Kultivierung und Pflege

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, C. difficile aus Stuhlproben zu isolieren, um C. difficile anzuzüchten, Glycerin-Stammlösungen für die Langzeitlagerung herzustellen und Sporenvorräte für eine Vielzahl nachgeschalteter Anwendungen vorzubereiten und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem C. difficile zunächst durch Ausplattieren auf einem selektiven Medium aus Stuhlproben isoliert wird. Der zweite Schritt besteht darin, C. difficile in flüssigem Medium zu kultivieren und langfristig C. difficile-Stämme in Glycerin zu lagern.

Anschließend wird C difficile aus gefrorenen Glycerinbeständen gewonnen und auf Agarplatten ausgestrichen. Im letzten Schritt werden C difficile-Sporenbestände hergestellt und abschließend anhand dieser Protokolle gezählt. C difficile kann auf verschiedenen Medien kultiviert werden, um seine Identität zu überprüfen und zu bestätigen, und lässt sich erfolgreich kultivieren und aufrechterhalten.

Diese Glycerin-Stämme und Kulturen können für zahlreiche nachgeschaltete Anwendungen verwendet werden, einschließlich Tierversuchen und weiteren molekularbiologischen Untersuchungen. Der Hauptvorteil der Verwendung einer Vinyl-anaeroben Kammer zur Kultivierung von c difficile im Vergleich zu anderen Methoden wie Kerzengefäßen besteht darin, dass eine strikt anaerobe Umgebung aufrechterhalten werden kann, was ein konsistentes und zuverlässiges Wachstum von c difficile ermöglicht. Im Allgemeinen können Personen, die neu in diesen Techniken sind, auf Probleme stoßen, die auf die eingeschränkte Beweglichkeit innerhalb der Kammer aufgrund der Handschuhe zurückzuführen sind, sowie auf die entscheidende Notwendigkeit, ihre Experimente im Voraus zu planen.

Den Ablauf dieser Verfahren wird ein Techniker aus meinem Labor, Jose Suarez, am Anfang demonstrieren. Dieses Verfahren kann unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden. Wiegen Sie zuerst die Stuhlprobe.

Dies ist zur Zählung von C difficile aus dem Stuhl notwendig. Anschließend den Stuhlproben in einem XPBS resuspendieren und vortexen, um sicherzustellen, dass die Stuhlprobe vollständig resuspendiert ist. Danach serielle Verdünnungen der resuspendierten Stuhlprobe in einem XPBS herstellen, um eine geeignete Isolierung oder Zählung der koloniebildenden Einheiten oder CFU pro Gramm Stuhl ab hier zu ermöglichen.

Führen Sie den Vorgang unter anaeroben Bedingungen durch, um sicherzustellen, dass die vegetativen Zellen von C difficile keiner Sauerstoffexposition ausgesetzt werden. Die anaerobe Kammer, die in diesem Experiment verwendet wird, wird bei 37 Grad Celsius gehalten. Unter aseptischen Bedingungen.

Tragen Sie 100 Mikroliter jeder seriellen Verdünnung auf Toro-Collat-Oxetan-, Cyclo-Seine-, Fructose-Agar- oder T-C-C-F-A-Platten auf. Diese Platten wurden mindestens ein bis zwei Stunden im anaeroben Schrank vorreduziert, um sicherzustellen, dass restliches Sauerstoff entfernt wurde. Zum Isolieren von Kolonien für eine genaue Zählung oder für andere nachgeschaltete Anwendungen.

Verwenden Sie eine sterile Inokulationsöse, um die aufgetragene Kultur gleichmäßig auf der Oberfläche der T-C-C-F-A-Platte zu verteilen. Inkubieren Sie die Platten anaerob für 48 Stunden bei 37 Grad Celsius. Identifizieren Sie C-difficile-Kolonien anhand ihres flachen, unregelmäßigen, mattglasartigen Erscheinungsbildes, um sicherzustellen, dass vegetative C-difficile nicht durch Sauerstoffexposition abgetötet werden.

Platten zur Isolierung von Kolonien für nachgeschaltete Anwendungen müssen stets innerhalb der anaeroben Kammer aufbewahrt werden. Zur Zählung der Kolonien können die Platten aus der anaeroben Kammer herausgenommen werden. Beachten Sie, dass vegetative C. difficile einmal außerhalb der Kammer dem Sauerstoff ausgesetzt sind und absterben werden.

Diese C difficile-Kolonien können nicht mehr gerettet werden, selbst wenn die Platte in die Kammer zurückgebracht wird. Zählen Sie die C difficile-Kolonien jeder Verdünnung und berechnen Sie die Anzahl der KBE pro Gramm Stuhlprobe, um C difficile anzuzüchten und Glycerin-Stöcke herzustellen. Verwenden Sie eine sterile Inokulationsnadel, um eine einzelne Kolonie aufzunehmen und auf eine vorreduzierte Brain-Heart-Infusion auszustreichen.

Versetzte Hefeextrakt- oder BHIS-Agarplatte mit 0,03 % Cystein, ausstrich einzelne Kolonien und Quadranten unter Verwendung eines neuen sterilen Inokulationsöschers für jeden Quadranten. Inkubiere die Platten anaerob bei 37 Grad Celsius für 16 bis 24 Stunden. Sobald isolierte Kolonien auf den BHIS-Agarplatten erscheinen, wähle eine einzelne isolierte Kolonie aus und resuspendiere die Kolonie in 10 Milliliter vorreduziertem BHIS-Flüssigmedium, ergänzt mit 0,03 % L-Cystein, und inkubiere über Nacht.

Unter anaeroben Bedingungen bei 37 Grad Celsius oder bis die Kultur trüb wird. Am folgenden Tag 333 Mikroliter 50 % Glycerin und 666 Mikroliter der C. difficile-Kultur in ein 1,8-Milliliter-Kryoröhrchen geben. Um einen 15 %igen Glycerinbestand der isolierten Stammes zu erzeugen, das Kryoröhrchen fest verschließen und mischen.

Entnehmen Sie den Stamm unverzüglich aus der anaeroben Kammer und lagern Sie ihn zur Langzeitkonservierung bei minus 80 Grad Celsius ein. Um dieses Verfahren zu beginnen, nehmen Sie die gefrorene Glycerin-Stammlösung von C. difficile aus dem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius heraus. Um ein Auftauen zu verhindern.

Stellen Sie die gefrorene Glycerin-Stammlösung sofort in ein Kühlgestell, das vor der Verwendung bei minus 80 Grad Celsius gelagert wurde. Bringen Sie die gefrorene Glycerin-Stammlösung im Kühlgestell unter Verwendung aseptischer Technik und eines sterilen Inokulationsöls in die anaerobe Kammer. Geben Sie eine kleine Menge der Stammlösung auf die Platte und stricheln Sie sie über ein Viertel der Platte.

Drehen Sie die Platte um 90 Grad und streichen Sie mit einer neuen sterilen Inokulationsnadel über das zweite Viertel. Wiederholen Sie dies für das dritte und vierte Viertel, um die Isolierung einzelner Kolonien sicherzustellen. Entfernen Sie unverzüglich die gefrorene Glycerin-Stammlösung aus der anaeroben Kammer und bringen Sie sie in den minus 80 Grad Celsius tiefen Gefrierschrank zurück.

Die Platte anaerob bei 37 Grad Celsius über Nacht inkubieren, um Sporen aus der C. difficile-Kultur zu gewinnen. Stämme von gefrorenem Glycerinbestand auf vorreduzierten BHIS-Platten ausstreichen. Gemäß dem Verfahren, das im vorherigen Abschnitt demonstriert wurde.

Inkubieren Sie am folgenden Tag über Nacht anaerob bei 37 Grad Celsius. Überimpfen Sie einzelne Kolonien in mehrere vorreduzierte 70-30-Platten. Inkubieren Sie anaerob bei 37 Grad Celsius für 24 bis 48 Stunden.

Nachdem sich die Sporen gebildet haben, nehmen Sie die Platten aus der anaeroben Kammer. Schaben Sie die Platten mit einer sterilen Inokulationsnadel ab und resuspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter steriler 1× PBS. Entsorgen Sie die Platten und pelletieren Sie die Zellen bei 3000 ×g für 15 Minuten.

Entfernen Sie den Überstand, geben Sie ein Milliliter 1× PBS zum Resuspendieren hinzu, suspendieren und pelletieren Sie erneut auf diese Weise. Waschen Sie die Zellen zweimal in PBS und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius, um am folgenden Tag die Lyse vegetativer und Mutterzellen zu unterstützen; anschließend inkubieren Sie 20 Minuten bei 70 Grad Celsius, um eventuelle verbliebene vegetative Zellen abzutöten. Zur Bestimmung der Koloniebildenden Einheiten pro Milliliter verdünnen Sie jede Sporenpräparation seriell in 1× PBS und impfen Sie auf vorreduziertes BHIS-Plattenmedium mit 0,1 % Natrium-Taurocholat aus. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für mindestens 24 Stunden, bevor Sie die Kolonien zählen.

Sporen können in einem XPBS entweder bei Raumtemperatur für die kurzfristige Lagerung oder bei vier Grad Celsius für die langfristige Lagerung aufbewahrt werden. A. Ein Beispiel von C difficile, das auf BHIS und Columbia anaerobem Schafsblut-Agar gezüchtet wurde, ist hier zu sehen.

C difficile bildet unregelmäßige Kolonien, die flach sind und ein mattglasartiges Aussehen aufweisen, das auf beiden Medien erkennbar ist. Abbildung A zeigt einen Erythromycin-empfindlichen klinischen Isolatstamm von C difficile 630 E, der 24 Stunden lang auf BHIS-Agar, einem angereicherten nichtselektiven Medium, gezüchtet wurde. Bei 37 Grad Celsius erscheinen die Kolonien auf Columbia-anaerobem Schafsblutagar, wie in Abbildung B gezeigt, unter weißem Licht ähnlich wie die auf BHIS gezüchteten Kolonien.

Jedoch ermöglicht die Verwendung dieses Mediums auch die Detektion der grünlichen oder zitronenfarbenen Fluoreszenz, die C difficile unter langwelligem ultraviolettem Licht zeigt, wie in Panel C nach diesem Verfahren dargestellt. Weitere Methoden wie Wachstumskurven in flüssigem Medium, Isolierung von DNA und RNA, Kolonieisolierung, PCR und andere molekularbiologische Techniken sowie Manipulationen, die für C difficile geeignet sind, sowie die Verwendung von C difficile-Sporen für Tierversuche können durchgeführt werden, um zusätzliche molekularbiologische Fragestellungen zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man C difficile-Vegetativzellen und -Sporen in einer anaeroben Umgebung isoliert, kultiviert und aufrechterhält.

Vergessen Sie nicht, dass C difficile ein human- und tierpathogener Erreger ist, der gastrointestinale Erkrankungen verursachen kann. Experimente mit C difficile müssen unter geeigneten Bedingungen der Biosicherheitsstufe zwei durchgeführt werden.