Studieren Wechselwirkungen von Staphylococcus aureus Mit Neutrophilen durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie Zeitraffer

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Auswirkungen von Staphylokokken-Phenol, löslichem Modlin oder PSMs auf menschliche Neutrophile zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst Neutrophile aus menschlichem Blut isoliert werden, um sie anschließend in vitro zu analysieren. Als nächstes werden die Neutrophilen entweder mit Fluoreszenzfarbstoff beladen und mit einer Konzentrationsreihe von PSMs mit und ohne Inhibitoren gemischt, oder sie dürfen S reus-Bakterien, die ein PSM-alpha-Promotor GFP-Reporterkonstrukt enthalten, phagozytieren.

Letztendlich kann die Aktivierung der Neutrophilen durch PSM-Stimulation durch Durchflusszytometrie und die Expression von GFP durch die Phagozytosierten überwacht werden. Bakterien können mit dieser Methode durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert werden. Sie können die Auswirkungen von Staphylokokken, Phenyl, Soja, Molinen oder Neutrophilen untersuchen.

Natürlich kann diese Methode auf viele andere Zelltypen, Stimuli und Antagonisten angewendet werden. Wir hatten die Idee für den Mikroskopie-Teil dieser Methode, als wir über eine Möglichkeit diskutierten, die Auswirkungen von PSMs in Neutrophilen zu beobachten. Die Verwendung eines bakteriellen GFP-Expressionskonstrukts und der Zeitraffermikroskopie ermöglicht es uns, genau das zu tun.

Nachdem Sie fünf Röhrchen mit heparinisiertem venösem Blut entnommen haben, gießen Sie 12 Milliliter einer Fial-Lösung mit einer Dichte von 1,119 Gramm pro Milliliter in ein 50-Milliliter-Röhrchen und überlagern Sie dann vorsichtig 10 Milliliter einer FI-Call-Lösung mit einer Dichte von 1,077 Gramm pro Milliliter. Als nächstes verdünnen Sie das Blut mit dem gleichen Volumen PBS und schichten Sie vorsichtig 20 bis 25 Milliliter Blut auf jeden Doppelschicht-Fi-Call-Gradienten. Die Gradienten werden 20 Minuten lang bei 396 mal G und 22 Grad Celsius ohne Bruch zentrifugiert.

Verwenden Sie dann eine Vakuumpumpe, die mit einer sterilen Pipettenspitze ausgestattet ist, um die oberen gelben Plasma- und PBMC-Schichten abzusaugen. Und dann die dritte weiße Schicht. Verwenden Sie nun eine kleine Kunststoffpipette, um die polymorphkernige Neutrophilen- oder PMN-Fraktion aus jedem Röhrchen in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen zu übertragen.

Geben Sie frisch zubereitetes, vorgekühltes PMI, ergänzt mit humanem Serumalbumin oder R-P-M-I-H-S-A, in jedes Röhrchen, um das Gesamtvolumen auf 50 Milliliter zu bringen. Schleudern Sie dann die Zellen herunter, saugen Sie den Überstand mit einer Vakuumpumpe ab und wirbeln Sie den roten Erythrozyten und das PMN-haltige Pellet vorsichtig vortexen. Geben Sie als Nächstes neun Milliliter steriles deionisiertes Wasser in die Zellen und starten Sie einen Timer.

Fügen Sie genau 30 Sekunden hinzu. Fügen Sie einen Milliliter 10-fach konzentriertes PBS hinzu, um den hyperosmotischen Schock zu stoppen. Waschen Sie dann die Zellen in einem Gesamtvolumen von 50 Millilitern kaltem R-P-M-I-H-S-A.

Nach dem Entfernen des Überstands fügen Sie jedem Gaumen einen Milliliter R-P-M-I-H-S-A hinzu, der nun aufgrund der Lyse der Erythrozyten weiß ist. Dann reanimation, durch Pipettieren suspendieren und die Pellets in einem Röhrchen kombinieren. Zählen Sie nun die Zellen und stellen Sie die Konzentration auf eins mal 10 auf die siebten Zellen pro Milliliter ein.

Laden Sie nun fünfmal 10 bis die sechsten Zellen pro Milliliter mit zwei mikromolaren Grippe oh 3:00 AM in R-P-M-I-H-S-A. Und decken Sie die Röhre mit Alufolie ab, um sie vor Licht zu schützen. Inkubieren Sie die Zellen anschließend 20 Minuten lang bei Temperatur unter Rühren.

Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine dreifache serielle Verdünnung des Stimulus bei der 10-fachen Endkonzentration vor. Dann inkubieren Sie 30 Mikroliter des Stimulus mit einem gleichen Volumen frisch zubereiteten 10-fach konzentrierten Inhibitors oder Puffers für 10 Minuten bei Raumtemperatur vor. Als nächstes waschen Sie die Zellen in 10 Millilitern R-P-M-I-H-S-A und resuspendieren die Zellen in frischem R-P-M-I-H-S-A bei fünfmal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter.

Verdünnen Sie die Zellen unmittelbar vor der Flussanalyse auf zweimal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in R-P-M-I-H-S-A und fügen Sie 200 Mikroliter Zellen pro Faxschlauch hinzu. Achten Sie darauf, die Zellen nicht durch Schütteln oder Pipettieren zu aktivieren, indem Sie das erste Röhrchen auf das Durchflusszytometer legen. Warten Sie drei Sekunden und starten Sie dann die Erfassung nach einem festgelegten Zeitraum, z. B. acht Sekunden, nehmen Sie das Röhrchen ab und geben Sie schnell 50 Mikroliter der niedrigsten Verdünnung des Stimulus in die Probe.

Laden Sie das Rohr sofort wieder ein und setzen Sie die Erfassung fort. Wenn eine Verdünnungsreihe beendet ist, waschen Sie die Nadel des Durchflusszytometers mit frischem R-P-M-I-H-S-A, bevor Sie eine neue Serie messen. Analysieren Sie die Daten nach dem Ausführen der letzten Probe mit einer Durchflusszytometrie-Analysesoftware, um die bakterielle GFP-Expression zu analysieren.

Nachdem die PMN-Phagozytose über Nacht einen S-ous Stamm, der das interessierende Reporterkonstrukt enthält, in der Brühe gezüchtet hat, wird das während der Nachtkultur exprimierte GFP entfernt, indem die Zellen auf OD 6 60 0 0,01 verdünnt werden. Erweitern Sie die Kultur auf OD 6 60 0 0.1. Verdünnen Sie die Zellen um eins bis 30 und überwachen Sie dann das Wachstum, bis die Kultur wieder einen OD sechs 60 von 0,1 erreicht.

Anschließend werden die Bakterien durch Zentrifugation gesammelt. Waschen Sie die Zellen einmal in DPBS und Resus. Setzen Sie die Kultur außer Kraft.

Addieren Sie eins zu 10 des ursprünglichen Volumens, um einen OD sechs 60 von 1,0 oder etwa fünfmal 10 bis zum achten KBE pro Milliliter zu erhalten. Mischen Sie nun die Bakterien mit dem frisch isolierten PNS in R-P-M-I-H-S-A im Verhältnis 10 zu eins. Geben Sie dann gepooltes Humanserum zu einem 10. Gesamtendvolumen des gepoolten Humanserums in der Zelllösung.

Stimulieren Sie die Phagozytose, indem Sie das Zellgemisch 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius schütteln. Verdünnen Sie dann die mit Bakterien beladenen PMNs auf fünfmal 10 bis fünfte Zellen pro Milliliter und überführen Sie 250 Mikroliter der Zellen in jede Vertiefung eines Abdeckglases mit acht Vertiefungen. Schließlich bilden Sie die Zellen auf einem inversen Mikroskop ab, das mit einem 40-fach-Objektiv ausgestattet und in einer dunklen Umgebungskammer eingeschlossen ist, und nehmen Sie alle fünf bis 10 Minuten Bilder an mehreren Stellen in den Deckglaskammern auf, sowohl im Hellfeld als auch im GFP-Kanal, um die bakterielle GFP-Produktion in Echtzeit zu verfolgen. Zellen, gemessen durch den Kalziumfluss.

Die Vorinkubation des PSM-alpha-3-Peptids mit 0,01 %, 0,1 % oder 1 % Humanserum hemmte signifikant die Fähigkeit des Stimulus, eine Kalziumreaktion auszulösen. Wieder dosisabhängig bei 1%Serum. Bei diesen PSM alpha drei Konzentrationen ist kaum eine Aktivierung sichtbar.

In diesen Bildern sind zwei Neutrophile zu sehen, die Phagozytosebakterien enthalten, die das A PSM alpha GFP-Reporterkonstrukt enthalten. Die Bakterien beginnen etwa eine Stunde nach der Phagozytose zu fluoreszieren, was auf die Expression von GFP aus dem PSM-Alpha-Promotor hinweist. Bakterien außerhalb der Neutrophilen fluoreszieren nicht, was darauf hindeutet, dass die PSM-alpha-Expression nur dann schnell eingeschaltet wird, wenn die Bakterien phagozytiert werden.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, immer frische Neutrophile zu verwenden, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, hoffe ich, dass Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Kalziumfluss durch Durchflusszytometrie misst und wie man die bakterielle Genexpression in eukaryotischen Zellen mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie misst.