Name: MicroRNA In situ Hybridisierung für Formalin fixiert Nierengewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-30T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Lernen Sie die In-situ-Hybridisierung zur Detektion von microRNA in formalinfixiertem Nierengewebe. Diese Methode ermöglicht die Lokalisierung und Quantifizierung von microRNA in verschiedenen Nephronsegmenten.

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Diese Arbeit wurde vom US-amerikanischen National Institutes of Health und gewährt HL082798 HL111580.

1. Nierengewebeschnitten <ol><li> Formalin-fixierte (10%) und in Paraffin eingebetteten Nierenschnitte auf Objektträger mit 5 mm Dicke mit einem Microm HM 355 S. Die Folien können mehrere Monate vor der Analyse gelagert werden geschnitten. </li></ol> 2. Herstellung der Lösung <ol><li> Bereiten 1 l 1x PBS in ddH 2 O in einer autoklavierbar Schraubverschluss der Flasche. Füllen Sie eine Flasche mit 1 l ddH 2 O. 1 ml DEPC zu jeder Flasche, Deckel und kräftig schütteln. Lassen Sie die Lösungen sitzen über Nacht bei Raumtemperatur auf RNAsen zu zerstören und dann im Autoklaven. 400 ml Tween-20 zu 1 l 1x PBS auf PBS-T zu machen. </li><li> Vorbereitung Proteinase K Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 1 mM CaCl 2 in DEPC-behandeltem Wasser). </li><li> Eine Lösung aus 0,2% Glycin in PBS-T. </li></ol> 3. Gewebepräparation <ol><li> Vorbereitung einer großen Anzahl von Hybridisierungspuffer (50-100 ml), 50% Formamid, 5x SSC, 0,1% Tween, 9,2mM Zitronensäure zur Einstellung auf pH 6, 50 ug / ml Heparin und 500 ug / ml Hefe-RNA in DEPC-behandeltem ddH 2 O. Teilen Sie sich in 1 ml Aliquots und bei -80 º C. </li><li> Entfernen Sie das Paraffin aus dem Gewebe durch Waschen 3x in frischem Xylol für jeweils 5 min. </li><li> Rehydrierung der Gewebeschnitte von 5 min Inkubation in abnehmenden Konzentrationen von Ethanol (100%, 75%, 50% und 25%) in ddH 2 O. </li><li> Behandeln Sie die Folien mit DEPC genug, um die Gewebeschnitte (etwa 0,4-0,5 ml) für 1 min vollständig zu bedecken. Stellen Sie sicher, Gewebe trocknen nicht aus. </li><li> Spülen Sie die Folien in DEPC behandeltem PBS-T zweimal 5 min, das Sammeln der DEPC haltige Abfälle zur ordnungsgemäßen Entsorgung. Alle Reagenzien sollten DEPC behandelt werden, um RNAsen von diesem Zeitpunkt an zu beseitigen. </li><li> Vorwärmen Proteinase K Puffer und fügen Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von 10 ug / ml. Bedeckung Gewebeschnitte mit Proteinase K-Lösung und Inkubation bei 37 º C für 5 min. </li><li> Entfernen Sie schnell die proteinasE-K-Lösung und mit 0,2% Glycin in PBS-T für 30 sek. </li><li> Rinse Folien in DEPC behandeltem PBS-T zweimal für jeweils 30 Sekunden. </li><li> Fix Abschnitte in frisch zubereiteten 4% Paraformaldehyd für 10 min. </li></ol> 4. Kreuzung <ol><li> In 50 ul Hybridisierungspuffer (50% Formamid, 5x SSC, 0,1% Tween, 9,2 mM Zitronensäure zur Einstellung auf pH 6, 50 ug / ml Heparin, 500 ug / ml Hefe-RNA) pro Gewebeschnitt und decken mit RNAse frei HybriSlips schneiden nur größer als die Gewebeschnitten. </li><li> Prehybridize Abschnitte der Luftfeuchtigkeit gesteuert Hybridisierungsofen für 2 Stunden bei Hybridisierungstemperatur für die 3 &#39;mit Digoxigenin markierten Sonde (in der Regel DNA Tm der Sonde bestimmt -21 ° C (dh, 54 ° C für miR-382, DNA-Sonde Tm = 75 ° C ), unter Verwendung von Gewebelabor Tücher in 50% formamide/50% 5x SSC eingeweicht, um die Kammer zu halten befeuchtet. </li><li> Verdünnen Sie die miRNA-Sonde, positive Kontrolle (U6, small nuclear RNA) und Negativkontrolle (RühreiSequenz) bis 40 nm in Hybridisierungspuffer (75 ul Puffer pro Sektion erforderlich). </li><li> Erwärmen die Sonde in Hybridisierungspuffer bei 65 º C für 5 min. </li><li> Objektträger aus der Hybridisierungsofen und Deckgläser und überschüssige Hybridisierungspuffer entfernen Prähybridisierung. </li><li> In 75 ul der Sonde, die Puffer pro Gewebeschnitt, direkt auf Gewebe. Decken Gewebe mit HybriSlips gerade groß genug, um die Gewebeschnitte zu decken. </li><li> Keeping Diahalter Ebene zurück zu Hybridisierungsofen für Inkubation über Nacht bei einer Temperatur von Schritt 4.2 (ca. 16 h). </li></ol> 5. Die Stringenz Wash <ol><li> In 200 ul 2x SSC, erhitzt, um die Hybridisierungstemperatur, knapp eine Kante der Deckgläser zu helfen, das Deckglas aus dem Gewebe. Entfernen Sie das Deckglas durch Kippen der Folie. </li><li> Waschen der Objektträger in 200 ul 50% Formamid, 50% 2 × SSC bei Hybridisierungstemperatur 3x je 30 min. </li><li> Spülendie Schieber 5x in PBS-T bei Raumtemperatur für jeweils 5 min auf Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit. </li></ol> 6. Entdeckung <ol><li> Inkubieren Folie in Blockierungspuffer (2% Ziegen-oder Pferdeserum, 2 mg / ml BSA in PBS-T) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit. </li><li> Verdünnter Anti-DIG-AP Fab-Fragmenten in Blockierungspuffer bei 1:100. 100 l pro Gewebeschnitt und decken mit HybriSlips schneiden gerade groß genug, um den Abschnitt zu decken. </li><li> Inkubieren-Antikörper in einer befeuchteten Kammer bei 4 ° C über Nacht (ca. 16 h). </li><li> In PBS-T 7x Waschen der Objektträger für 5 Minuten auf jeder Orbitalschüttler bei niedriger Geschwindigkeit. </li><li> Waschen der Objektträger in AP-Puffer (100 mM TrisHCl pH 9,5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20) 3x für jeweils 5 min. </li><li> In NBT / BCIP Lösung AP-Puffer (200 ml μl/10 Puffer) </li><li> In 400 bis 500 ml verdünnt NBT / BCIP-Lösung zu jeder Folie, um alle Gewebeschnitte vollständig zu bedecken. Entwickeln Sie in einem dunklen, Niveau, humidified Kammer für 4-5 Std. </li></ol> 7. Montageschienen <ol><li> Dehydratisieren Abschnitte in steigenden Konzentrationen von Ethanol (25%, 50%, 75%, 100%) für jeweils 5 min. </li><li> Inkubation in Xylol 5x, um Abschnitte zu löschen. </li><li> Berg rutscht in Permount Montagemedium und über Nacht trocknen. </li></ol>

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<li>Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNA+profiling+in+kidney+and+bladder+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers.</a> Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).</li>
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<li>Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+miRNAs+in+animal+embryos+using+LNA-moidified+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes.</a> Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).</li>
<li>Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).</li>
<li>Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-382+targeting+of+kallikrein+5+contributes+to+renal+inner+medullary+interstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis.</a> Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).</li>
</ol>

Es gibt nichts zu offenbaren.

Das Ziel dieses Artikels war es, ein Protokoll für die miRNA-in-situ-Hybridisierung, die gut funktioniert in Formalin fixiert Nierengewebe zu beschreiben. Während der Erarbeitung dieses Protokoll mehrere wichtige Quellen der Färbung Artefakt identifiziert worden. Besondere Aufmerksamkeit auf diese Punkte können zur Vermeidung Färbung Artefakt und erhöhen die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen ISH Sicht. Eines der am meisten vermeidbaren Ursachen der Färbung Artefakt kann auftret...

MicroRNA sind kleine (ca. 22 Nukleotide lange) nicht-kodierenden RNAs, die endogen produziert werden. Sie funktionieren in der Regel um die Proteinexpression durch translationale Repression oder mRNA-Abbau zu unterdrücken. miRNAs binden an mRNA Ziele mit unvollständigen Komplementarität, die es ermöglicht, eine einzelne miRNA auf mehrere Ziele zu unterdrücken. Zu verstehen, welche Zelltypen und Strukturen auszudrücken miRNAs ist ein wichtiger Teil der das Verständnis der Mechanismen, durch die Veränderungen in der miRNA-Expression Einfluss Zell-und Gewebe Phänotypen. Während Methoden wie miRNA-Sequenzierung, qPCR und Northern Blot zur Detektion von miRNAs in ganzen Gewebe verwendet werden, ist dieser Ansatz nicht erlauben es, festzustellen, welche spezifischen Zelltyp sie innerhalb eines bestimmten Gewebes kam. Dissection von zellulären und strukturellen Komponenten vor der Analyse mit Hilfe dieser Methoden kann sehr schwierig sein, und die benötigt wird, um angemessene Bedingungen Isolierungen erreichen können, um al führenterations in der Genexpression oder den Abbau von RNAs. microRNA in-situ-Hybridisierung ist eine Methode verwendet, um Standort-und microRNA-Expressionsniveaus im Gewebe sichtbar zu machen. Diese Technik ist besonders in Geweben von heterogenen Strukturen, wie z. B. der Niere zusammen wertvoll. MicroRNAs sind gezeigt worden, um eine regulatorische Rolle bei der Nierenentwicklung 2,3 und Physiologie 4 zu spielen. microRNA Expression Änderungen haben auch gezeigt, dass mit Nierenpathologie wie Fibrose 5-10, diabetische Nephropathie 7, Nierenkarzinom 11,12 und akutem Nierenversagen 13 einbezogen werden. In unserer Forschung haben wir festgestellt, dass die Optimierung microRNA in-situ-Hybridisierung für Nierengewebe war wertvoll für die Ermittlung der genauen Struktur Standorte der miRNA-Expression sowohl in Gesundheit und Krankheit 14. Bestimmung der Rohr und zelluläre Expression verschiedener microRNAs ist wichtig, weil die Regulierung der targets kann von zellulären Funktionen sein. In Krankheitszuständen ist es auch wichtig, um zu bestimmen, wie Veränderungen in der miRNA-Expression beeinflussen werden Funktion. Das Ziel der hier beschriebenen Methode war, auf den bestehenden Methoden, die von ISH Kloosterman et al. 15. andere Forscher entwickelt 16,17 zu bauen, und die von Exiqon 1 vorgeschlagen und Optimierung der Methode zur Formalin fixiert Nierengewebe. Wir haben erfolgreich diese Methode verwendet, um regionale Unterschiede in der Nieren microRNA miR-382 Expression mit einseitiger Ureterobstruktion 18 zu identifizieren. Dieser Ansatz kann mit anderen Geweben als auch verwendet werden, mit zusätzlichen Optimierung.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl Pyrocarbonat</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xylole</td><td>Sigma</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Ultra Pure</td><td>200CSPTP</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Lebensdauer Technologies</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C2536</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>J.T. Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC Puffer</td><td>Life Technologies</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>SAGENT</td><td>25021-400-30</td><td></td></tr><tr><td>Hefe-RNA</td><td>Life Technologies</td><td>AM7118</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-1004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG-miRNA-Sonde</td><td>Exiqon</td><td>miR abhängig-05</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- Verschlüsselte miR-Sonde</td><td>Exiqon</td><td>99004-05</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG-U6 miR Sonde</td><td>Exiqon</td><td>99002-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Ab Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Fisher</td><td>Fit an Gewebegröße</td><td></td></tr><tr><td>Microtom HM 355 S</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-672</td><td></td></tr><tr><td>In-Slide-Out-Hybridisierungsofen</td><td>Boekel</td><td>241000</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium-Tablettbaugruppe</td><td>Boekel</td><td>C2403973</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl-Rack-Einsatz</td><td>Boekel</td><td>C2403754</td><td></td></tr></tbody></table>

microrna<em&gt; in situ</em&gt; hybridisierung für formalin fixiert nierengewebe

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur kolorimetrischen Nachweis von miRNA in der Niere durch in-situ-Hybridisierung mit Digoxigenin markierten Sonden microRNA. Dieses Protokoll, das ursprünglich von Kloosterman und Kollegen für eine breite Verwendung mit Exiqon miRNA Sonden 1 entwickelt, wurde modifiziert, um Herausforderungen in der miRNA-Analyse im Nierengewebe zu überwinden. Dazu gehören Themen wie Identifikation und Struktur schwer zu Rest Sonde und Antikörper zu entfernen. Die Verwendung von relativ dünnen, 5 mm dick, Gewebeschnitte erlaubt für klare Visualisierung von Nieren Strukturen, während eine starke Probe-Signal wurde in den Zellen zurückgehalten. Zusätzlich wurden Sondenkonzentration und Inkubationszeit Bedingungen optimiert, um die Visualisierung von microRNA Expression mit niedrigen Hintergrund und unspezifische Signal zu erleichtern. Hier wird die optimierte Protokoll beschrieben, im Anfangsgewebeentnahme und Vorbereitung durch die Montage der Schieber am Ende des Verfahrens. Die Grund components dieses Protokoll kann für die Anwendung auf anderen Geweben und Zellkulturmodelle verändert werden.

Die Bereiche von einem Gewebeschnitt, die während der Hybridisierungen, Inkubationen getrocknet werden oder Waschschritte der Regel am Ende dunkler Färbung während der NBT / BCIP Entwicklung. Abbildung 1 zeigt einen Teil einer Niere Abschnitt, in dem die HybriSlip rutschte der Kante das Gewebe, so dass sie teilweise dehydriert. Trotz Rehydrierung und Abdeckung in den verbleibenden Schritten wird das Signal in dem entwässerten Teil künstlich hoch. Die Bedeutung der Steuerung ...

Dieser Artikel beschreibt ein in situ-Hybridisierungsprotokoll für die kolorimetrische Detektion der microRNA Expression in Formalin fixiert Nierenschnitten optimiert.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung für Formalin fixiert Nierengewebe

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Lokalisation und Quantifizierung der Expression von Mikro-RNA in Nierengeweben durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein digoxigeninmarkierter Sondenstrang an eine bestimmte Mikro-RNA im Nierengewebe hybridisiert wird. Im zweiten Schritt wird ein Antikörper gegen Digoxigenin, der mit alkalischer Phosphatase konjugiert ist, mit dem Gewebe inkubiert.Anschließend wird ein N-B-T-B-C-I-P-Substrat zum Gewebe gegeben, um die Lokalisation der Mikro-RNA durch die Entstehung eines blauen Farbprodukts an den Stellen der hybridisierten Mikro-RNA-Sonden sichtbar zu machen. Die Ergebnisse zeigen, an welchen Stellen Mikro-RNAs in Nierenregionen und Nephronabschnitten exprimiert werden, basierend auf der Hybridisierung komplementärer Mikro-RNA-Sonden. Dieses Verfahren verwendet formalinfixierte, paraffineingebettete Nierenschnitte, die in einer Dicke von fünf Mikrometern auf Objektträger aufgebracht wurden. Um die Nierenschnitte für die Analyse vorzubereiten, entfernen Sie zunächst das Paraffin aus dem Gewebe durch drei Waschungen mit frischem Xylol je fünf Minuten lang.Rehydrieren Sie die Gewebeschnitte jeweils fünf Minuten lang durch Inkubation in abnehmenden Konzentrationen von Ethanol in doppelt destilliertem Wasser. Behandeln Sie die Objektträger danach mit ausreichend Dathyl, Percarbonat oder Desy, um die Gewebeschnitte vollständig zu bedecken, und lassen Sie dies eine Minute einwirken. Achten Sie darauf, dass die Gewebeproben nicht austrocknen.Entfernen Sie das Desy und spülen Sie die Objektträger zweimal fünf Minuten lang in mit Dessy behandeltem PBST. Stellen Sie sicher, dass das Desy-haltige Abfallmaterial zur ordnungsgemäßen Entsorgung gesammelt wird.Ab diesem Zeitpunkt sollten alle Reagenzien dsy-behandelt sein. Um RNA abzubauen, Proteinase K zum vorgewärmten Proteinase-K-Puffer in einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter zugeben. Die Gewebeschnitte mit der Proteinase-K-Lösung bedecken und 5 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Proteinase-K-Lösung schnell entfernen und 0,2 % Glycin in PBST 30 Sekunden lang zugeben.Spülen Sie die Objektträger in Desy behandeltem PBST zweimal für jeweils 30 Sekunden. Schließlich fixieren Sie die Gewebeschnitte 10 Minuten lang in frisch hergestelltem 4 % Paraformaldehyd.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie 50 Mikroliter Hybridisierungspuffer pro Gewebeschnitt hinzufügen und diesen mit RNase-freien Deckgläsern bedecken, die geringfügig größer als die Gewebeschnitte sind. Stellen Sie die Objektträger in eine Kammer, die durch in 50 % Formamid und 50 % 5× SSC getränkte Laborlappen befeuchtet wird. Prähybridisieren Sie die Gewebeschnitte, indem Sie die befeuchtete Kammer zwei Stunden lang in einen Ofen bei der für die 3′-digoxigeninmarkierte Sonde bestimmten Hybridisierungstemperatur stellen. Die Hybridisierungstemperatur für die Sonde liegt gewöhnlich 21 Grad Celsius unter der DNA-Schmelztemperatur oder TM der Sonde.Beispielsweise beträgt die Hybridisierungstemperatur für die bloße 3 82-Sonde 54 Grad Celsius, da ihr TM-Wert 75 Grad Celsius beträgt. Bereiten Sie die micro-RNA-Sonde sowie die positiven und negativen Kontrollen vor, indem Sie jede Probe auf 40 Nano molar in Hybridisierungspuffer verdünnen. Die positive Kontrolle ist die U-sechs-kleine nukleäre RNA, die negative Kontrolle ist eine zufällig angeordnete Sequenz.Erhitzen Sie die Sonde und die Kontrollen fünf Minuten lang auf 65 Grad Celsius. Entfernen Sie die Objektträger aus dem Hybridisierungs-Ofen. Entfernen Sie die Hybridisierungsdeckel und überschüssiges Hybridisierungspuffer aus der Vor-Hybridisierungs-Anordnung.Geben Sie 75 µL Puffer mit der Sonde direkt auf jeden Gewebeschnitt. Bedecken Sie die Schnitte mit Hybriddeckgläsern, die wiederum gerade groß genug sind, um die Gewebeschnitte zu bedecken. Halten Sie den Objektträger waagerecht. Bringen Sie die Objektträger zurück in den Hybridisierofen bei der geeigneten Temperatur. Inkubieren Sie sie über Nacht für etwa 16 Stunden. Sobald die Hybridisierung abgeschlossen ist, nehmen Sie die Objektträger aus dem Hybridisierofen heraus.Fügen Sie 200 µL zweifach konzentrierter SSC-Lösung, die auf die Hybridisierungstemperatur erhitzt wurde, unter eine Kante der Deckglasabdeckung hinzu, um das Freilösen des Deckglases vom Gewebe zu unterstützen. Entfernen Sie das Deckglas, indem Sie die Objektträger neigen. Nachdem die Deckgläser entfernt wurden, waschen Sie die Objektträger dreimal je 30 Minuten lang mit jeweils 200 µL 50 %iger Ameisamidlösung in zweifach konzentrierter SSC-Lösung bei der festgelegten Hybridisierungstemperatur.Die Objektträger fünfmal nacheinander jeweils fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit PBST auf einem Rüttler mit niedriger Geschwindigkeit spülen. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Objektträger eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Rüttler mit niedriger Geschwindigkeit in Blockpuffer inkubieren. Nach einer Stunde 100 Mikroliter anti-dig AP-FAB-Fragmente zu jedem Gewebeschnitt hinzufügen und mit Deckgläsern abdecken.Schneiden Sie die Folie gerade groß genug, um den Bereich abzudecken. Inkubieren Sie die Objektträger über Nacht oder etwa 16 Stunden am folgenden Tag in einer feuchten Kammer bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Objektträger siebenmal bei Raumtemperatur jeweils fünf Minuten lang in PBST auf einem Rüttler mit niedriger Geschwindigkeit.Als Nächstes waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten in AP-Puffer. Bereiten Sie die N-B-T-B-C-I-P-Entwicklerlösung vor, indem Sie 200 Mikroliter N-B-T-B-C-I-P-Lösung zu 10 Milliliter AP-Puffer hinzufügen. Geben Sie 400 bis 500 Mikroliter der verdünnten N-B-T-B-C-I-P-Lösung auf jeden Objektträger, um alle Gewebeschnitte vollständig zu bedecken.Entwickeln Sie in einer dunklen, feuchten Kammer vier bis fünf Stunden bei Raumtemperatur, sobald die cholemetrische Detektion abgeschlossen ist. Dehydrieren Sie die Schnitte in aufsteigenden Konzentrationen von Ethanol jeweils fünf Minuten lang und klären Sie die Schnitte durch fünf Inkubationen in Xylol jeweils fünf Minuten lang. Schließlich decken Sie die Objektträger mit Permount-Montiermedium auf und lassen sie über Nacht trocknen.Es ist entscheidend für den Erfolg dieses In-situ-Hybridisierungsprotokolls, dass der Gewebeschnitt nicht austrocknet. Der linke Teil dieser Abbildung zeigt einen Ausschnitt eines Nierenschnitts, bei dem der Hybridisierungsdeckel von der Geweberand abgerutscht ist und dadurch eine teilweise Austrocknung ermöglichte. Trotz einer erneuten Befeuchtung und Abdeckung in den nachfolgenden Schritten ist das Signal im ausgetrockneten Bereich künstlich erhöht im Vergleich zu dem Bereich, der weiterhin vom Hybridisierungsdeckel bedeckt war.Die Kalibrierungsskala repräsentiert 100 Mikrometer in diesem Bild. Die Bedeutung einer Optimierung der Entwicklungszeit der N-B-T-B-C-I-P-Reaktion wird in den folgenden Abbildungen verdeutlicht. Darstellung A zeigt, dass Entwicklungszeiten von mehr als vier bis fünf Stunden zu ausgeprägter unspezifischer Farbentwicklung und verschwommenen Mikro-RNA-Kontrollsonden in Nierengewebe führen.Abbildung B zeigt, dass Inkubationen länger als vier bis fünf Stunden keine weitere Verbesserung des Signals bewirken, wenn Nieren auf hochgradig vorhandene Zielstrukturen wie die U-sechs-kleine nukleare RNA-Kontrolle untersucht werden. Diese aus einer früheren Studie adaptierten Abbildungen bestätigen die Anwendbarkeit dieser In-situ-Hybridisierungsmethode zur Nachweisung von mikro-RNAs im Nierengewebe. Abbildung A zeigt repräsentative Bilder der miR-3-82-Expression, die mittels In-situ-Hybridisierung in Nierschnitten von Mäusen mit oder ohne einseitige Harnleiterobstruktion (UUO) und behandelt mit entweder anti-miR-3-82 oder einer kontrollierten, verunzierten Sequenz (scrambled) erhalten wurden. Die UUO führte zu einer Erhöhung der miR-3-82-Expression, wie die intensivere Färbung im UUO- plus anti-scrambled-Gewebe im Vergleich zum Sham- plus anti-scrambled-Gewebe zeigt.Dieser Anstieg wurde durch die Behandlung mit Anti-ME 3 82 gehemmt. Die Diagramme im Panel B zeigen die ME 3 82-Expression von Scheinoperation plus Antis-scrambled behandelten Mäusen als prozentuale durchschnittliche integrierte optische Dichte. Als Maß für die Pixelintensität zeigt sich, dass UUO eine signifikante Zunahme der ME 3 82-Expression im äußeren und inneren Markbereich induziert, und Anti-ME 3 82 blockiert diesen Effekt.Dieser Anstieg kann vollständig durch mikro-RNA-in-situ-Hybridisierung sichtbar gemacht und gemessen werden. Diese Ergebnisse stimmen auch mit Ergebnissen aus Q-PCR-R überein, die hier nicht gezeigt werden, und deuten darauf hin, dass die Verwendung der INI-Zwei-Hybridisierung zur Detektion der Expression von mere-3-82 in formalinfixierten Nieren empfindlich genug ist, um quantifizierbare Ergebnisse zu liefern, die der auf qPCR-R basierenden Expressionsanalyse entsprechen. Zusätzlich ermöglicht die C-Zwei-Hybridisierung die Messung spezifischer regionaler Unterschiede in der Mikro-RNA-Expression innerhalb der Niere.

microrna-in-situ-hybridization-for-formalin-fixed-kidney-tissues

Research

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