Hitzeinduzierte Antigengewinnung: Eine effektive Methode zum Nachweis und zur Identifizierung von Vorläuferzelltypen während der adulten Hippocampus-Neurogenese

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Antigen-Retrieval an hippokampalem Hirngewebe durchzuführen, um die Vorläuferzelltypen, aus denen neugeborene Neuronen hervorgehen, besser sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst das perfundierte Gehirn von Mäusen entnommen wird, die dünne koronale Schnitte schneiden, und diese Schnitte auf einen Glasobjektträger montiert werden, der speziell so konzipiert ist, dass er stark am Gewebe haftet. Der zweite Schritt besteht darin, die Objektträger mit Gewebe und Kay atopischer Behandlung zu kochen und ausreichend Zeit zum Abkühlen zu lassen.

Anschließend färben Sie das Gewebe über Nacht mit Primärantikörpern. Der letzte Schritt besteht darin, am nächsten Tag für mindestens zwei Stunden eine sekundäre Antikörperfärbung auf dem Gewebe durchzuführen. Letztendlich visualisieren Sie die verschiedenen Pro-Gender-Zelltypen über die verschiedenen Entwicklungsstadien während der adulten Neurogenese des Hippocampusgewebes mit Zeitraffer oder konfokaler Mikroskopie.

Hallo, mein Name ist Hun Jo, Postdoc, Mitglied des Labors von Dr. Ian John und der Mayo Clinic. Unser Hauptaugenmerk im John Lab liegt auf der Erforschung des Prozesses der anderen Neurogenese bei neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen. Unser Endziel ist es, dieses Wissen erfolgreich in die therapeutische Anwendung umzusetzen, indem wir zeigen, dass unser Verfahren des Antigen-Retrievers Quam Hui und Hallo John aus unserem Labor sein wird.

Der Hauptvorteil unserer Technik gegenüber bestehenden Methoden der Immunhistochemie besteht darin, dass sie eine effektive Visualisierung verschiedener Zelltypen während der adulten Hippocampus-Neurogenese ermöglicht. Diese Zelltypen, einschließlich der Vorläuferzellen der neuralen Stammzellen, die sonst schwer zu erkennen sind, können mit unserer Methode der Antigengewinnung effizient markiert und visualisiert werden. Diese Methode wird Einblicke in die Entwicklung und Regulation neugeborener Neuronen während der adulten Hippocampus-Neurogenese geben.

Für diejenigen, die sich für die Erforschung psychischer Störungen und die pharmakologische Behandlung interessieren, wird sich unser Antigen-Retrieval als nützlich erweisen, um die Rolle der neuronalen Entwicklung während dieser Krankheit zu untersuchen. Pathogenese. Beginnen Sie den Eingriff, indem Sie das Gehirn einer perfundierten Maus in 4%para-Formaldehyd über Nacht bei vier Grad Celsius in ein konisches 10-Milliliter-Röhrchen legen, oder für mindestens 12 bis 24 Stunden, aber nicht länger als 36 Stunden für die vollständige Fixierung. Entfernen Sie nach der Fixierung über Nacht das PFA und lassen Sie das Gehirn in der konischen Röhre.

Spülen Sie anschließend das Gehirn mit 30%Saccharose aus, um alle PFA-Reste zu entfernen, und entsorgen Sie die Saccharose. Füllen Sie dann die Tube wieder mit 30% Saccharose und halten Sie sie bei vier Grad Celsius, bis das Gehirn auf den Boden der Tube sinkt. Schneiden Sie anschließend den Hippocampus auf einem Mikrotom in 40 Mikrometer große Gehirnabschnitte.

Bewahren Sie die Schnitte in der Frostschutzlösung auf, bis sie für die Immunhistochemie bereit sind. Montieren Sie dann die Scheiben auf die Objektträger, die speziell so konzipiert sind, dass sie stark am Gewebe haften. Lassen Sie die Objektträger nach dem Montieren des Taschentuchs ca. 10 Minuten trocknen.

Die Trocknung kann beschleunigt werden, wenn die Objektträger auf einer vertikalen Fläche auf einem Papiertuch abgelegt werden, um eine vollständige Entfernung der vorherigen Chemikalien zu gewährleisten. Sobald die Objektträger getrocknet sind, waschen Sie sie jeweils fünf Minuten lang mit PB S3. Anschließend wieder trocknen lassen.

Bereiten Sie bei diesem Verfahren die Lösung zum Sieden des Gewebes gemäß der Beschreibung im beigefügten Manuskript vor. Als nächstes kochen Sie die Lösung fünf Minuten lang in einer normalen Mikrowelle auf Standardeinstellung. Sobald das Kochen abgeschlossen ist, nehmen Sie den Behälter vorsichtig aus der Mikrowelle.

Übertragen Sie danach die getrockneten Objektträger in die Lösung. Stellen Sie sicher, dass die Seite mit den Hippocampus-Abschnitten vollständig der Lösung ausgesetzt ist. Legen Sie die Objektträger nach Möglichkeit schräg an die Wände des Behälters und stapeln Sie andere Objektträger um sie herum.

Dann kochst du die Mischung mit den Objektträgern sieben Minuten lang in der Mikrowelle auf Standardeinstellungen. In der Zwischenzeit zwei Eiskübel zur Hälfte mit Eis füllen. Sobald das Kochen abgeschlossen ist, nehmen Sie den Behälter aus der Mikrowelle und stellen Sie ihn in einen der Eiskübel.

Gieße den Rest des Eises aus dem anderen Eimer rund um den Behälter und decke ihn vollständig ab. Lassen Sie es danach eine Stunde nach einer Stunde ruhen. Entferne die Objektträger aus dem Behälter.

Waschen Sie sie dreimal für jeweils fünf Minuten mit TBST-Puffer. Trocknen Sie die Objektträger anschließend fünf bis 10 Minuten lang dunkel oder bis die Objektträger vollständig getrocknet ist. In der Zwischenzeit wird eine Kammer mit DDH zwei O für die Färbung von Primärantikörpern über Nacht vorbereitet.

Sobald die Objektträger getrocknet sind, zeichnen Sie mit einem Wasser-Beschwerdeführer-Stift einen Umriss um die Gewebeabschnitte. Dieser Umriss wirkt als Barriere, um ein Überfließen des Antikörpergemisches zu verhindern. Bereiten Sie dann die primäre Antikörpermischung in T-B-S-T-T vor.

Legen Sie die getrockneten Objektträger auf den Tisch in die Färbekammer. Geben Sie langsam 500 Mikroliter des Primärantikörpers hinzu, um die gesamte Oberfläche zu bedecken. Decken Sie anschließend die Färbekammer ab, um das äußere Licht zu blockieren, und halten Sie sie am nächsten Tag über Nacht bei Raumtemperatur, waschen Sie die Objektträger dreimal jeweils fünf Minuten lang mit TBST-Puffer.

Danach trocknen Sie sie im Dunkeln. Bereiten Sie nun das Sekundärantikörpergemisch in T-B-S-T-T vor. Legen Sie dann die trockenen Objektträger in die Färbekammer.

Geben Sie 500 Mikroliter des Sekundärantikörpers hinzu. Decken Sie die Färbekammer langsam ab und halten Sie sie nach Abschluss der Sekundärfärbung mindestens zwei Stunden lang bei Raumtemperatur vor äußerem Licht geschützt, waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten mit TBST-Puffer, trocknen Sie die Objektträger nach dem Trocknen dunkel. Fügen Sie den Schienen eine Befestigungslösung hinzu.

Decken Sie diese vorsichtig mit Deckgläsern ab, um das Eindringen von Blasen zu verhindern. Bewahren Sie die Objektträger dann mindestens zwei Stunden lang im Dunkeln auf, bevor Sie anschließend analysieren und eine Zeitraffer- oder Convo-Analyse des gefärbten Gewebes durchführen. Die adulte Hippocampus-Neurogenese ist in der subgranulären Zone des Gyrus dentatus dargestellt.

Eine aktivierte radiale Gliazelle wie eine Stammzelle vom Typ 1 durchläuft verschiedene Phasen, während sie sich differenziert, reift und sich funktionell mit einer ausgeklügelten Morphologie in den neuronalen Schaltkreis integriert. Jede der Phasen und die jeweiligen Zelltypen können anhand ihrer Expression einer Kombination von Markern identifiziert werden. MCM zwei ist ein Proliferationsmarker, der über alle mitotischen Vorläuferzelltypen exprimiert wird, während nein zwischen radialen und nicht-radialen glialen Stammzellen exprimiert wird.

Da sich die Vorläuferzellen des Typs zwei A differenzieren, wird die verschachtelte Expression zunächst ausgeschaltet. Die Zunahme der Anti-TBR-Zwei-Expression im postmitotischen Vorläufer MCM 2-Expression geht verloren, während die DCX- und NEVAN-Expression die Migration und Reifung in ein funktionsfähiges Neuron bestimmen. Dies ist ein repräsentatives konfokales Bild der violetten MCM-, zwei-, grünen Neston- und roten Tapy-Färbung.

Die vergrößerten Bilder in den Kästen zeigen einen radialen GL-ähnlichen Vorläufer, der Neston MCM zwei und dpi exprimiert. Hier ist ein repräsentatives konfokales Bild von blauem MCM zwei, rotem, TBR zwei, grünem DCX und grauem dpi. Die Färbung der Charakteristik eines Typ-2-B-Vorläuferzelltyps ist in den vergrößerten Bildern in den Feldern zu sehen, die MCM two, TBR 2D, c, X und dpi ausdrücken.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich an drei Dinge zu erinnern. Erstens, verwenden Sie gut durchblutetes und fixiertes Gewebe mit der richtigen koronalen Dicke. Zweitens, das Taschentuch flach auf den Objektträgern zu befestigen und dabei Beschädigungen zu vermeiden.

Und schließlich drei, so dass genügend Zeit zum Kochen und anschließenden Abkühlen während der Antigengewinnung bleibt. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie konfokale Geweberekonstruktion und Verhaltensexperimente durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie sich neugeborene Neuronen in den Schaltkreis des Hippocampus integrieren und zur kognitiven Funktion beitragen können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Antigen-Retriever an Ihrem Hippocampusgewebe durchführen können, um die präsentativen Zelltypen, die bei anderen Hippocampus-Neurosen entstehen, effektiver zu visualisieren.