Name: Studieren Wechselwirkungen von Staphylococcus aureus Mit Neutrophilen durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie Zeitraffer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Lernen Sie die Analyse von Staphylococcus aureus-PSMs auf humane Neutrophile mittels Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung bakterieller Toxinwirkungen auf Immunzellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<p class="jove_content"&gt; RN wurde teilweise durch ein Marie Curie European Reintegration Grants (ERG) von der Europäischen Gemeinschaft Siebten Rahmenprogramms, Projektnummer 268324 gefördert.</p&gt;

1. Isolation von PMN aus menschlichem Blut durch Dichtezentrifugation <ol><li> Unentschieden 5 9 ml Röhrchen heparinisierter venösen Blut. </li><li> Bereiten Dual-Layer-Ficoll-Gradienten (4 Steigungen für 5 Gefäße Blut) wie folgt: Gießen Sie 12 ml mit einer Dichte von 1,119 g / ml Ficoll-Lösung in einem 50 ml-Tube und sorgfältig Schicht 10 ml mit einer Dichte von 1,077 g / ml Ficoll-Lösung an der Spitze. </li><li> Man verdünnt das Blut mit einem gleichen Volumen von PBS. </li><li> Schicht das verdünnte Blut vorsichtig auf die Dual-Layer-Ficollgradienten; 20-25 ml pro Gradienten. </li><li> Zentrifuge 20 min bei 396 xg in einem Ausschwingrotor, 22 ° C ohne Bremsen. </li><li> Bereiten kalt RPMI mit 0,05% Human Serum Albumin (RPMI-HSA). Auch bereiten 9 ml sterilem entionisiertem H 2 O. Pre-kühlen sowohl die RPMI und H 2 O auf Eis. </li><li> Absaugen der oberen Schicht mit Ficoll Plasma (gelbe Farbe) und PBMC, und die zweite Schicht von Ficoll (weiße Farbe) unter Verwendung einer Vakuumpumpe (Put eine sterile Pipettenspitzedie Pipette). </li><li> Sammeln Sie die PMN in 50 ml-Röhrchen mit einem kleinen Kunststoff-Pipette (1 Tube für die PMN Fraktionen von jeweils 2 Gradienten), und legen Sie sie auf Eis. </li><li> In kaltem RPMI-HSA auf ein Gesamtvolumen von 50 ml und Zentrifuge für 10 min bei 249 xg bei 4 ° C. </li><li> Nehmen Sie den Überstand mit dem Einsatz einer Vakuumpumpe und Wirbel das Pellet vorsichtig (Erythrozyten und Granulozyten). </li><li> In 9 ml sterilem entionisiertem H 2 O und den Timer zu starten. Stoppen Sie den hyper osmotischen Schock nach 30 Sekunden genau, durch Zugabe von 1 ml 10 mal konzentrierter PBS. Hinweis: Die 30 Sekunden sind sehr kritisch. </li><li> In kaltem RPMI-HSA auf ein Gesamtvolumen von 50 ml und Zentrifuge für 10 min bei 249 xg bei 4 ° C. </li><li> Nehmen Sie den Überstand unter Verwendung einer Vakuumpumpe zu sammeln und das Pellet in 1 PMN Rohr mit einem definierten Volumen (1-2 ml) RPMI-HSA. </li><li> Bestimmen Sie die Menge an Zellen und stellen Sie die Konzentration auf 1,10 7 Zellen / ml. Je nach Spender, wird die Ausbeute der isolierten PMN sein betwede 5 x 10 6 und 3 x 10 7 PMN von jedem 9 ml Röhrchen Blut </li></ol> 2. Durchflusszytometrischer Assay für die Bewertung von Calcium Mobilisierung in Human PMNs <ol><li> Wägezellen (5 x 10 6 Zellen / ml) mit 2 uM Fluo-3-AM in RPMI-HSA und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur langsam schaukeln, zum Beispiel unter Verwendung eines Wippschüttler Schüttler, vor Licht geschützt. </li><li> In der Zwischenzeit bereiten eine serielle Verdünnung (z. B. 3-fach) des Reizes bei 10x die Endkonzentration. PSMα3 wird in diesem Protokoll verwendet, aber jede GPCR Reiz, der auf Neutrophilen wirkt eignet. </li><li> Bereiten 10x konzentrierter Inhibitor des Rezeptors in RPMI-HSA. Wenn der Hemmstoff auf den Stimulus (zB HDL auf PSMα3) Pre-Inkubation 25 ul Stimulus wirkt mit einem gleichen Volumen an Inhibitor für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen der Zellen durch Zugabe von 10 ml RPMI-HSA und Zentrifuge für 249 xg bei Raumtemperatur. Die Zellen bis 5 x10 6 Zellen / ml. </li><li> Kurz vor dem Experiment, verdünnt den Zellen bis 2x10 6 Zellen / ml in RPMI-HSA und 200 ul Zellen pro FACS-Röhrchen. Das verwässerte PMN sind sehr zerbrechlich. Halten sie zu lange bei dieser Konzentration wird die Auto-Aktivierung führen, das gleiche gilt für kräftiges Schütteln oder Pipettieren. </li><li> Befestigen Sie das Rohr mit dem Durchflusszytometer, warten Sie 3 Sekunden und starten Akquisition. Nach einem festgelegten Zeitraum (zB 8 sec), nehmen Sie den Schlauch und schnell hinzufügen 50 ul Stimulus zur Probe. Sofort wieder anzubringen das Rohr auf dem Probenhalter und weiterhin den Erwerb. </li><li> Beginnen Sie mit der niedrigsten und mit der höchsten Konzentration an Reiz. Waschen Sie die Durchflusszytometer Nadel regelmäßig nach jedem Lauf mit RPMI-HSA. </li><li> Analysieren von Daten mit Durchflusszytometrie-Analyse-Software. Vergleichen Sie die durchschnittliche Fluoreszenz-Signal vor der Zugabe des Stimulus an, dass nach Zugabe des Stimulus und verwenden Sie die entsprechenden positiven und negativen Kontrollen an den AC berechnenMotivation Stärke für jede Verdünnung gemessen. </li></ol> Alternativ, wenn der Inhibitor auf dem Rezeptor vor dem Inkubieren der Zellen mit dem Inhibitor wirkt. 3. Fluoreszenzmikroskopie Analyse von Bakterien GFP Expression nach Phagozytose durch PMN <ol><li> Wachsen S. aureus-Stämme, die ein Reporter Konstrukt von Interesse über Nacht in der Brühe (mit Antibiotika, wenn erforderlich, um die Reporter-Plasmid aufrecht zu erhalten). In diesem Fall enthält ein Stamm MW2 PSMα GFP-Reporter-Konstrukt, 10 verwendet wird, gewachsen in einer 50 ml Plastikröhrchen mit 5 ml LB-Kulturmedium. </li><li> Um alle GFP von O / N Ausdruck entfernen, verdünnt den Kulturen zu OD 660 0,01 und wachsen bis zu einer OD 660 0,1. Redilute diese Kultur 1:30 und überwachen Wachstum bis die Kultur erreicht eine OD 660 von 0,1. Sammeln Sie die Bakterien durch Zentrifugation und waschen einmal in DPBS. Resuspendieren im Maßstab 1:10 des ursprünglichen Volumens auf eine OD 660 von 1,0 oder r erhaltengründlich 5.10 8 CFU / ml. </li><li> Mischen Sie die Bakterien (1.10 7 / ml) mit frisch isolierten PMN (1.10 6 / ml) in RPMI-HSA (10:1) in einem 1,5 ml Mikroröhre und fügen gepoolten menschlichen Serum zu einer Endkonzentration von 10%. Schütteln auf einem Schüttler Plattform für 10 min bei 37 ° C bis Phagozytose stimulieren. Verdünnen Sie die PMN mit Bakterien bis 5.10 5 PMN / ml und 250 ul Pipette in eine Vertiefung einer 8 gut Kammern Deckglas geladen. </li><li> Bild der PMN mit Bakterien auf einem Mikroskop. Ein umgekehrtes Mikroskop mit einer 40X/0.85 NA Ziel ausgestattet funktioniert gut und sollte in einer dunklen Umgebung Kammer werden eingehüllt, um die Umwelt stabil halten bei 37 ° C Erwerben Sie Bilder für eine Reihe von Preset-Positionen der Verwendung der Kamera alle 5-10 min sowohl im Hellfeld und dem GFP Kanal GFP-Produktion in der Zeit folgen. </li></ol>

<ol><li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li>
<li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li>
<li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li>
<li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557(2010).</li>
<li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus%3A+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li>
<li>Kretschmer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Formyl+Peptide+Receptor+2+Senses+Highly+Pathogenic+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus.</a> Cell Host & Microbe. 7, 463(2010).</li>
<li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+%28FPRL1%29+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+%28FPRL1+inhibitory+protein%29+that+inhibits+FPRL1+and+FPR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li>
<li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li>
<li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus%2C+a+bacterial+antiinflammatory+agent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606(2012).</li>
<li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination%3A+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409(2008).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , In Press (2013).</li>
<li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System%3A+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150(2008).</li>
<li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318(2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

In der hier beschriebenen Verfahren einige Schritte sind sehr kritisch. Wir werden diese hier hervorzuheben. Für die Isolierung von Neutrophilen durch Dichtegradientenzentrifugation ist es wichtig, die Schichten während oder nach der Zentrifugationsschritte stören. Wenn Ansaugen der Neutrophilen mit einem Kunststoff-Pipette, stellen Sie sicher nicht, um den Ballon zu quetschen, während in der Schicht von Zellen, wie Ausstoßen von Flüssigkeit werden die Schichten zu stören. Auch eine Sichtkon...

Neutrophile (PMN) sind professionelle Fresszellen, die eine wichtige Rolle spielen bei der angeborenen Immunantwort gegen Staphylococcus aureus 1. Der ständige Kampf zwischen Wirt und Mikrobe hat zu einem Wettrüsten der beiden führte. Kürzlich, community-associated (CA) Stämme von Methicillin-resistenten S. aureus (MRSA) sind entstanden, die zu sein scheinen sehr effizient in Umgehung der neutrophilen Tötung 2,3. Übermäßige Phenol löslich modulin (PSMs) Produktion von CA-MRSA hat mit höherer Virulenz 4,5 in Verbindung gebracht. Humanneutrophilen können diese PSMs über FPR2 die Aktivierung dieses G-Protein-gekoppelten Rezeptor 6 führen zu erkennen. Eines der frühesten Ereignisse ist die Mobilisierung von intrazellulären Speichern von Calcium (Ca 2 +). Ca 2 + wirkt als sekundärer Botenstoff für eine Vielzahl von Effektor-Funktionen von PMNs einschließlich Degranulation und Phagozytose 7. Daher Ca 2 + ist ein sehr empfindlicher Indikator für dieFunktionsfähigkeit PSMs zu PMN aktivieren. Um die Auswirkungen von PSM auf Neutrophilen studieren, werden frische Neutrophilen isoliert und mit einem Farbstoff, der auf Calcium Mobilisierung fluoresziert geladen. In einem Experiment Durchflusszytometrie diese rasche Mobilisierung gemessen werden kann. Mit diesem Verfahren ist es möglich, die direkte Auswirkungen von toxischen und anderen Komponenten auf Neutrophilen zu untersuchen und festzustellen, die niedrigste Konzentration, bei der diese aktiv sind. Für uns ist es ein sehr nützliches Werkzeug, um die Wirkung von vielen Proteinen von S. produziert studieren aureus in Immunevasion wie FPR2 hemmende Protein (FLIPR) 8, FLIPR-like 7 und Chemotaxis hemmende Protein von Staphylococcus aureus (CHIPS) 9 beteiligt. All diese Proteine ​​haben gezeigt, dass das Calcium-Mobilisierung in Neutrophilen durch Bindung an den Rezeptor erkennt den Agonisten zu hemmen. Vor kurzem hat unsere Gruppe beschrieben, dass PSMs funktionell gehemmt durch Serumlipoproteine ​​10 &lt;/ Sup&gt;. Diese Lipoproteine ​​sind reichlich vorhanden im Blut und menschlichem Gewebe, was darauf hinweist, dass ihre Funktion ausüben PSMs vor allem in der intrazellulären Umgebung. Die Verfügbarkeit der Calciummobilisierung Assay erlaubt uns die präzise Messung der Wirkung von Serum-Lipoproteine ​​auf Aktivierung von Neutrophilen durch den PSM durch die erhebliche Hemmung durch sehr geringe Konzentrationen an Serum angegeben. Da die PSMs funktionell gehemmt durch Serum, stellten wir die Hypothese, dass es eine wichtige Funktion für PSMs als intrazelluläre Toxine. Wir haben daher versucht, die Rolle der PSMs nach Phagozytose bestimmen. Um die Expression der PSMs in den interzellulären Raum zu untersuchen, haben wir Reporter Fusionen von dem Promotor des Operons psmα GFP konstruiert. Wenn diese Reporter Stämme von S. aureus durch Neutrophile wurden phagozytiert wurde die Induktion der Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet 10. Offensichtlich kann diese technique ermöglicht die Untersuchung der Expression einer Vielzahl von Genen in S. aureus oder anderen Erregern nach Phagozytose. Da für S. aureus Überleben in der interzellulären Nische ist sehr wichtig, um das angeborene Immunsystem 11 10 12 zu überwinden, die Untersuchung der Rolle von Genen in dieser Nische aktiviert ist von großer Bedeutung für das Verständnis ihrer Virulenz.

<table><tbody><tr><td>Fluo-3, AM</td><td>Molekulare Sonden / Life Technologies</td><td>F-1241</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>Dichte 1,077 g/ml</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Dichte 1,119 g/ml</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>52400-025</td><td>enthält 25 mM HEPES und L-Glutamin</td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 Mikroskop</td><td>Leica Microsystems, Niederlande</td><td>TCS SP5</td><td>Objektiv: HCX PL APO 40x/0,85 </td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td>Sehr wichtig, dass das Rohr während des Messvorgangs entfernt und ausgetauscht werden kann</td></tr></tbody></table>

studieren wechselwirkungen von<em&gt; staphylococcus aureus</em&gt; mit neutrophilen durch durchflusszytometrie und mikroskopie zeitraffer

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Wir präsentieren Methoden, um die Wirkung von Phenol löslich modulins (PSM) und andere Toxine und Staphylococcus aureus auf Neutrophilen sezerniert studieren. Um die Auswirkungen der PSM auf Neutrophilen wir isolieren frisch Neutrophilen mittels Dichtegradientenzentrifugation studieren. Diese Neutrophilen werden mit einem Farbstoff, der auf Calcium-Mobilisierung fluoresziert geladen. Die Aktivierung von Neutrophilen durch PSMs initiiert eine rasche und vorübergehende Erhöhung der freien intrazellulären Calcium-Konzentration. In einem Experiment Durchflusszytometrie diese rasche Mobilisation kann durch Überwachung der Fluoreszenz eines vorinstallierten Farbstoff, der auf die erhöhte Konzentration an freiem Ca 2 + reagiert gemessen werden. Mit dieser Methode können wir bestimmen, die PSM-Konzentration notwendig, um die Neutrophilen zu aktivieren, und messen die Auswirkungen von spezifischen und allgemeinen Inhibitoren der Aktivierung von Neutrophilen. Um die Expression der PSMs in den intrazellulären Raum, w untersuchene konstruiert haben Reporter Fusionen der Promotor des PSMα Operon zu GFP. Wenn diese Reporter Stämme von S. aureus durch Neutrophile phagozytiert werden, kann die Induktion der Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden.

Durchflusszytometrische Assay zur Beurteilung der Mobilisierung von Kalzium im menschlichen PMNs Inkubieren Neutrophilen mit einer Konzentration Reihe synthetischer PSMα3 wodurch eine schnelle Aktivierung durch Calcium-Fluss, der durch eine Erhöhung des Signals im FL-1 gezeigt, wird gemessen. Pre-Inkubation von synthetischen PSMα3 mit 0,01%, 0,1% oder 1% humanem Serum erheblich behindert die Fähigkeit, Kalzium Flüsse (Abbildung 1) zu entlocken. Analyse...

Wir präsentieren Methoden, um die Wirkung von PSM und andere Giftstoffe ausgeschieden durch studieren<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Auf Neutrophilen mittels Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie.

Studieren Wechselwirkungen von<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Mit Neutrophilen durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie Zeitraffer

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Wirkungen von staphylokokkalem Phenol, löslichem Modulin oder PSMs auf humane Neutrophile zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst Neutrophile aus menschlichem Blut isoliert und anschließend einer In-vitro-Analyse unterzogen werden. Danach werden die Neutrophilen entweder mit einem fluoreszierenden Farbstoff beladen und mit einer Konzentrationsreihe von PSMs, mit und ohne Inhibitoren, versetzt oder sie phagozytieren S. aureus-Bakterien, die einen PSM-alpha-Promotor-GFP-Reporter-Konstrukt enthalten.Schließlich kann die Aktivierung der Neutrophilen durch PSM-Stimulation mittels Durchflusszytometrie und die Expression von GFP durch die phagozytierten Bakterien mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert werden. Mit dieser Methode können Sie die Wirkungen von staphylokokken-, Phenyl-, Soja-, Molin- oder Neutrophilen-Stämmen untersuchen.Natürlich kann diese Methode auf viele andere Zelltypen, Stimuli und Antagonisten angewendet werden. Die Idee für den mikroskopischen Teil dieser Methode entstand zunächst bei der Diskussion einer Möglichkeit, die Wirkung von PSMs innerhalb von Neutrophilen zu beobachten. Mithilfe eines bakteriellen GFP-Expressionskonstrukts und der Zeitraffermikroskopie können wir genau das erreichen.Nachdem fünf Röhrchen mit venösem Heparinblut entnommen wurden, geben Sie 12 Milliliter einer Fiallösung mit einer Dichte von 1,119 Gramm pro Milliliter in ein 50-Milliliter-Röhrchen und überlagern Sie diese vorsichtig mit 10 Milliliter einer FI-call-Lösung mit einer Dichte von 1,077 Gramm pro Milliliter. Verdünnen Sie anschließend das Blut mit einem gleichen Volumen an PBS und schichten Sie 20 bis 25 Milliliter des Blutes vorsichtig auf jedes zweischichtige FI-call-Gradient. Zentrifugieren Sie die Gradienten 20 Minuten lang bei 396 × g und 22 Grad Celsius, ohne sie zu durchbrechen.Verwenden Sie anschließend eine Vakuumpumpe, die mit einer sterilen Pipettenspitze ausgestattet ist, um die oberen gelben Schichten aus Plasma und PBMCs abzusaugen. Danach die dritte weiße Schicht. Übertragen Sie mithilfe einer kleinen Kunststoffpipette nun den Polymorphkernigen-Neutrophilen- oder PMN-Anteil aus jedem Gefäß in ein neues 50-Milliliter-Gefäß.Fügen Sie frisch zubereitetes, vorgekühltes PMI, ergänzt mit menschlichem Serumalbumin oder R-P-M-I-H-S-A, zu jedem Röhrchen hinzu, um das Gesamtvolumen auf 50 Milliliter zu bringen. Zentrifugieren Sie anschließend die Zellen, aspirieren Sie das Überstandsmittel mit einer Vakuumpumpe und wirbeln Sie das pelletierte Material, das rote Erythrozyten und PMN enthält, vorsichtig um. Geben Sie danach 9 Milliliter steriles, deionisiertes Wasser zu den Zellen und starten Sie eine Stoppuhr.Fügen Sie genau 30 Sekunden hinzu. Geben Sie ein Milliliter 10-fach konzentriertes PBS zu, um den hyperosmotischen Schock zu stoppen. Anschließend waschen Sie die Zellen in einem Gesamtvolumen von 50 Milliliter kaltem R-P-M-I-H-S-A.Nach dem Entfernen des Überstandes ein Milliliter R-PMI-HSA zu jedem Plättchen hinzufügen, das aufgrund der Lyse der Erythrozyten nun weiß ist. Anschließend durch Pipettieren resuspendieren und die Pellets in einem Gefäß vereinigen. Danach die Zellen zählen und die Konzentration auf 1 × 10⁷ Zellen pro Milliliter einstellen.Jetzt laden Sie fünfmal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter mit zwei Mikromolar Fluoh 3:00 Uhr morgens in R-P-M-I-H-S-A. Decken Sie das Gefäß mit Aluminiumfolie ab, um es vor Licht zu schützen. Anschließend inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei Temperatur unter Schütteln.Unterdessen bereiten Sie eine dreifache serielle Verdünnung des Stimulus bei 10-facher Endkonzentration vor. Inkubieren Sie dann 30 Mikroliter des Stimulus gemeinsam mit einem gleichen Volumen frisch zubereiteter 10-fach konzentrierter Hemmstofflösung oder Puffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie anschließend die Zellen in 10 Milliliter R-P-M-I-H-S-A und resuspendieren Sie die Zellen in frischem R-P-M-I-H-S-A bei einer Konzentration von fünf mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter.Unmittelbar vor der Durchflussanalyse die Zellen auf zwei mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter in RPMI-HSA verdünnen und 200 Mikroliter Zellen pro FACS-Röhrchen hinzufügen. Unter Vorsicht, die Zellen nicht durch Schütteln oder Pipettieren zu aktivieren, das erste Röhrchen am Durchflusszytometer laden. Drei Sekunden warten und dann nach einer festen Zeitspanne, beispielsweise acht Sekunden, die Datenaufnahme starten, das Röhrchen entnehmen und schnell 50 Mikroliter der niedrigsten Verdünnung des Stimulus zur Probe hinzufügen.Unmittelbar danach das Röhrchen erneut beladen und die Datenaufnahme fortsetzen. Wenn eine Verdünnungsreihe abgeschlossen ist, die Durchflusszytometernadel mit frischem R-P-M-I-H-S-A spülen, bevor eine neue Reihe gemessen wird. Nach der Durchführung der letzten Probe die Daten mit Software zur Durchflusszytometrie-Analyse auswerten, um die bakterielle GFP-Expression zu analysieren.Nach der PMN-Phagozytose eine S. aus-Stammsorte, die den Reporterkonstrukt der gewünschten Interesse enthält, über Nacht in Brühe wachsen lassen, jegliches während der Übernachtkultur exprimierte GFP durch Verdünnen der Zellen auf OD600 0,01 entfernen. Die Kultur bis zum Erreichen eines OD600 von 0,1 weiterwachsen lassen. Die Zellen im Verhältnis 1:30 verdünnen und anschließend das Wachstum überwachen, bis die Kultur erneut ein OD600 von 0,1 erreicht.Anschließend die Bakterien durch Zentrifugation gewinnen. Die Zellen einmal in DPBS und Resus waschen. Die Kultur suspendieren.Ein bis zehn des ursprünglichen Volumens hinzufügen, um einen OD600 von 1,0 oder etwa 5 × 10⁸ KBE pro Milliliter zu erhalten. Anschließend die Bakterien mit dem frisch isolierten PNS in RPMI-HSA im Verhältnis 10:1 mischen. Danach gepooltes humanes Serum auf ein Endvolumen von einem Zehntel gepoolten humanen Serums in der Zelllösung hinzufügen.Stimulieren Sie die Phagozytose, indem Sie die Zellmischung 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius schütteln. Verdünnen Sie anschließend die mit Bakterien beladenen PMNs auf fünf mal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter und geben Sie 250 Mikroliter der Zellen in jedes Loch einer achtlochigen Kammerobjektträgerkammer. Bilden Sie schließlich die Zellen auf einem umgekehrten Mikroskop ab, das mit einer 40x-Objektivlinse ausgestattet und in einer dunklen Umgebungskammer eingeschlossen ist, und nehmen Sie alle fünf bis 10 Minuten Bilder an mehreren Stellen in den Kammerobjektträgern sowohl im Hellfeld als auch im GFP-Kanal auf, um die bakterielle GFP-Produktion in Echtzeit zu verfolgen. Die Inkubation von Neutrophilen mit einer Konzentrationsreihe des synthetischen PSM alpha drei führt zu einer dosisabhängigen, schnellen Aktivierung der Zellen, gemessen als Kalzium-Fluss. Die Vorinkubation des PSM-alpha-3-Peptids mit 0,01 %, 0,1 % oder 1 % menschlichem Serum hemmte signifikant die Fähigkeit des Stimulus, eine Kalziumantwort hervorzurufen. Auch hier zeigte sich eine dosisabhängige Wirkung bei 1 % Serum. Bei diesen PSM-alpha-3-Konzentrationen ist kaum eine Aktivierung sichtbar.In diesen Bildern sind zwei Neutrophile zu sehen, die Bakterien enthalten, welche einen PSM-alpha-GFP-Reporterkonstrukt phagozytiert haben. Die Bakterien beginnen etwa eine Stunde nach der Phagozytose zu fluoreszieren, was die Expression von GFP aus dem PSM-Alpha-Promotor anzeigt. Bakterien außerhalb der Neutrophilen fluoreszieren nicht, was darauf hindeutet, dass die Expression von PSM alpha erst dann schnell aktiviert wird, wenn die Bakterien phagozytiert wurden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets frische Neutrophile zu verwenden, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Nach dem Ansehen dieses Videos hoffen wir, dass Sie ein gutes Verständnis dafür entwickelt haben, wie man den Kalziumfluss mittels Durchflusszytometrie misst und wie man die Genexpression von Bakterien innerhalb eukaryotischer Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie bestimmt.

studying-interactions-staphylococcus-aureus-with-neutrophils-flow

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieser Artikel beschreibt zunächst ein Verfahren zur Isolierung von humanen Endothelzellen aus Nabelschnur-Venen und zeigt dann, wie man diese Zellen verwenden, um Transmigration neutrophiler unter Strömungsbedingungen zu untersuchen. Durch die Verwendung eines geringen Mengen Strömungskammer aus einem Polymer mit den optischen Eigenschaften des Glases hergestellt ist, ist in lebenden Zellen Fluoreszenz-Bildgebung von seltenen Zellpopulationen möglich.

Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Source: Barbero, A. M., et al. Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates the procedure for labeling host immune receptors that bind bacterial surface antigens, enabling their detection through flow cytometry.

Analysis of Macrophage Receptor Interactions with Pathogenic Bacteria Using Flow Cytometry

Dieses Video zeigt einen in vitro Assay zur Untersuchung der Interaktion zwischen Neutrophilen und Biofilmen. Die im Biofilm eingebetteten pathogenen Bakterien und isolierten Neutrophilen wurden mit Fluoreszenzmarkierungen markiert und die Immunantwort der Neutrophilen und die Umgehung der Immunantwort durch die Bakterien mit einem Fluoreszenzmikroskop bewertet.

Ein In-vitro-Assay zur Untersuchung der Interaktion zwischen Neutrophilen und Biofilm

Das Video zeigt eine Methode zur Untersuchung des Einflusses von Stromazellen auf die Rekrutierung von Leukozyten. In einem Modell mit paralleler Plattenströmungskammer induzieren proinflammatorische Zytokine die Expression von Adhäsionsrezeptoren durch Endothelzellen, was die Rekrutierung und Migration von Neutrophilen erleichtert. Die Wechselwirkung zwischen Stromazellen und Endothelzellen verringert die Rekrutierung von Neutrophilen zu den Endothelzellen.

Eine in vitro Flow-Untersuchung der Wirkung von Stromazellen auf die Rekrutierung von Leukozyten

Leukozyten überqueren die endothelialen Monolayer mit Hilfe der parazellulären oder transzelluläre Route. Wir haben einen einfachen Test zu folgen die Verteilung endogener junctional VE-Cadherin und PECAM-1 während Leukozyten transendotheliale Migration unter physiologischen Fluss zwischen den beiden Seelenwege unterscheiden.

Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

Die Fähigkeit von entzündetem Endothel Leukozyten aus Strömungs Rekrutierung von mesenchymalen Stromazellen geregelt. Wir beschreiben zwei in vitro Modelle mit primären humanen Zellen, die verwendet werden können, um neutrophilen Rekrutierung von Flow zu bewerten und zu prüfen, welche Rolle die mesenchymalen Stromazellen bei der Regulierung dieses Prozesses spielen.

Analyse der Auswirkungen von Stromazellen an der Rekrutierung von Leukozyten von Flow

Diese Studie beschreibt die mikroskopische Überwachung der Pneumokokken-Bindung an von Willebrand-Faktor-Strings, die auf der Oberfläche differenzierter menschlicher Primärendothelzellen unter Scherspannung unter definierten Strömungsbedingungen hergestellt werden. Dieses Protokoll kann auf eine detaillierte Visualisierung spezifischer Zellstrukturen und die Quantifizierung von Bakterien durch die Anwendung von Differential-Immunostaining-Verfahren erweitert werden.

Pneumokokken-Infektion von primären humanen Endothelzellen im konstanten Fluss

Dieses live-bakterielle Zellbildgebungsprotokoll ermöglicht die Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen mehreren Bakterienarten auf einzelzelliger Ebene im Laufe der Zeit. Die Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht die Beobachtung jeder Bakterienart in Monokultur oder Kokultur, um Wechselwirkungen zwischen den Arten in bakteriengemeinschaften mit mehreren Arten, einschließlich individueller Zellbeweglichkeit und Lebensfähigkeit, zu untersuchen.

Kinetische Visualisierung von einzelzelligen Interspezies-Bakterien-Wechselwirkungen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Untersuchung neutrophiler Biofilmwechselwirkungen. Staphylococcus aureus Biofilme werden in vitro etabliert und mit peripheren aus Blut gewonnenen menschlichen Neutrophilen inkubiert. Die oxidative Burst-Reaktion von Neutrophilen wird quantifiziert, und die Neutrophilenlokalisation innerhalb des Biofilms wird mikroskopisch bestimmt.

Standardisierte In-vitro-Assays zur Visualisierung und Quantifizierung von Interaktionen zwischen humanen Neutrophilen und Staphylococcus aureus-Biofilmen

Dieses Protokoll beschreibt einen quantitativen Ansatz zur Messung der mikrobiellen Autoaggregation mittels bildgebender Durchflusszytometrie.

Bildgebende Durchflusszytometrie zur Untersuchung der mikrobiellen Autoaggregation

In diesem Manuskript stellen wir ein umfassendes Protokoll zur Beurteilung des Überlebens von Antibiotika für Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus zur Verfügung, indem wir Plasmide in P. aeruginosa und S. aureus transformieren, um Reporterstämme zu erzeugen und phänotypische Varianten, wie z.B. Persistere, durch Zeitraffer-Epifluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen.

Zeitraffer-Epifluoreszenzmikroskopie: Bildgebung von Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus : Heterogene Phänotypen

Lernen Sie die Analyse von Staphylococcus aureus-PSMs auf humane Neutrophile mittels Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung bakterieller Toxinwirkungen auf Immunzellen.

Studieren Wechselwirkungen von

Weitere Videos entdecken