Name: Multiplex PCR Ensayo para la tipificaci (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprende a realizar un ensayo de PCR multiplex para tipificar SCCmec en cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA). Este método simplifica la caracterización bacteriana en laboratorios clínicos.

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Agradecemos a T. Ito, K. Hiramatsu, R. Daum, H. de Lencastre y D. Coleman por el amable regalo de algunas cepas de referencia utilizadas en este estudio. Este trabajo fue financiado en parte por el Centro para la Resistencia a los Antimicrobianos (CAR), los Servicios de Salud de Alberta-Calgary/Servicios de Laboratorio de Calgary/Universidad de Calgary.

Estos procedimientos deben llevarse a cabo en un laboratorio de nivel de bioseguridad certificada 2. Equipo de protecci

<ol><li>IWG-SCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+%28SCCmec%29%3A+guidelines+for+reporting+novel+SCCmec+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 4961-4967 (2009).</li>
<li>Ito, T., Hiramatsu, K., Tomasz, A., de Lencastre, H., Perreten, V., Holden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Reporting+Novel+mecA+Gene+Homologues%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (10), 4997-4999 (2012).</li>
<li>Okuma, K., Iwakawa, K., Turnidge, J. D., Grubb, W. B., Bell, J. M., O'Brien, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+new+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+clones+in+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (11), 4289-4294 (2002).</li>
<li>Kondo, Y., Ito, T., Ma, X. X., Watanabe, S., Kreiswirth, B. N., Etienne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+multiplex+PCRs+for+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+assignment%3A+rapid+identification+system+for+mec%2C+ccr%2C+and+major+differences+in+junkyard+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (1), 264-274 (2007).</li>
<li>Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+rapid+identification+of+structural+types+and+variants+of+the+mec+element+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (7), 2155-2161 (2002).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+to+the+multiplex+PCR+strategy+for+assignment+of+mec+element+types+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (9), 3374-3377 (2007).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+subtyping+the+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+IV+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%3A+%27SCCmec+IV+multiplex%27%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (1), 42-48 (2007).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Louie, T., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+multiplex+PCR+assay+for+characterization+and+concomitant+subtyping+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (10), 5026-5033 (2005).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+multiplex+PCR+assay+for+typing+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Enhanced multiplex PCR assay for typing of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Molecular and Cellular Probes. 26 (5), 218-221 (2012).</li>
<li>de Lamballerie, X., Zandotti, C., Vignoli, C., Bollet, C., de Micco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+microbial+DNA+extraction+method+using+%22Chelex+100%22+suitable+for+gene+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A one-step microbial DNA extraction method using "Chelex 100" suitable for gene amplification.</a> Research in Microbiology. 143 (8), 785-790 (1992).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>McClure, J. A., Conly, J. M., Elsayed, S., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+assay+to+facilitate+identification+of+the+recently+described+Staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+VIII%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR assay to facilitate identification of the recently described Staphylococcal cassette chromosome mec type VIII.</a> Molecular and Cellular Probes. 24 (4), 229-232 (2010).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type%2C+tentatively+designated+type+VIII%2C+harboring+class+A+mec+and+type+4+ccr+gene+complexes+in+a+Canadian+epidemic+strain+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Novel staphylococcal cassette chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 531-540 (2009).</li>
</ol>

No se declaran conflictos de intereses.

El ensayo de PCR multiplex descrito aquí proporciona un método simple y confiable para clasificar los tipos y subtipos principales de SCCmec I-V en estafilococos, con discriminación simultánea de MRSA de MSSA. El ensayo es robusto, se realiza convenientemente en una sola reacción de PCR y los resultados son fáciles de interpretar. El ensayo tiene limitaciones en el sentido de que se dirige a loci individuales dentro de cada tipo deSCC mec , pero no ofrece una tipificación completa de ccr y ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.
In Table 1, the Oligonucleotide sequence for Type III-F5 was updated from:
TTCTCATTGATGCTGAAGCC
To:
GAAACTAGTTATTTCCAACGG

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.

Erratum: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) ha adquirido e integrado en su genoma un elemento gen

<table><tbody><tr><td>Agar tríptico de soja</td><td>Fisher (BD)</td><td>CA90002-700 (236920)</td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada estéril</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq: incluye tampón de PCR 10x y 50 mM de MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>10966-034</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP</td><td>Life Technologies</td><td>10297-018</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Life Technologies</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>1Kb+ Escalera de ADN Vida</td><td> Tecnologías</td><td>10787-026</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tubos de microcentrífuga </td><td>VWR (Axygen Scientific)</td><td>10011-700</td><td></td></tr><tr><td>Varillas de cultivo</td><td>VWR</td><td>CA10805-018</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR</td><td>Diamed</td><td>AD0210-FCN (nuevo #: DIATEC420-1250)</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5417c</td><td></td></tr><tr><td>Bloque calefactor</td><td>VWR</td><td>13259-030 / 13259-286</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Applied Biosystems (2720)</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de electroforesis de gel sumergible horizontal con molde de gel</td><td>BioRad</td><td>170-4469</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación</td><td>BioRad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>Agitador basculante</td><td>VWR</td><td>40000-300</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Generador de imágenes Gel Doc System</td><td>BioRad</td><td>1708170</td><td></td></tr></tbody></table>

multiplex pcr ensayo para la tipificaci

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Este M-PCR actualizado es capaz de determinar (clasificar) los tipos I-V de SCCmec, así como los principales subtipos de SCCmec IV. El ensayo tiene como dianas loci únicos y específicos de SCCmec I, II, III, IVa, IVb, IVc, IVd, IVE y V, con detección simultánea del gen mecA. También es posible una identificación tentativa de SCCmec VI y VIII, aunque se requeriría una prueba adicional para confirmarla. Figura 3 ilustra representaciones típicas de SCCmec</em...

Demostramos un ensayo de PCR multiplex simple para el cribado y tipaje rápidos de los tipos I-V del cromosoma de casete estafilocócico (SCCmec) para el Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, y proporcionamos algunos de los pasos vitales y matices de procedimiento que lo hacen exitoso para adaptar este ensayo a laboratorios individuales.

Multiplex PCR Ensayo para la tipificaci

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar el tipo de MEC SCC de aislamientos de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina o MRSA, utilizando un ensayo de PCR múltiple. Esto se logra primero aislado el ADN de las cepas, mediante una técnica de extracción rápida y sencilla que implica el calentamiento de las células bacterianas en agua. El segundo paso consiste en realizar un ensayo de PCR múltiple con el fin de amplificar dianas específicas para cada uno de los tipos de MEC SE.A continuación, los productos de PCR se separan mediante electroforesis en gel AROS. El último paso consiste en teñir el gel para la visualización del ADN y el análisis de datos. En última instancia, la combinación única de productos de PCR específicos obtenidos con este ensayo de PCR múltiple se utiliza para determinar los tipos de cmec-SE de los aislamientos de MRS A. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como los esquemas tradicionales de tipificación S CEC, que dirigen complejos genéticos individuales de CCR y MEC y requieren múltiples tubos de PCR individuales, es que este proceso simplifica enormemente la carga de trabajo y puede realizarse en un solo

multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un método de bajo costo, de alto rendimiento para la detección simultánea de hasta 43 blancos moleculares se describe. Las solicitudes de MPCR / RLB son la tipificación de microorganismos y la detección de múltiples patógenos de muestras clínicas.

Multiplex PCR y Blot Línea ensayo de hibridación reversa (MPCR / RLB)

Se describe una técnica de PCR múltiple para la detección rápida de Salmonella enterica serovar Enteritidis, Hadar, Heidelberg, y Typhimurium. Serotipos de Salmonella específicos se pueden identificar por objetivo una PCR múltiple para los genes y las secuencias únicas para el grupo O-antígeno de la biosíntesis y la flagelina de un serotipo determinado. Serovar se le asignó a un aislamiento de Salmonella basado en la apariencia de los amplicones específicos de tamaño, (producto de PCR),...

Una PCR para la identificación de Allelotyping Salmonella enterica Serotipos Enteritidis, Hadar, Heidelberg, y Typhimurium

Se describe un método multiplex para la detección de microorganismos en una muestra utilizando oligonucleótidos junto perlas fluorescentes. Amplificación de todos los organismos dentro de una muestra se hibridó con un panel de cuentas, junto sonda. Un instrumento Luminex o Bio-Plex se utiliza para consultar cada cuenta para el tipo de cuentas y la señal de hibridación.

Multiplex detección de bacterias en el complejo de muestras clínicas y ambientales utilizando oligonucleótidos de acoplamiento de microesferas fluorescentes

Biosensores fagos líticos y los granos de anticuerpos son capaces de discriminar entre resistente a la meticilina (MRSA) y la bacteria estafilococo sensibles. Los fagos se inmovilizaron mediante un método de Langmuir-Blodgett sobre una superficie de un sensor de microbalanza de cristal de cuarzo y trabajaron como amplias sondas estafilococo gama. Perlas de anticuerpos reconocen SARM.

Biosensor para la detección de antibióticos Las bacterias estafilococo resistentes

Un microarray de la amplificación de PCR asimétrica combina la amplificación y la hibridación de microarrays en una sola cámara, lo que simplifica significativamente microarrays de flujo de trabajo para el usuario final. La simplificación de los microarrays de flujo de trabajo es un primer paso necesario para la creación de diagnósticos basados ​​en microarrays que se pueden utilizar de forma rutinaria en los entornos más bajos recursos.

Demostración de un resistente a múltiples fármacos<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Microarray Amplificación

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Screening productos alimenticios para la Clase 1 integrones y Gene Cassettes

Aquí, el espaciador ribosómico PCR (RS-PCR) se utiliza junto con un sistema de electroforesis miniaturizado como un método rápido y de alta resolución para el genotipado de S. aureus a costos moderados que permiten un alto rendimiento.

genotipado de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; por Ribosómica espaciador de PCR (RS-PCR)

Presentamos dos kits internos de RT-qPCR de un solo paso basados en sondas para virus respiratorios comunes. El primer ensayo es para SARS-CoV-2 (N), influenza A (H1N1 y H3N2) e influenza B. El segundo es para SARS-Cov-2 (N) y MERS (UpE y ORF1a). Estos ensayos se pueden implementar con éxito en cualquier laboratorio especializado.

Desarrollo de ensayos multiplex de RT-qPCR en tiempo real para la detección de SARS-CoV-2, influenza A/B y MERS-CoV

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