Name: Gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnung und Calcium-Bildgebung von Neuronen des suprachiasmatischen Kerns (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Erfahren Sie die simultane elektrophysiologische Aufzeichnung und Calcium-Bildgebung von Neuronen des suprachiasmatischen Kerns. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Interaktion zwischen Membranpotential und intrazellulärer Calciumkonzentration.

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Die Arbeit wurde durch ein Stipendium des National Institute of General Medical Sciences (GM096972) finanziert.

1. Vorbereitung von Hypothalamus-Hirnschnitten
<ol>
	<li>Im Voraus die Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) für jedes Verfahren mit Tieren einholen. Die hier beschriebenen tierexperimentellen Verfahren stehen im Einklang mit den AVMA-Richtlinien für die Euthanasie von Tieren 2013 und wurden im Voraus von der Oregon Health & Science University IACUC genehmigt.</li>
	<li>Bereiten Sie 500 ml des Schneidepuffers ohne MgCl2 und CaCl2 vor (Tabelle 1). Die Lösung wird bei Raumtemperatur mit 95 % O2 und 5 % CO2 gefüllt, dann MgCl2 und CaCl2 hinzugefügt, während die Belüftung fortgesetzt wird. Stellen Sie die Osmolarität mit Saccharose auf 300 mOsm ein. Die Osmolarität wird mit einem Dampfdruckosmometer gemessen.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 l des Aufzeichnungsmediums ohne MgCl2 und CaCl2 vor (Tabelle 2). Blasen Sie die Lösung mit 95 %O2 und 5 % CO2 und fügen Sie dann MgCl2 und CaCl2 hinzu, während Sie weiter belüften. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH (10 N) auf 7,2-7,4 und die Osmolarität mit Saccharose auf 300 mOsm ein. Die Zugabe von HEPES-Puffer ist optional und wurde verwendet, um den pH-Wert weiter zu stabilisieren.</li>
	<li>Die Schneid- und Aufzeichnungslösungen können vor der Verwendung mehrere Tage im Kühlschrank aufbewahrt werden.</li>
	<li>3% Agarose zubereiten und in eine sterile Petrischale (6 mm tief) geben und kühl stellen.</li>
	<li>Schneiden Sie drei Würfel Agarose ca. 6 mm x 6 mm x 6 mm ab.</li>
	<li>Betäubt eine vier bis acht Wochen alte Sprague-Dawley-Ratte tief mit Isofluran. Testen Sie die Tiefe der Anästhesie. Die Narkosetiefe wird als angemessen erachtet, wenn nach dem Einklemmen des Fußballens kein Rückzugsreflex der hinteren Extremität auftritt. Sobald die Ratte angemessen betäubt ist, wird sie durch schnelle Enthauptung eingeschläfert. </li>
	<li>Entfernen Sie schnell das Gehirn, achten Sie darauf, zuerst die Sehnerven zu durchtrennen, und legen Sie es in eine eiskalte Schnittlösung, die mit 5% CO2 und 95% O2 gesättigt ist, und lassen Sie es 2-3 Minuten abkühlen.</li>
	<li>Trimmen Sie das Gehirn. Legen Sie das Gehirn mit einer Pinzette auf ein angefeuchtetes (mit Schnittlösung) kreisförmiges Filterpapier, das auf eine auf Eis stehende Petrischale aus Glas gelegt ist.</li>
	<li>Schneiden Sie das Gehirn koronal, um das verbleibende Kleinhirn und den Hirnstamm zu entfernen, dann die rostrale Rinde und die Seiten, um einen Gehirnblock zu hinterlassen, der den Hypothalamus enthält, wobei die Seite mit SCN, Sehnerven und Optikuschiasma sorgfältig erhalten bleibt.</li>
	<li>Verteilen Sie eine dünne Schicht Cyanoacrylkleber, groß genug, um das Gehirn und die Agaroseblöcke in einer eiskalten, aber trockenen Mikrotom-Schneidekammer zu befestigen.</li>
	<li>Übertragen Sie den eiskalten Hirnblock mit der kaudalen Seite nach unten auf den Kleber, wobei die Seite mit dem SCN zuerst zum Schneiden positioniert ist, wobei die Sehnerven ein "V" bilden, das nach oben zeigt.</li>
	<li>Legen Sie die Agaroseblöcke auf die anderen 3 Seiten. Füllen Sie die Kammer mit eiskaltem Schneidepuffer, der kontinuierlich mit 5 % CO2 und 95 % O2 gefüllt ist. Der Cyanoacrylatkleber verfestigt sich mit Feuchtigkeit und hält das Gehirn und die Agaroseblöcke an Ort und Stelle.</li>
	<li>Schneiden Sie koronale hypothalamische Scheiben (220-250 μm dick), die das SCN enthalten, mit dem vibrierenden Klingenmikrotom. Typischerweise wird ein Schnitt gewählt, bei dem das Chiasma opticus einen Durchmesser von etwa 2-4 mm hat und wie ein weißes Band erscheint, wobei SCN nur dorsal erscheint und als zwei kleine "Vertiefungen" im Chiasma opticus auf beiden Seiten des 3. Ventrikels erscheint (Abbildung 1A).</li>
	<li>Legen Sie die Scheiben in die Aufnahmekammer (36 °C), die auf dem Tisch eines Leica DMLFS-Mikroskops montiert ist. Die Kammer wird mit kontinuierlich fließender Aufzeichnungslösung (2 ml/min) gefüllt, mit 95 % O2 und 5 % CO2 belüftet und mit einem Inline-Heizer vorgewärmt.</li>
	<li>Führen Sie Ganzzell-Patch-Clamp- und Calcium-Imaging-Aufzeichnungen in SCN-Neuronen 0,5 bis 8 Stunden nach der Schnittvorbereitung durch.</li>
</ol>
2. Patch Clamp Aufnahme
<ol>
	<li>Bereiten Sie die Elektrodenlösung (intrazelluläre) Lösung in der Hälfte des gesamten Endvolumens Wasser vor.</li>
	<li>Stellen Sie die Lösung mit KOH (1 N) auf pH 7,3 ein.</li>
	<li>Das restliche Wasser hinzufügen. Die endgültige Osmolarität der Lösung sollte im Bereich von 280-290 mOsm liegen.</li>
	<li>Die Elektrodenlösung durch einen 0,2-μm-Filter leiten, aliquot (0,5 ml) in Mikrofuge-Röhrchen geben und bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie die Bis-Fura-2-Hexakaliumsalz-Stammlösung (10 mM) der Calciumsonde vor, indem Sie 1 mg Bis-Fura-2-Hexakaliumsalz mit 99,29 μl 0,2 μm gefiltertem Wasser mischen.</li>
	<li>In separate Röhrchen (je 2-5 μl) aliquotieren und einfrieren (-20 °C).</li>
	Tauen Sie <li>kurz vor Gebrauch ein Aliquot der internen Lösung und die Ca2+-Sonde auf. 2 μl der Bis-Fura-2-Stammlösung zu 400 μl der internen Lösung hinzufügen, um eine abschließende Calciumsondenkonzentration von 50 μM zu erhalten. Kurz verreiben, um die Lösungen zu mischen. Die Konzentration der Kalziumsonde (10-250 μM) variiert je nach Versuchsdesign und Bildgebungssystem. Beachten Sie, dass Bis-Fura-2 aus zwei miteinander verknüpften Fura-2-Molekülen besteht.</li>
	<li>Ziehen Sie Ganzzell-Patch-Elektroden in zwei Stufen auf einen äußeren Spitzendurchmesser von ca. 1 μm und Widerstände von 7-10 MΩ, wenn sie mit der intrazellulären Lösung gefüllt sind.</li>
	<li>Füllen Sie die Elektrode mit einigen μl der internen Lösung auf, die die Kalziumsonde enthält, die mit einem 4-mm-Spritzenvorsatzfilter (0,2 μm) für Proben mit geringem Volumen über ein Microfil-Röhrchen filtriert wurde.</li>
	<li>Üben Sie einen kleinen Überdruck auf die Elektrode aus, während sie unter Rotlichtbeleuchtung in die Aufnahmekammer geführt wird, während sie auf einem Videomonitor betrachtet wird. </li>
	<li>Platzieren Sie die Mikroelektrode mit einem Objektiv mit geringer Leistung (4X) über dem SCN. Der SCN wird als die beiden durchscheinenden Bereiche auf beiden Seiten des dritten Ventrikels und dorsal des Chiasmas opticus identifiziert (Abbildung 1A).</li>
	<li>Schalten Sie das Mikroskop auf eine hohe Vergrößerung (40x oder 63x) um. Subregionen des SCN und einzelne SCN-Neuronen können für die Aufzeichnung bei höherer Vergrößerung anvisiert werden.</li>
	<li>Üben Sie einen sanften positiven Druck auf die Mikroelektrode aus, während sie auf die Oberfläche eines Neurons vorgeschoben wird.</li>
	<li>Üben Sie einen sanften Unterdruck auf die Mikroelektrode aus, um eine Dichtung mit Widerständen von 3-10 GΩ zu bilden.</li>
	<li>Stellen Sie die Membranspannung auf -60 mV ein, wobei der Verstärker mit der Erfassungssoftware gesteuert wird.</li>
	<li>Üben Sie zusätzlichen Unterdruck auf die Elektrode aus, um die Zellmembran in den Ganzzellmodus zu brechen.</li>
	<li>Beim Übergang in den Ganzzellmodus füllen sich das SCN-Neuron, das Soma und die Dendriten mit einer Fluoreszenzsonde.</li>
	<li>Die Membranspannung wird im Strom-Clamp-Modus oder der Strom im Voltage-Clamp-Modus gemessen, während die Bilddaten der Kalziumsonde überwacht und gespeichert werden (siehe unten). Sehen Sie sich die aufgenommenen Bilder zusammen mit einem Diagramm der Fluoreszenzdaten im Verhältnis 340 nm/380 nm während des Experiments an.</li>
</ol>
3. Messung von intrazellulärem Ca2+
<ol>
	<li>Quantitative Ca2+-Messungen werden durch die Aufnahme eines Bildpaares erhalten, indem das Gewebe über ein Monochronometer mit einer Bandbreite von 10 nm schnell mit UV-Licht bei 340 nm und 380 nm angeregt und durch einen optischen UG11-Filter geleitet wird, um harmonische Wellenlängen über 400 nm zu begrenzen, ein dichroitisches DCLP-Licht von 400 nm und emittiertes Licht durch einen Emissionsfilter von 510±40 nm.</li>
	<li>Die Bilder werden mit einer gekühlten CCD-Kamera aufgenommen, wobei die Aufnahmezeit und das Binning angepasst wurden, um Photobleaching zu minimieren und die Aufnahmegeschwindigkeit zu maximieren.</li>
	<li>Zur Erfassung und Anzeige der Bilder wird eine quantitative Bildgebungssoftware verwendet.</li>
	<li>Wählen Sie aus dem Ausgangsbild die interessierenden Bereiche aus, die in Daten der relativen Fluoreszenzintensitätseinheit konvertiert werden sollen (z. B. Soma, Dendrit usw.). Wählen Sie auch einen Bereich für die Messung der Hintergrundfluoreszenz aus (Abbildung 1B).</li>
	<li>Rohbilder und quantifizierte optische Daten werden während des Experiments kontinuierlich gespeichert. Nach dem Experiment werden die gespeicherten Bilder in der Regel erneut analysiert, wenn mehr Zeit für die genauere Auswahl der zu quantifizierenden Regionen von Interesse aufgewendet werden kann.</li>
	<li>Die Daten können als geschätzte intrazelluläre Calciumkonzentration (Est[Ca2+]i) dargestellt werden. Zur Berechnung der Calciumkonzentrationwird das Verhältnis (R) des emittierten Lichts nach Anregung und Hintergrundsubtraktion bei 340 nm dividiert durch 380 nm zusammen mit der maximalen und minimalen Fluoreszenz bei 340 nm und 380 nm verwendet. Die Subtraktion im Hintergrund und andere Berechnungen werden mit Hilfe von Datenanalysesoftware durchgeführt.</li>
	<li>Eine in vitro Bestimmung der maximalen und minimalen Bis-Fura-2-Fluoreszenz kann unter Verwendung von 10 mM CaCl2 fürCa2+-gebundene und 10 mM EGTA fürCa2+-freie Bedingungen durchgeführt werden. Die Ca2+-Dissoziationskonstante Kd der Sonde wird für Bis-Fura-2 (Invitrogen) mit 370 nM angenommen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die oben beschriebenen Methoden bieten ein leistungsfähiges Werkzeug, um gleichzeitig den Zusammenhang zwischen der elektrischen Aktivität der Neuronenmembran und der intrazellulären Kalziumkonzentration aufzuzeichnen. Die Methode hat eine Reihe von Stärken, da sie zwei sehr gut charakterisierte Methoden kombiniert - die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung und die Messung von intrazellulärem Kalzium mit Fluoreszenzfarbstoffen. Unser Ansatz ähnelt dem, der von anderen Forschern beschrieben wurde6,23.</...

Es ist bekannt, dass Veränderungen in der Genexpression in Neuronen als Folge der synaptischen Signalübertragung auftreten. Die Signalübertragung durch den exzitatorischen Neurotransmitter Glutamat kann das neuronale Membranpotential depolarisieren, was schließlich zur Gentranskription und -translation führt1,2. Die Aktivierung ionotroper Rezeptoren durch Glutamat ermöglicht es extrazellulären Kalziumionen, in die Zelle einzudringen, von der angenommen wird, dass sie als zweiter Botenstoff eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung der Gentranskription spielt. Die Bewertung der Beziehung zwischen der elektrischen Aktivität der Membran, wie z. B. der Auslösefrequenz des Aktionspotentials, und Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration erfordert die Kombination von zwei Methoden - Ganzzell-Patch-Klemmung und quantitative Bildgebung von fluoreszierenden Kalziumsonden3-5, wodurch die Beziehung in einzelnen Neuronen untersucht werden kann. Die Einzelzellaufzeichnungstechnik ermöglicht die Aufzeichnung der Aktivität einzelner Neuronen in identifizierbaren Teilen des Gehirns. Die Ganzzellenaufzeichnungstechnik ermöglicht die Steuerung der Membranspannung oder des Membranstroms und ermöglicht die experimentelle Manipulation spezifischer Ionenkanalströme. Die Verwendung von Mikropipetten, die mit fluoreszierenden Kalziumsonden gefüllt sind, stellt auch sicher, dass das Neuron gut mit Kalziumsonde gefüllt ist. Diese Technik hat einen klaren Vorteil bei der Arbeit mit Hirnschnittpräparaten aus Schnittpräparaten für Erwachsene, da diese Neuronen mit den gebräuchlicheren zellpermediären Sonden besonders schwer zu laden sind und potenzielle Hintergrundfluoreszenzproblemereduziert 6-8.
Licht ist die wichtigste Art und Weise, wie Säugetiere ihre zirkadiane Uhr einstellen, die sich im hypothalamischen suprachiasmatischen Kern (SCN) befindet. Die in der Netzhaut übertragene Lichtinformation wird 9-11 über den Retinohypothalamustrakt (RHT) übertragen, wo Glutamat im SCN freigesetzt wird12,13. Glutamat öffnet ionotrope NMDA- und AMPA-Rezeptoren, die sich auf SCN-Neuronen befinden, produziert einen Einstrom von Kalzium und Natrium und initiiert eine intrazelluläre Signalkaskade, die letztendlich zu einer Veränderung der Expression einer Familie von Uhrengenen14-17 und Phasenverschiebungen der zirkadianen Uhr18-20 führt. Kalzium kann jedoch entweder direkt über ionotrope Glutamatrezeptoren oder durch Membrandepolarisation und Aktivierung spannungsabhängiger Kalziumkanäle (VDCC) in Neuronen eindringen21. Wir haben daher ein experimentelles Protokoll entwickelt, um die Beziehung zwischen der intrazellulären Kalziumkonzentration und der elektrischen Aktivität der Membran in SCN-Neuronen zu untersuchen, wie sie beispielsweise beim Feuern des Aktionspotentials und beim synaptischen Input22 auftritt.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&bull; H2O</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>S-9638</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H2O</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&bull; 2H2O</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Kalium-D-gluconat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin 5&prime;-triphosphat dikaliumsalz</td><td>Dihydrat Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>Guanosin 5&prime;-triphosphat tris salz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (ultrarein)</td><td>Leben Technologien</td><td>15510-027</td><td>Gel in steriler Petrischale poriert 6 mm dicke Schicht</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5881</td><td></td></tr><tr><td>Bis-fura-2, hexakaliumsalz</td><td>Invitrogen</td><td>B6810</td><td>Zellundurchlässig</td></tr><tr><td>Name des Gerätes</td><td>Firma</td><td>Katalognummer</td><td>Bemerkungen</td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td>Tissue Slicing</td></tr><tr><td>Cyanoacryl Kleber (Roti-Coll1)</td><td>Carl Roth GmbH+Co</td><td>Art-Nr. 0258.1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroelektrodenabzieher</td><td>Narshige International USA</td><td>PP-83</td><td></td></tr><tr><td>Mikroelektrode Kapillarrohre</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microfil 34 g</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter</td><td>Corning</td><td>#431212</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>DM LFS</td><td>Mit 4X, 40X UV und 63X UV-Objektiven und Epifluoreszenz</td></tr><tr><td>CCD Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA ER</td><td>12 Bit CCD</td></tr><tr><td>Fura-2 Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>71500A</td><td>Set mit UG11 Filter</td></tr><tr><td>Polychrome</td><td>IV Till Photonics GmBH</td><td></td><td>Monochronometer</td></tr><tr><td>Ultraviolett blockierende Schutzbrille</td><td>Ultraviolett Produkte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EPC-9 Verstärker</td><td>HEKA Eletronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metafluor</td><td>Molekulare Bauelemente</td><td></td><td>Imaging Software</td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>HEKA Eletronik</td><td></td><td>Datenerfassungssoftware</td></tr><tr><td>Igor Version 6</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>Elektrophysiologie & Ca2+ Datenanalyse</td></tr><tr><td>VAPRO 5520</td><td>Westcor</td><td></td><td>Dampfdruckosmometer</td></tr></tbody></table>

gleichzeitige elektrophysiologische aufzeichnung und calcium-bildgebung von neuronen des suprachiasmatischen kerns

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Gleichzeitige elektrophysiologische und fluoreszierende bildgebende Aufzeichnungsmethoden wurden verwendet, um die Rolle von Änderungen des Membranpotentials oder des Membranstroms bei der Regulierung der intrazellulären Kalziumkonzentration zu untersuchen. Veränderte Umweltbedingungen, wie z. B. der Hell-Dunkel-Zyklus, können die Aktivität neuronaler und neuronaler Netzwerke und die Expression einer Familie von Genen für die zirkadiane Uhr im suprachiasmatischen Kern (SCN) verändern, dem Ort der zirkadianen Uhr im Gehirn von Säugetieren. Die exzitatorische synaptische Übertragung führt zu einem Anstieg der postsynaptischen Ca2+-Konzentration, von der angenommen wird, dass sie die Signalwege aktiviert, die die rhythmische Expression von Genen der zirkadianen Uhr verschieben. Hypothalamusschnitte, die das SCN enthielten, wurden mit Mikroelektroden gepflastert, die mit einer internen Lösung gefüllt waren, die den Calciumindikator Bis-Fura-2 enthielt. Nachdem eine Versiegelung zwischen der Mikroelektrode und der neuronalen Membran des SCN gebildet worden war, wurde die Membran durch sanftes Saugen aufgerissen und die Kalziumsonde in das Neuron diffundiert, wodurch sowohl das Soma als auch die Dendriten gefüllt wurden. Quantitative ratiometrische Messungen der intrazellulären Calciumkonzentration wurden gleichzeitig mit dem Membranpotential bzw. -strom aufgezeichnet. Mit diesen Methoden ist es möglich, die Rolle von Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration zu untersuchen, die durch synaptische Aktivität und das Feuern des Aktionspotentials einzelner Neuronen hervorgerufen werden. In dieser Präsentation demonstrieren wir die Methoden zur gleichzeitigen Aufzeichnung der elektrophysiologischen Aktivität zusammen mit intrazellulärem Kalzium von einzelnen SCN-Neuronen, die in Hirnschnitten gehalten werden.

Unter Verwendung von hypothalamischen Gehirnschnitten haben wir gleichzeitig Änderungen des intrazellulären Kalziums im Ganzzellmodus sowohl im Spannungs- als auch im Strom-Klemm-Modus aufgezeichnet. Die in Abbildung 1A gezeigte Mikroelektrode wird unter hoher Vergrößerung (40X oder 63X UV-Objektive) mit leichtem positivem Druck in Position gebracht. Nach Kontakt mit dem Neuron wird durch sanftes Absaugen ein Gigaohm-Siegel gebildet. Im Spannungsklemm-Modus wird nach Einstellung des Zellmembranpotentials...

Es werden Verfahren beschrieben, um gleichzeitige Aufzeichnungen des Membranpotentials oder -stroms und Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration durchzuführen. Neuronen des suprachiasmatischen Kerns werden mit dem Kalziumindikator Bis-Fura-2 unter Verwendung einer Patch-Clamp-Elektrode in der Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration gefüllt.

Gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnung und Calcium-Bildgebung von Neuronen des suprachiasmatischen Kerns

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Wechselwirkung zwischen Änderungen der Spannung oder des Stroms zu untersuchen, wie z. B. Änderungen der Wirkung, der potentiellen Feuerfrequenz und der intrazellulären Kalziumkonzentration in supramatischen Kernneuronen. Dies wird erreicht, indem die Hirnscheibe für die Aufzeichnung von SMA-Kernneuronen mit einer Mikroelektrode vorbereitet wird, die mit der kalziumempfindlichen Sonde gefüllt ist. In einem zweiten Schritt wird die Mikroelektrode mit der neuronalen Membran versiegelt.Als nächstes wird die mit der Mikroelektrode versiegelte neuronale Membran aufgebrochen, um die Kalziumfluoreszenzsonde in einzelne Neuronen einzuführen und zusammen mit der Membran elektrische Aktivitätsergebnisse aufzuzeichnen, die Messungen der Spannung oder des Stroms und Bilder der Kalziumsondenfluoreszenz bei zwei Wellenlängen zeigen. Die Änderung des Fluoreszenzverhältnisses bei diesen Wellenlängen spiegelt die Änderung des intrazellulären Kalziums innerhalb des Neurons wider. Eine anschließende Analyse kann durchgeführt werden, um die Kalziumkonzentration der Zelle zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Veränderungen der elektrischen Aktivität der Membran und des intrazellulären Kalziums, die durch synaptische Aktivierung produziert werden, gleichzeitig in einzelnen suprakosmetischen Kernneuronen gemessen werden können.Diese Technik wird von meinem Kollegen Dr. Robert Irwin demonstriert. Beginnen Sie diese Prozedur, indem Sie das Rattengehirn auf ein kreisförmiges, mit Schnittlösung angefeuchtetes Filterpapier auf eine gläserne Petrischale legen, auf Eis ruhen, die Gehirnkorona nur durchschneiden, um das Kleinhirn und den Hirnstamm zu entfernen, und Teile der rechten und linken Seite des Kortex abschneiden, wobei ein Gehirnblock mit dem Hypothalamus übrig bleibt und die ventrale Seite des Gehirns, die die SCN-Sehnerven und das Chiasma opticum enthält, sorgfältig erhalten bleibt. Verteilen Sie danach eine dünne Schicht Sano-Acrylkleber, groß genug, um die Gehirn- und Aros-Blöcke in einer eiskalten Mikrotom-Schneidekammer zu befestigen.Übertragen Sie den eiskalten Gehirnblock mit der Co-Seite nach unten auf den Kleber, wobei die Seite mit dem SCN zuerst zum Schneiden positioniert ist und die Sehnerven ein V bilden, das nach oben zeigt, platzieren Sie die Aros-Blöcke auf drei anderen Seiten. Füllen Sie anschließend die Kammer mit eiskaltem Schneidepuffer und sprudeln Sie kontinuierlich mit Carbogen. Der Sano-Acrylkleber verfestigt sich mit Feuchtigkeit und hält die Gehirn- und Aros-Blöcke an Ort und Stelle.Schneiden Sie dann die koronalen Hypothalamusscheiben, die den SCN enthalten, mit einer Dicke von 220 bis 250 Mikrometern ab. Beachten Sie, dass sich der linke Aros-Block während des Schneidens gelöst hat. Dies kann passieren, wenn nicht genügend Klebstoff aufgetragen wird.Identifizieren Sie danach den Slice, der den SCN enthält. Typischerweise wird eine Scheibe gewählt, bei der das Chiasma opticum einen Durchmesser von etwa zwei bis vier Millimetern hat und wie ein weißes Band erscheint, wobei das SCN gerade dorsal als zwei kleine Vertiefungen im Chiasma opticus auf beiden Seiten des dritten Ventrikels erscheint. Übertragen Sie eine Scheibe in die 36 Grad Celsius heiße Aufnahmekammer, die auf dem Tisch eines Mikroskops montiert ist.Die Kammer wird mit kontinuierlich fließender Aufzeichnungslösung mit zwei Millilitern pro Minute gefüllt. Belüftet mit 95%-Carbogen und vorgewärmt mit einer Inline-Heizung. Identifizieren Sie das SCN, indem Sie die beiden durchscheinenden SCN-Kerne auf beiden Seiten des dritten Ventrikels beobachten, dorsal zum Chiasma opticus, das bei Beleuchtung durch durchgelassenes Licht wie ein schwarzes Band erscheint.Um die Mikroelektrode für die Aufzeichnung vorzubereiten, füllen Sie sie mit der internen Lösung auf, die die Kalziumsonde enthält, die mit einem Vier-Millimeter-Spritzenvorsatzfilter über ein Mikrofill-Röhrchen filtriert wird. Setzen Sie dann die Mikroelektrode in den Mikroelektrodenhalter ein. Üben Sie anschließend eine kleine Menge kontinuierlichen Überdrucks auf die Elektrode aus.Senken Sie die Mikroelektrode unter Anleitung der Rotlichtbeleuchtung in die Aufnahmekammer ab. Platzieren Sie dann die Mikroelektrode mit einem Objektiv mit geringer Leistung über dem SCN. Schalten Sie danach das Mikroskop auf eine Hochleistungsvergrößerung um, um eine Unterregion von SCN und ein einzelnes SCN-Neuron auszuwählen.Üben Sie weiterhin einen sanften Überdruck auf die Mikroelektrode aus, während sie auf die Zelloberfläche vorgeschoben wird. Sobald es auf der Oberfläche ist, üben Sie einen sanften Unterdruck aus, um eine Dichtung mit einem Widerstand von drei bis 10 Gigaohm zu bilden. Stellen Sie danach die Membranspannung auf minus 60 Millivolt ein.Üben Sie dann zusätzlichen Unterdruck auf die Elektrode aus, um die Zellmembran aufzubrechen, um die gesamte Zellpflasterklemmung zu bilden. Beim Eintritt in den Ganzzellmodus werden das SCN-Neuron, das Soma und die Dendriten mit der Fluoreszenzsonde gefüllt. Messen Sie die Membranspannung im Stromzangenmodus oder den Strom im Spannungsklemmmodus.Während die Bilddaten der Kalziumsonde überwacht und gespeichert werden, können die aufgenommenen Bilder zusammen mit einem Diagramm mit Fluoreszenzdaten im Verhältnis von 340 Nanometern und 380 Nanometern betrachtet werden. Während des Experiments wird ein Mono-Chronometer verwendet, um die Kalziummessungen quantitativ zu erhalten, indem der SCN schnell UV-Licht ausgesetzt wird. Bei 340 Nanometern und 380 Nanometern durchläuft das Anregungslicht einen optischen Filter UG 11, um harmonische Wellenlängen über 400 Nanometer zu begrenzen, und ein dichroitischer DCLP-Spiegel mit 400 Nanometern reflektiert das Licht auf das Gewebe.Das emittierte Licht durchläuft einen 510-Nanometer-Emissionsfilter und wird von der Kamera erfasst. Um das Ergebnis zu analysieren, wählen Sie einen Bereich von Interesse aus dem Ausgangsbild und einen Hintergrundbereich aus, der in relative Fluoreszenzintensitätseinheiten konvertiert werden soll. Die Daten der Region of Interest werden während des Experiments in Echtzeit angezeigt.Der Hintergrund wird später in der nachfolgenden Datenanalyse verwendet. Hier ist ein Hellfeldbild eines koronalen Schnitts des Hypothalamus, der das SCN und das Chiasma opticum enthält. Eine Mikroelektrode aus Glas, die mit einer internen Lösung gefüllt ist, die BISRA zwei enthält, wird auf ein einzelnes Neuron versiegelt.Hier sind die Kalziumreaktionen auf eine Reihe von 50 Spannungsschritten dargestellt, die von einem spannungsgeklemmten SCN-Neuron aufgezeichnet wurden. Die spannungsgesteuerten Natriumströme wurden mit 0,5 mikromolaren TTX gehemmt, und dies ist ein Screen-Capture-Bild von somatischen und dendritischen Regionen von Interesse, die den Kalziumreaktionen entsprechen. Dies sind Beispiele für Kalziumreaktionen auf eine variable Anzahl von Spannungsstufen.Diese Abbildung zeigt die gleichzeitige Aufzeichnung der Membranspannung und des intrazellulären Kalziums. In einem SCN-Neuron wurde das Stromklemmenexperiment in Gegenwart von 50 mikromolaren Ritoxinen durchgeführt. Eine kleine Depolarisation des Membranpotentials löste mehrere Wirkungsschübe aus, wobei das Potentialfeuer mit einem entsprechenden Anstieg und anschließenden Abfall des intrazellulären Kalziums einherging.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man gesunde suprakosmetische Kernhirnschnitte vorbereitet und gleichzeitig elektrophysiologische und bildgebende Experimente durchführt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit ultraviolettem Licht extrem gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines angemessenen Augenschutzes getroffen werden sollten.

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