Ein schnelles Protokoll zur Integration extrachromosomaler Arrays mit hoher Übertragungsrate in das Genom von C. elegans

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, transgene extrachromosomale Arrays mittels UV-Bestrahlung in das Genom von Caenorhabditis elegans zu integrieren. Zunächst wählen Sie die transgene Linie mit der höchstmöglichen Übertragungsrate aus, idealerweise größer als 80 %. Danach bestrahlen Sie die ausgewählten transgenen L4-Larven mit UV-Licht und isolieren jeweils vier fluoreszierende transgene F2-Tiere von jeder ausgewählten F1-Platte. Im Anschluss untersuchen Sie die F2-Platten auf 100 % fluoreszierende transgene Nachkommen.

F drei Würmer. Letztendlich ermöglicht die Auswahl fluoreszierender Tiere der F-dritten Generation die Beobachtung einer 100%igen Vererbung des Transgens. Dieser experimentelle Ansatz eignet sich besonders gut für transgene Linien, die zusätzliche Chromosomenanordnungen mit hoher Rate weitergeben.

Die Prozedur wird Stephanie Belman, eine Technikerin aus unserem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie mit 500 großen Petrischalen, die Nematodenwachstumsmedium enthalten. Impfen Sie jede Platte mit 0,3 Millilitern gesättigtem *E. coli* an.

OP 50 Kultur. Bewerten Sie die Transmissionsrate der zu integrierenden transgenen Linie für jede transgene Linie. Wählen Sie 10 fluoreszierende erwachsene Tiere unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop aus und überführen Sie sie jeweils auf 10 separate Kulturplatten.

Die Tiere in einem Wurminkubator bei einer für die Fortpflanzung des genetischen Hintergrunds permissiven Temperatur halten. Die Nachkommen täglich überwachen, um zu beurteilen, in welchem Entwicklungsstadium der Co-Injektionsmarker exprimiert wird und am besten mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar ist. Die Transmissionsrate der Nachkommen bewerten, indem der Prozentsatz der fluoreszierenden Nachkommen bestimmt wird.

Für die Transgenintegration wählen Sie die transgene Linie mit der höchsten Übertragungsrate aus. Beschaffen Sie eine Population transgener Tiere, die im vierten Larvenstadium (L4) synchronisiert sind. Wählen Sie für die Integration 30 fluoreszierende erwachsene GRA-Tiere und platzieren Sie sie auf fünf Kulturplatten.

Nachdem die Würmer drei bis vier Stunden bei 15 Grad Celsius Eier gelegt haben, überprüfen Sie, ob sich mindestens 30 Eier pro Platte befinden, und entfernen Sie anschließend die erwachsenen Tiere von den Platten. Kultivieren Sie die Tiere in einem Wurm-Inkubator, bis die Nachkommen das L4-Larvenstadium erreichen. Stellen Sie jede Platte mit 15 bis 20 fluoreszierenden transgenen L4-Tieren in einen UV-Vernetzer, nachdem Sie die Deckel entfernt haben, und bestrahlen Sie die Würmer zur Rekombination. Inkubieren Sie die bestrahlten Würmer über Nacht bei 15 Grad Celsius.

Überprüfen Sie die Anzahl der Tiere, die in unserem Besitz noch am Leben sind. Eine Überlebensrate von etwa 80 bis 90 % ist für eine effiziente Bestrahlung geeignet. Züchten Sie die bestrahlten Tiere bei 15 bis 25 Grad Celsius, bis die Nachkommen das Entwicklungsstadium erreicht haben, das die Beobachtung der Ko-Injektions-Marker-Expression ermöglicht.

Überführen Sie einzelne fluoreszierende F1-Tiere auf separate Kulturplatten. Lagern Sie diese F1-Platten bei 15 bis 25 Grad Celsius, bis die Nachkommen einen geeigneten Entwicklungsstand für die Beobachtung fluoreszierender F2-Tiere erreicht haben, abhängig vom verwendeten Kopplungsmarker. In diesem speziellen Fall beobachteten wir die Würmer im Erwachsenenstadium und entsorgten alle F1-Platten, die entweder keine oder nur einen Nachkommen aufwiesen, was darauf hindeutet, dass das F1-Tier steril war oder gestorben ist, oder nur zwei oder lediglich wenige fluoreszierende F2-Tiere zeigten, was darauf hindeutet, dass das F1-Tier das Transgen nicht mit der erwarteten Rate weitergegeben hat.

Isolieren Sie vier fluoreszierende transgene F2-Tiere von jeder ausgewählten F1-Platte. Wenn fluoreszierende Transgene verwendet werden, wählen Sie F2-Würmer mit einem hohen Fluoreszenzniveau aus, da dies darauf hindeuten könnte, dass diese Tiere homozygot für das integrierte Array sind. Beachten Sie, dass beim Auswählen der F2-Tiere entscheidend ist, keine Eier oder Larven mitzunehmen, um im nächsten Schritt falsch negative Ergebnisse zu vermeiden.

Nachdem die F2-Tiere gezüchtet wurden, untersuchen Sie die F2-Platten auf 100 % fluoreszierende transgene F3-Würmer. Die Untersuchung verläuft sehr schnell, da das Vorhandensein eines einzigen nicht fluoreszierenden Wurms anzeigt, dass die Platte verworfen werden sollte. Isolieren Sie acht fluoreszierende F3-Tiere von ausgewählten Platten, um die 100 %ige Vererbung des Transgens zu bestätigen. Falls möglich, behalten Sie mehrere unabhängige, integrierte transgene Stämme bei.

Integrationen von Transgenen in zwei verschiedenen Linien, die extrachromosomale Arrays mit etwa gleicher Häufigkeit weitergeben, wurden durchgeführt. Mithilfe des Standard- und des verbesserten Protokolls wurden Zeit und Anzahl der pro integrierten Linie benötigten Platten im verbesserten Protokoll optimiert. Anschließend überprüften wir die Hypothese, dass eine höhere Transgen-Übertragungsrate in einer nicht-integrierten Linie die Integration des Transgens in das Genom erleichtert.

Ein bestimmtes Transgen wurde in Linien mit unterschiedlichen Übertragungsraten mittels des verbesserten Protokolls für die Linie mit der höchsten Übertragungsrate integriert. Drei integrierte Linien wurden aus lediglich 90 ausgewählten F1-Tieren gewonnen, während für die transgene Linie mit einer Übertragungsrate von 50 bis 60 % eine integrierte Linie aus 110 ausgewählten F1-Tieren erhalten wurde. Mit dieser Methode können anschließend verschiedene Verfahren durchgeführt werden, um weitere Fragestellungen zu beantworten, wie beispielsweise die Bestimmung der Genexpression, des Expressionsmusters und der Genregulation, die Lokalisation von Proteinen, die Überexpression von Proteinen oder die Entwicklung von subzellulären Markern.