Name: Multiplex PCR Assay f (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Lernen Sie eine Multiplex-PCR-Methode zur schnellen Typisierung von SCCmec-Elementen bei MRSA-Stämmen. Diese effiziente Technik vereinfacht die molekulare Epidemiologie in klinischen Laboren erheblich.

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Wir danken T. Ito, K. Hiramatsu, R. Daum, H. de Lencastre und D. Coleman für das freundliche Geschenk einiger Referenzstämme, die in dieser Studie verwendet wurden. Diese Arbeit wurde zum Teil finanziell unterstützt vom Centre for Antimicrobial Resistance (CAR), Alberta Health Services-Calgary/Calgary Laboratory Services/University of Calgary.

Diese Verfahren sollten in einem zertifizierten Labor Sicherheitsstufe 2 durchgef

<ol><li>IWG-SCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+%28SCCmec%29%3A+guidelines+for+reporting+novel+SCCmec+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 4961-4967 (2009).</li>
<li>Ito, T., Hiramatsu, K., Tomasz, A., de Lencastre, H., Perreten, V., Holden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Reporting+Novel+mecA+Gene+Homologues%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (10), 4997-4999 (2012).</li>
<li>Okuma, K., Iwakawa, K., Turnidge, J. D., Grubb, W. B., Bell, J. M., O'Brien, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+new+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+clones+in+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (11), 4289-4294 (2002).</li>
<li>Kondo, Y., Ito, T., Ma, X. X., Watanabe, S., Kreiswirth, B. N., Etienne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+multiplex+PCRs+for+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+assignment%3A+rapid+identification+system+for+mec%2C+ccr%2C+and+major+differences+in+junkyard+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (1), 264-274 (2007).</li>
<li>Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+rapid+identification+of+structural+types+and+variants+of+the+mec+element+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (7), 2155-2161 (2002).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+to+the+multiplex+PCR+strategy+for+assignment+of+mec+element+types+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (9), 3374-3377 (2007).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+subtyping+the+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+IV+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%3A+%27SCCmec+IV+multiplex%27%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (1), 42-48 (2007).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Louie, T., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+multiplex+PCR+assay+for+characterization+and+concomitant+subtyping+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (10), 5026-5033 (2005).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+multiplex+PCR+assay+for+typing+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Enhanced multiplex PCR assay for typing of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Molecular and Cellular Probes. 26 (5), 218-221 (2012).</li>
<li>de Lamballerie, X., Zandotti, C., Vignoli, C., Bollet, C., de Micco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+microbial+DNA+extraction+method+using+%22Chelex+100%22+suitable+for+gene+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A one-step microbial DNA extraction method using "Chelex 100" suitable for gene amplification.</a> Research in Microbiology. 143 (8), 785-790 (1992).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>McClure, J. A., Conly, J. M., Elsayed, S., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+assay+to+facilitate+identification+of+the+recently+described+Staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+VIII%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR assay to facilitate identification of the recently described Staphylococcal cassette chromosome mec type VIII.</a> Molecular and Cellular Probes. 24 (4), 229-232 (2010).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type%2C+tentatively+designated+type+VIII%2C+harboring+class+A+mec+and+type+4+ccr+gene+complexes+in+a+Canadian+epidemic+strain+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Novel staphylococcal cassette chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 531-540 (2009).</li>
</ol>

Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Der hier beschriebene Multiplex-PCR-Assay bietet eine einfache, zuverlässige Methode zur Klassifizierung von Typen und Hauptsubtypen von SCCmec I-V in Staphylokokken bei gleichzeitiger Unterscheidung von MRSA und MSSA. Der Assay ist robust, lässt sich bequem in einer einzigen PCR-Reaktion durchführen und die Ergebnisse sind leicht zu interpretieren. Der Assay weist insofern Einschränkungen auf, als er auf einzelne Loci innerhalb jedes SCC-Mec-Typs abzielt, bietet jedoch keine umfassende ccr- und mec...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.
In Table 1, the Oligonucleotide sequence for Type III-F5 was updated from:
TTCTCATTGATGCTGAAGCC
To:
GAAACTAGTTATTTCCAACGG

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.

Erratum: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) erworben hat und in ihr Genom ein 21-67-kb mobilen genetischen Elements integriert, bezeichnet die Staphylokokken-Kassette Chromosom mec (SCC mec), die Methicillin-Resistenz (mecA-Gen) und anderen Antibiotika-Resistenz-Determinanten 1 birgt . SCC mec wird durch die Gegenwart von endst

<table><tbody><tr><td>Tryptic Soja</td><td>Agar Fisher (BD)</td><td>CA90002-700 (236920)</td><td></td></tr><tr><td>Steriles destilliertes Wasser</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq: inkl. 10x PCR Puffer und 50 mM MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>10966-034</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP</td><td>Life Technologies</td><td>10297-018</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Life Technologies</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>1Kb+ DNA-Leiter</td><td>Leben Technologies</td><td>10787-026</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen </td><td>VWR (Axygen Scientific)</td><td>10011-700</td><td></td></tr><tr><td>Kulturstäbchen</td><td>VWR</td><td>CA10805-018</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen</td><td>Diamed</td><td>AD0210-FCN (neu #: DIATEC420-1250)</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417c</td><td></td></tr><tr><td>Wärmeblock</td><td>VWR</td><td>13259-030 / 13259-286</td><td></td></tr><tr><td>Thermalcycler</td><td>Applied Biosystems (2720)</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Horizontale, tauchfähige Gelelektrophoresekammer mit Gelform</td><td>BioRad</td><td>170-4469</td><td></td></tr><tr><td>Stromversorgung</td><td>BioRad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>Wippschüttler</td><td>VWR</td><td>40000-300</td><td></td></tr><tr><td>Molekular Imager Gel Doc System</td><td>BioRad</td><td>1708170</td><td></td></tr></tbody></table>

multiplex pcr assay f

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylokokken Cassette Chromosome mec (SCC mec) Typisierung ist eine sehr wichtige molekulare Werkzeug f

Dieses aktualisierte M-PCR kann SCCmec-Typen I–V sowie die wichtigsten Untergruppen von SCCmec IV bestimmen (einteilen). Der Test zielt auf eindeutige und spezifische Loci von SCCmec I, II, III, IVa, IVb, IVc, IVd, IVE und V ab und detektiert gleichzeitig das mecA-Gen. Eine vorläufige Identifizierung von SCCmec VI und VIII ist ebenfalls möglich, erfordert jedoch weitere Tests zur Bestätigung. Abbildung 3 veranschaulicht repräsentative SCCmec-I–VI- und...

Wir demonstrieren einen einfachen Multiplex-PCR-Assay für das schnelle Screening und die Typisierung von Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) Typ I-V auf Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus und stellen einige der wichtigen Schritte und Verfahrensnuancen bereit, die ihn für die Anpassung dieses Assays an einzelne Labore erfolgreich machen.

Multiplex PCR Assay f

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den SCCmec-Typ von Methicillin-resistenten Staphylococcus-aureus-Isolaten oder MRSA-Isolaten mittels eines Multiplex-PCR-Assays zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst DNA aus den Stämmen mittels einer schnellen und einfachen Extraktionstechnik isoliert wird, bei der die bakteriellen Zellen in Wasser erhitzt werden. Der zweite Schritt besteht darin, einen Multiplex-PCR-Assay durchzuführen, um spezifische Zielsequenzen der einzelnen SCCmec-Typen zu amplifizieren.Anschließend werden die PCR-Produkte mittels AROS-Gelelektrophorese getrennt. Im letzten Schritt wird das Gel angefärbt, um die DNA sichtbar zu machen, und anschließend erfolgt die Datenanalyse. Letztendlich wird anhand der einzigartigen Kombination spezifischer PCR-Produkte, die mit diesem Multiplex-PCR-Assay erhalten wurden, die SE-cmec-Typen der MRS A-Isolate bestimmt. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie den traditionellen S-CEC-Typisierungsschemata, die einzelne CCR- und MEC-Genkomplexe gezielt ansprechen und mehrere einzelne PCR-Röhrchen erfordern, liegt darin, dass dieser Prozess den Arbeitsaufwand erheblich vereinfach

multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Eine preiswerte, einen hohen Durchsatz-Verfahren für die simultane Detektion von bis zu 43 molekulare Ziele beschrieben. Anwendungen der MPCR / RLB gehören mikrobielle Typisierung und Erkennung von mehreren Erregern aus klinischen Proben.

Multiplex PCR und Reverse-Line-Blot-Hybridisierung Assay (MPCR / RLB)

Wir beschreiben eine Multiplex-PCR zum schnellen Nachweis von Salmonella enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium. Spezifische Salmonella-Serovare können, indem sie auf einer Multiplex-PCR, um Gene und Sequenzen einzigartig für die O-Antigen-Biosynthese-Cluster und Flagellin eines bestimmten Serovar identifiziert werden. Serovar wird dann auf eine Salmonellen zugeordnet isolieren über das Auftreten von bestimmten, Größe Amplikons (PCR-Produkt), entsprechend dem Ziel...

Ein Allelotyping PCR zur Identifizierung Salmonella enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium

Wir beschreiben ein Multiplex-Verfahren für den Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe mit Oligonukleotid-gekoppelte fluoreszierende Kügelchen. Amplicon aus allen Organismen in einer Probe ist es, ein Gremium von Sonde-gekoppelten Beads hybridisiert. Ein Luminex oder Bio-Plex Gerät wird verwendet, um jede Perle für Perle Art und Hybridisierungssignal Abfrage.

Multiplex Nachweis von Bakterien in komplexen Clinical and Environmental Proben mit Oligonukleotid-gekoppelten Fluoreszenz-Mikrosphären

Lytic Phagen Biosensoren und Antikörper Perlen sind in der Lage, zwischen Methicillin-resistenten (MRSA) und empfindliche Staphylokokken Bakterien unterscheiden. Die Phagen wurden durch ein Langmuir-Blodgett-Technik auf einer Oberfläche einer Quarzkristall-Mikrowaage Sensor immobilisiert und arbeitete als breites Staphylococcus Sonden. Antikörper erkennen Perlen MRSA.

Biosensor zum Nachweis von Antibiotika-resistenten Staphylococcus Bakterien

Ein Verstärkungsmikroarray kombiniert asymmetrischen PCR-Amplifikation und Mikroarray-Hybridisierung in einer einzigen Kammer, die Mikroarray-Arbeitsprozess deutlich vereinfacht für den Endbenutzer. Vereinfachung der Microarray-Workflow ist ein notwendiger erster Schritt für die Erstellung von Microarray-basierte Diagnostik, die routinemäßig in der unteren-Ressource-Umgebungen eingesetzt werden kann.

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