Gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnung und Calcium-Bildgebung von Neuronen des suprachiasmatischen Kerns

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Wechselwirkung zwischen Änderungen der Spannung oder des Stroms zu untersuchen, wie z. B. Änderungen der Wirkung, der potentiellen Feuerfrequenz und der intrazellulären Kalziumkonzentration in supramatischen Kernneuronen. Dies wird erreicht, indem die Hirnscheibe für die Aufzeichnung von SMA-Kernneuronen mit einer Mikroelektrode vorbereitet wird, die mit der kalziumempfindlichen Sonde gefüllt ist. In einem zweiten Schritt wird die Mikroelektrode mit der neuronalen Membran versiegelt.

Als nächstes wird die mit der Mikroelektrode versiegelte neuronale Membran aufgebrochen, um die Kalziumfluoreszenzsonde in einzelne Neuronen einzuführen und zusammen mit der Membran elektrische Aktivitätsergebnisse aufzuzeichnen, die Messungen der Spannung oder des Stroms und Bilder der Kalziumsondenfluoreszenz bei zwei Wellenlängen zeigen. Die Änderung des Fluoreszenzverhältnisses bei diesen Wellenlängen spiegelt die Änderung des intrazellulären Kalziums innerhalb des Neurons wider. Eine anschließende Analyse kann durchgeführt werden, um die Kalziumkonzentration der Zelle zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Veränderungen der elektrischen Aktivität der Membran und des intrazellulären Kalziums, die durch synaptische Aktivierung produziert werden, gleichzeitig in einzelnen suprakosmetischen Kernneuronen gemessen werden können.

Diese Technik wird von meinem Kollegen Dr. Robert Irwin demonstriert. Beginnen Sie diese Prozedur, indem Sie das Rattengehirn auf ein kreisförmiges, mit Schnittlösung angefeuchtetes Filterpapier auf eine gläserne Petrischale legen, auf Eis ruhen, die Gehirnkorona nur durchschneiden, um das Kleinhirn und den Hirnstamm zu entfernen, und Teile der rechten und linken Seite des Kortex abschneiden, wobei ein Gehirnblock mit dem Hypothalamus übrig bleibt und die ventrale Seite des Gehirns, die die SCN-Sehnerven und das Chiasma opticum enthält, sorgfältig erhalten bleibt. Verteilen Sie danach eine dünne Schicht Sano-Acrylkleber, groß genug, um die Gehirn- und Aros-Blöcke in einer eiskalten Mikrotom-Schneidekammer zu befestigen.

Übertragen Sie den eiskalten Gehirnblock mit der Co-Seite nach unten auf den Kleber, wobei die Seite mit dem SCN zuerst zum Schneiden positioniert ist und die Sehnerven ein V bilden, das nach oben zeigt, platzieren Sie die Aros-Blöcke auf drei anderen Seiten. Füllen Sie anschließend die Kammer mit eiskaltem Schneidepuffer und sprudeln Sie kontinuierlich mit Carbogen. Der Sano-Acrylkleber verfestigt sich mit Feuchtigkeit und hält die Gehirn- und Aros-Blöcke an Ort und Stelle.

Schneiden Sie dann die koronalen Hypothalamusscheiben, die den SCN enthalten, mit einer Dicke von 220 bis 250 Mikrometern ab. Beachten Sie, dass sich der linke Aros-Block während des Schneidens gelöst hat. Dies kann passieren, wenn nicht genügend Klebstoff aufgetragen wird.

Identifizieren Sie danach den Slice, der den SCN enthält. Typischerweise wird eine Scheibe gewählt, bei der das Chiasma opticum einen Durchmesser von etwa zwei bis vier Millimetern hat und wie ein weißes Band erscheint, wobei das SCN gerade dorsal als zwei kleine Vertiefungen im Chiasma opticus auf beiden Seiten des dritten Ventrikels erscheint. Übertragen Sie eine Scheibe in die 36 Grad Celsius heiße Aufnahmekammer, die auf dem Tisch eines Mikroskops montiert ist.

Die Kammer wird mit kontinuierlich fließender Aufzeichnungslösung mit zwei Millilitern pro Minute gefüllt. Belüftet mit 95%-Carbogen und vorgewärmt mit einer Inline-Heizung. Identifizieren Sie das SCN, indem Sie die beiden durchscheinenden SCN-Kerne auf beiden Seiten des dritten Ventrikels beobachten, dorsal zum Chiasma opticus, das bei Beleuchtung durch durchgelassenes Licht wie ein schwarzes Band erscheint.

Um die Mikroelektrode für die Aufzeichnung vorzubereiten, füllen Sie sie mit der internen Lösung auf, die die Kalziumsonde enthält, die mit einem Vier-Millimeter-Spritzenvorsatzfilter über ein Mikrofill-Röhrchen filtriert wird. Setzen Sie dann die Mikroelektrode in den Mikroelektrodenhalter ein. Üben Sie anschließend eine kleine Menge kontinuierlichen Überdrucks auf die Elektrode aus.

Senken Sie die Mikroelektrode unter Anleitung der Rotlichtbeleuchtung in die Aufnahmekammer ab. Platzieren Sie dann die Mikroelektrode mit einem Objektiv mit geringer Leistung über dem SCN. Schalten Sie danach das Mikroskop auf eine Hochleistungsvergrößerung um, um eine Unterregion von SCN und ein einzelnes SCN-Neuron auszuwählen.

Üben Sie weiterhin einen sanften Überdruck auf die Mikroelektrode aus, während sie auf die Zelloberfläche vorgeschoben wird. Sobald es auf der Oberfläche ist, üben Sie einen sanften Unterdruck aus, um eine Dichtung mit einem Widerstand von drei bis 10 Gigaohm zu bilden. Stellen Sie danach die Membranspannung auf minus 60 Millivolt ein.

Üben Sie dann zusätzlichen Unterdruck auf die Elektrode aus, um die Zellmembran aufzubrechen, um die gesamte Zellpflasterklemmung zu bilden. Beim Eintritt in den Ganzzellmodus werden das SCN-Neuron, das Soma und die Dendriten mit der Fluoreszenzsonde gefüllt. Messen Sie die Membranspannung im Stromzangenmodus oder den Strom im Spannungsklemmmodus.

Während die Bilddaten der Kalziumsonde überwacht und gespeichert werden, können die aufgenommenen Bilder zusammen mit einem Diagramm mit Fluoreszenzdaten im Verhältnis von 340 Nanometern und 380 Nanometern betrachtet werden. Während des Experiments wird ein Mono-Chronometer verwendet, um die Kalziummessungen quantitativ zu erhalten, indem der SCN schnell UV-Licht ausgesetzt wird. Bei 340 Nanometern und 380 Nanometern durchläuft das Anregungslicht einen optischen Filter UG 11, um harmonische Wellenlängen über 400 Nanometer zu begrenzen, und ein dichroitischer DCLP-Spiegel mit 400 Nanometern reflektiert das Licht auf das Gewebe.

Das emittierte Licht durchläuft einen 510-Nanometer-Emissionsfilter und wird von der Kamera erfasst. Um das Ergebnis zu analysieren, wählen Sie einen Bereich von Interesse aus dem Ausgangsbild und einen Hintergrundbereich aus, der in relative Fluoreszenzintensitätseinheiten konvertiert werden soll. Die Daten der Region of Interest werden während des Experiments in Echtzeit angezeigt.

Der Hintergrund wird später in der nachfolgenden Datenanalyse verwendet. Hier ist ein Hellfeldbild eines koronalen Schnitts des Hypothalamus, der das SCN und das Chiasma opticum enthält. Eine Mikroelektrode aus Glas, die mit einer internen Lösung gefüllt ist, die BISRA zwei enthält, wird auf ein einzelnes Neuron versiegelt.

Hier sind die Kalziumreaktionen auf eine Reihe von 50 Spannungsschritten dargestellt, die von einem spannungsgeklemmten SCN-Neuron aufgezeichnet wurden. Die spannungsgesteuerten Natriumströme wurden mit 0,5 mikromolaren TTX gehemmt, und dies ist ein Screen-Capture-Bild von somatischen und dendritischen Regionen von Interesse, die den Kalziumreaktionen entsprechen. Dies sind Beispiele für Kalziumreaktionen auf eine variable Anzahl von Spannungsstufen.

Diese Abbildung zeigt die gleichzeitige Aufzeichnung der Membranspannung und des intrazellulären Kalziums. In einem SCN-Neuron wurde das Stromklemmenexperiment in Gegenwart von 50 mikromolaren Ritoxinen durchgeführt. Eine kleine Depolarisation des Membranpotentials löste mehrere Wirkungsschübe aus, wobei das Potentialfeuer mit einem entsprechenden Anstieg und anschließenden Abfall des intrazellulären Kalziums

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man gesunde suprakosmetische Kernhirnschnitte vorbereitet und gleichzeitig elektrophysiologische und bildgebende Experimente durchführt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit ultraviolettem Licht extrem gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines angemessenen Augenschutzes getroffen werden sollten.