Name: Multiplex PCR Assay f (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Lernen Sie eine Multiplex-PCR-Methode zur schnellen Typisierung von SCCmec-Elementen bei MRSA-Stämmen. Diese effiziente Technik vereinfacht die molekulare Epidemiologie in klinischen Laboren erheblich.

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Wir danken T. Ito, K. Hiramatsu, R. Daum, H. de Lencastre und D. Coleman für das freundliche Geschenk einiger Referenzstämme, die in dieser Studie verwendet wurden. Diese Arbeit wurde zum Teil finanziell unterstützt vom Centre for Antimicrobial Resistance (CAR), Alberta Health Services-Calgary/Calgary Laboratory Services/University of Calgary.

Diese Verfahren sollten in einem zertifizierten Labor Sicherheitsstufe 2 durchgef

<ol><li>IWG-SCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+%28SCCmec%29%3A+guidelines+for+reporting+novel+SCCmec+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 4961-4967 (2009).</li>
<li>Ito, T., Hiramatsu, K., Tomasz, A., de Lencastre, H., Perreten, V., Holden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Reporting+Novel+mecA+Gene+Homologues%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (10), 4997-4999 (2012).</li>
<li>Okuma, K., Iwakawa, K., Turnidge, J. D., Grubb, W. B., Bell, J. M., O'Brien, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+new+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+clones+in+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (11), 4289-4294 (2002).</li>
<li>Kondo, Y., Ito, T., Ma, X. X., Watanabe, S., Kreiswirth, B. N., Etienne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+multiplex+PCRs+for+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+assignment%3A+rapid+identification+system+for+mec%2C+ccr%2C+and+major+differences+in+junkyard+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (1), 264-274 (2007).</li>
<li>Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+rapid+identification+of+structural+types+and+variants+of+the+mec+element+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (7), 2155-2161 (2002).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+to+the+multiplex+PCR+strategy+for+assignment+of+mec+element+types+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (9), 3374-3377 (2007).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+subtyping+the+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+IV+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%3A+%27SCCmec+IV+multiplex%27%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (1), 42-48 (2007).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Louie, T., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+multiplex+PCR+assay+for+characterization+and+concomitant+subtyping+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (10), 5026-5033 (2005).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+multiplex+PCR+assay+for+typing+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Enhanced multiplex PCR assay for typing of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Molecular and Cellular Probes. 26 (5), 218-221 (2012).</li>
<li>de Lamballerie, X., Zandotti, C., Vignoli, C., Bollet, C., de Micco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+microbial+DNA+extraction+method+using+%22Chelex+100%22+suitable+for+gene+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A one-step microbial DNA extraction method using "Chelex 100" suitable for gene amplification.</a> Research in Microbiology. 143 (8), 785-790 (1992).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>McClure, J. A., Conly, J. M., Elsayed, S., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+assay+to+facilitate+identification+of+the+recently+described+Staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+VIII%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR assay to facilitate identification of the recently described Staphylococcal cassette chromosome mec type VIII.</a> Molecular and Cellular Probes. 24 (4), 229-232 (2010).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type%2C+tentatively+designated+type+VIII%2C+harboring+class+A+mec+and+type+4+ccr+gene+complexes+in+a+Canadian+epidemic+strain+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Novel staphylococcal cassette chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 531-540 (2009).</li>
</ol>

Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Der hier beschriebene Multiplex-PCR-Assay bietet eine einfache, zuverlässige Methode zur Klassifizierung von Typen und Hauptsubtypen von SCCmec I-V in Staphylokokken bei gleichzeitiger Unterscheidung von MRSA und MSSA. Der Assay ist robust, lässt sich bequem in einer einzigen PCR-Reaktion durchführen und die Ergebnisse sind leicht zu interpretieren. Der Assay weist insofern Einschränkungen auf, als er auf einzelne Loci innerhalb jedes SCC-Mec-Typs abzielt, bietet jedoch keine umfassende ccr- und mec...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.
In Table 1, the Oligonucleotide sequence for Type III-F5 was updated from:
TTCTCATTGATGCTGAAGCC
To:
GAAACTAGTTATTTCCAACGG

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.

Erratum: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) erworben hat und in ihr Genom ein 21-67-kb mobilen genetischen Elements integriert, bezeichnet die Staphylokokken-Kassette Chromosom mec (SCC mec), die Methicillin-Resistenz (mecA-Gen) und anderen Antibiotika-Resistenz-Determinanten 1 birgt . SCC mec wird durch die Gegenwart von endst

<table><tbody><tr><td>Tryptic Soja</td><td>Agar Fisher (BD)</td><td>CA90002-700 (236920)</td><td></td></tr><tr><td>Steriles destilliertes Wasser</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq: inkl. 10x PCR Puffer und 50 mM MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>10966-034</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP</td><td>Life Technologies</td><td>10297-018</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Life Technologies</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>1Kb+ DNA-Leiter</td><td>Leben Technologies</td><td>10787-026</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen </td><td>VWR (Axygen Scientific)</td><td>10011-700</td><td></td></tr><tr><td>Kulturstäbchen</td><td>VWR</td><td>CA10805-018</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen</td><td>Diamed</td><td>AD0210-FCN (neu #: DIATEC420-1250)</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417c</td><td></td></tr><tr><td>Wärmeblock</td><td>VWR</td><td>13259-030 / 13259-286</td><td></td></tr><tr><td>Thermalcycler</td><td>Applied Biosystems (2720)</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Horizontale, tauchfähige Gelelektrophoresekammer mit Gelform</td><td>BioRad</td><td>170-4469</td><td></td></tr><tr><td>Stromversorgung</td><td>BioRad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>Wippschüttler</td><td>VWR</td><td>40000-300</td><td></td></tr><tr><td>Molekular Imager Gel Doc System</td><td>BioRad</td><td>1708170</td><td></td></tr></tbody></table>

multiplex pcr assay f

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylokokken Cassette Chromosome mec (SCC mec) Typisierung ist eine sehr wichtige molekulare Werkzeug f

Dieses aktualisierte M-PCR kann SCCmec-Typen I–V sowie die wichtigsten Untergruppen von SCCmec IV bestimmen (einteilen). Der Test zielt auf eindeutige und spezifische Loci von SCCmec I, II, III, IVa, IVb, IVc, IVd, IVE und V ab und detektiert gleichzeitig das mecA-Gen. Eine vorläufige Identifizierung von SCCmec VI und VIII ist ebenfalls möglich, erfordert jedoch weitere Tests zur Bestätigung. Abbildung 3 veranschaulicht repräsentative SCCmec-I–VI- und...

Wir demonstrieren einen einfachen Multiplex-PCR-Assay für das schnelle Screening und die Typisierung von Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) Typ I-V auf Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus und stellen einige der wichtigen Schritte und Verfahrensnuancen bereit, die ihn für die Anpassung dieses Assays an einzelne Labore erfolgreich machen.

Multiplex PCR Assay f

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den SCCmec-Typ von Methicillin-resistenten Staphylococcus-aureus-Isolaten oder MRSA-Isolaten mittels eines Multiplex-PCR-Assays zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst DNA aus den Stämmen mittels einer schnellen und einfachen Extraktionstechnik isoliert wird, bei der die bakteriellen Zellen in Wasser erhitzt werden. Der zweite Schritt besteht darin, einen Multiplex-PCR-Assay durchzuführen, um spezifische Zielsequenzen der einzelnen SCCmec-Typen zu amplifizieren.Anschließend werden die PCR-Produkte mittels AROS-Gelelektrophorese getrennt. Im letzten Schritt wird das Gel angefärbt, um die DNA sichtbar zu machen, und anschließend erfolgt die Datenanalyse. Letztendlich wird anhand der einzigartigen Kombination spezifischer PCR-Produkte, die mit diesem Multiplex-PCR-Assay erhalten wurden, die SE-cmec-Typen der MRS A-Isolate bestimmt. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie den traditionellen S-CEC-Typisierungsschemata, die einzelne CCR- und MEC-Genkomplexe gezielt ansprechen und mehrere einzelne PCR-Röhrchen erfordern, liegt darin, dass dieser Prozess den Arbeitsaufwand erheblich vereinfacht und in einem einzigen PCR-Röhrchen durchgeführt werden kann.Diese Verfahren sollten in einem zertifizierten Biosicherheitslabor der Stufe zwei durchgeführt werden. Entsprechende persönliche Schutzausrüstung sollte stets am Tag vor der Durchführung der PCR getragen werden. Wählen Sie mit einem sterilen Kulturstäbchen eine einzelne Kolonie von MRSA von einer frischen Übernachtkulturplatte aus und stellen Sie einen dichten Strich der Bakterien auf einer Tryptic-Soy-Agar-Platte her.Mehrere Proben können auf einer einzigen Platte ausgestrichen und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert werden. Geben Sie 75 Mikroliter steriles destilliertes Wasser in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Mit einem sterilen Kulturstab.Nehmen Sie eine kleine Menge Bakterien von der dichten Übernachtkultur auf. Wirbeln Sie die Bakterien in steriler Wasser, um eine trübe Lösung herzustellen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Proben.Die Röhrchen 10 Minuten lang in einem Trockenheizblock bei 95 Grad Celsius inkubieren, um die Bakterien zu lysieren und die DNA freizusetzen. Die Proben aus dem Heizblock nehmen und fünf Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Die Proben eine Minute bei 13.000 U/min zentrifugieren.Die resultierende Probe weist ein Pellet aus zellulärem Detritus und einen klaren Überstand, der die DNA enthält, auf. Zum Vorbereiten der PCR entnehmen Sie die PCR-Reagenzien, einschließlich 10× PCR-Puffer, 50 Millimolar Magnesiumchlorid, DTPs und Primer, aus dem Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius und lassen sie bei Raumtemperatur auf der sauberen PCR-Arbeitsfläche auftauen, wo keine Bakterien oder DNA zugelassen sind. Zu diesem Zeitpunkt können 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen vorbereitet und beschriftet werden.Nach dem Auftauen kurz vortexen, um alle Reagenzien zu vermischen, und anschließend gemäß der tabellarischen Anleitung im Textprotokoll zusammenzuführen. Es ist wichtig, eine Platinum-Tech-DNA-Polymerase zu verwenden, da sich dies positiv auf den Erfolg der Reaktion auswirkt. Nach dem Vortexen der Master-Mix-Lösung Eloqua in die einzelnen PCR-Röhrchen diese verschließen und zum allgemeinen Arbeitsplatz bringen.Fügen Sie die Vorlage den PCR-Röhrchen hinzu, indem Sie zwei Mikroliter des klaren Überstandes aus den zuvor vorbereiteten Bakterienproben pipettieren. Wechseln Sie danach in den dedizierten Amplifikationsbereich, bevor Sie die Röhrchen in den Thermocycler geben und die Reaktion gemäß dem schriftlichen Protokoll durchführen. Arbeiten Sie in einem dedizierten Bereich für die Gelelektrophorese mit 2,5 Gramm Agarose pro 100 Milliliter 0,5-facher XTBE-Pufferlösung in einem Glas-Erlenmeyerkolben.Bedecken Sie den Kolben mit Plastikfolie und erhitzen Sie die Lösung in einer Mikrowelle, bis sie vollständig gelöst ist. Ein 2,5 %-Gel kann schnell überlaufen. Deshalb unterbrechen Sie die Mikrowelle und schwenken die Lösung regelmäßig.Kühlen Sie das Agarosegel ab, bis es angenehm anzufassen ist, indem Sie es unter kaltem Wasser schwenken oder fünf Minuten auf dem Pult ruhen lassen. Gießen Sie das Agarosegel in die Gielebene, nachdem Sie die Röhrchen aus dem PCR-Thermocycler entfernt haben. Bereiten Sie die Proben vor, indem Sie zwei Mikroliter Sechsfach-DNA-Ladefarbstoff zu jeder Probe hinzufügen.Geben Sie fünf bis 10 Mikroliter Probe pro Brunnen auf das Gel. Ein 1-KB-plus- oder ein 100-Basenpaar-DNA-Längenstandard eignet sich für die erwarteten Bandgrößen. Äthidiumbromid kann dem Gel vor dem Gießen zugesetzt werden, oder alternativ kann das Gel vor der Sichtbarmachung in einer Äthidiumbromidlösung angefärbt werden.Das fertige Gel in eine Lösung von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter Äthidiumbromid in destilliertem Wasser geben und 10 Minuten lang vorsichtig auf einem Schüttler mischen. Das Gel in einen sauberen Behälter überführen und weitere 10 Minuten in destilliertem Wasser belassen. Gezeigt ist ein repräsentatives Gel, das die erwarteten PCR-Produkte für alle repräsentativen Stämme der SEC MEC-Typen eins bis sechs und acht sowie der SEC MEK-Subtypen A bis F veranschaulicht. Für einen typischen SEC MEK-Typ-eins-Stamm werden zwei Banden erwartet.Das typenspezifische Band vom Typ eins bei 613 Basenpaaren sowie das mec-Band, ein Kontrollband bei 147 Basenpaaren. Drei repräsentative SEC MEK zwei-Stämme sind dargestellt, einschließlich des prototypischen Typ-zwei-Stamms N drei 15 sowie des seltener vorkommenden Typ zwei A und Typ zwei B. Um einen Stamm als SEC mek zwei zu klassifizieren, sollten zwei Bandmuster nachweisbar sein, darunter das Target des Typ-zwei-Lokus bei 128 Basenpaaren und das Meca-Kontrollband. Drei repräsentative SEC MEK drei-Stämme sind im Gel dargestellt, darunter der prototypische SEC MEK drei-Stamm 85 2 0 8 2 und der seltener vorkommende Typ drei A-Stamm JCSC zwei 90. SSC MEC drei wird basierend auf dem Vorhandensein zweier PCR-Produkte identifiziert, darunter das typenspezifische Target vom Typ drei bei 257 Basenpaaren und das Mecca-Kontroll-Target.Das dominante SEC-MEC-drei wird ebenfalls positiv für das Quecksilber-Target bei 280 Basenpaaren sein, das auf einem benachbarten SEC-Element getragen wird und dazu dient, es vom selteneren SEC-MEC-drei-A-fünf zu unterscheiden. Dargestellt sind repräsentative SEC-MEC-vier-Elemente, einschließlich der Typen vier A, vier B, vier C, vier D, vier E und vier F. Im Gegensatz zu SC-MEK-eins bis drei ist kein einzelnes Target in allen SCC-MEK-vier-Subtypen vorhanden, abgesehen von meck A. Der repräsentative SCC-MEK-vier-E-Stamm wird anhand des Vorhandenseins des Typ-vier-E-Bandes sowie des CCR-AB-vier-Produkts identifiziert, das auf einem benachbarten zusätzlichen Element vorhanden ist, und des Typ-vier-C-Produkts, das vorhanden ist, weil SEC-MEK-vier E dieselbe J-eins-Region wie SE-Cmk-vier CSCC-MEK-vier F teilt. CSCC-MEK-vier F ist SEC-MEK-vier E ähnlich, da es dieselbe J-drei-Region teilt und folglich sowohl für das vier-E-Target als auch für das CCR-AB-vier-Target positiv ist, aufgrund eines benachbarten zusätzlichen Elements. S-Cmk-vier-F kann jedoch von S-CMK-vier-E dadurch unterschieden werden, dass es das Typ-vier-C-Target fehlt.Ein typischer SE CMK-Fünfer hätte zwei PCR-Produkte im Gel gezeigt: das typenspezifische Band für Typ Fünf bei 325 Basenpaaren und die ME-Kontrolle bei 147 Basenpaaren. Schließlich wurde das Ziel dieses Assays zwar nicht darin gesehen, eine endgültige Identifizierung entweder von SEC MEK sechs oder acht zu liefern, dennoch wurden repräsentative Stämme für beide Typen einbezogen, da ein spezifisches PCR-Muster Hinweise auf das Vorhandensein dieser Typen liefern kann.Neben dem Meck-A-Ziel wird erwartet, dass die repräsentative SEC-MEK-sechs eine positive CR-AB-vier-Produkt bei 106 Basenpaaren erzeugt, da dies ihr hauptsächlicher CCR-Komplextyp ist. Die repräsentative SEC-MEC-acht wäre außerdem positiv für MEC-A bei 147 Basenpaaren und für C-C-R-A-B-vier bei 106 Basenpaaren und ließe sich von SEC-MEK-sechs anhand eines positiven, typenspezifischen Produkts vom Typ zwei unterscheiden, das darauf zurückzuführen ist, dass sie dieselbe J-zwei-Region wie SEC-MEK-zwei besitzt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass aufgrund der komplexen Natur des Assays und der großen Anzahl an im Reaktionsgemisch enthaltenen Primern Schwierigkeiten auftreten können.Bei der Anpassung an einzelne Laboratorien wird die sorgfältige Beachtung bestimmter zentraler Aspekte wie der DNA-Vorlagepräparation und der Marke der PCR-Reagenzien dieses Ziel erheblich erleichtern.

multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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