellen können als Biomarker dienen, der Auswirkungen auf die Prognose und Diagnose haben kann.

Scherprobenprotokoll zur Bestimmung von Einzelzell-Materialeigenschaften

Hier wird ein Protokoll für mechanische Ermüdungstests bei menschlichen roten Blutkörperchen unter Verwendung eines amplitudenmodulierten Elektrodeformationsansatzes vorgestellt. Dieser allgemeine Ansatz kann verwendet werden, um die systematischen Veränderungen der morphologischen und biomechanischen Eigenschaften biologischer Zellen in einer Suspension aus zyklischer Verformung zu messen.

Amplitudenmodulierte Elektrodeformation zur Bewertung der mechanischen Ermüdung biologischer Zellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Bewertung ultraschallunterstützter Skoliose-spezifischer Bewegung bei Jugendlichen mit leichter idiopathischer Skoliose, wobei die Teilnehmer zufällig einem Trainingsprogramm zugeteilt werden, das dreimal pro Woche über drei Monate durchgeführt wird, gefolgt von einer dreimonatigen Beobachtungsphase, die Echtzeit-Rückmeldung zur Aktivierung des Interrippenmuskels und zur Atemkontrolle liefert.

Klinische Wirksamkeit ultraschallunterstützter Skoliose-spezifischer Bewegung bei milder adopathischer Skoliose

Erfahren Sie die zellbasierte Assay-Methode mit zellularer dielektrischer Spektroskopie zur Vorhersage der Prognose idiopathischer Skoliose. Diese Technik ermöglicht die funktionelle Klassifizierung von Patienten ohne Röntgenstrahlenbelastung.

Zellbasierte Assay-Protokoll für die prognostische Prognose der idiopathischen Skoliose Mit Cellular dielektrischer Spektroskopie (Video) | JoVE Journal

Zellbasierte Assay-Protokoll für die prognostische Prognose der idiopathischen Skoliose Mit Cellular dielektrischer Spektroskopie

Weitere Videos entdecken