Name: Aus Abwasser gewonnene elektroaktive mikrobielle Biofilme: Wachstum, Erhaltung und grundlegende Charakterisierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Lernen Sie die Kultivierung anodischer elektroaktiver mikrobieller Biofilme aus Abwasser in einem potentiostatgesteuerten Fed-Batch-Reaktor. Die zyklische Voltammetrie ermöglicht die Charakterisierung des extrazellulären Elektronentransfers.

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F.H. bedankt sich für die Unterstützung durch das BMBF (Forschungspreis "Next generation biotechnological processes - Biotechnology 2020+") und die Helmholtz-Gemeinschaft (Nachwuchsgruppe).

Da das Auswahlverfahren im bioelektrochemischen Fed-Batch-Reaktor aufgrund der Wahl des Substrats und der anoxischen Bedingungen sehr spezifisch ist, ist das Arbeiten unter sterilen Bedingungen für das demonstrierte Beispiel nicht erforderlich.
1. Vorbereitung des Wachstumsmediums
<ol>
	<li>Bereiten Sie eine geeignete Menge des Wachstumsmediums vor, indem Sie einen Phosphatpuffer nach Kim et al. verwenden.13 (siehe Tabelle 1). Hierbei dient Natriumacetat (10 mM) als Substrat. Das in diesem Artikel verwendete Wachstumsmedium ist nur ein Beispiel und kann je nach experimentellem Zweck in seinen Komponenten variieren.</li>
	<li>1 ml Primärabwasser pro 20 ml Nährmedium als Inokulum zugeben. Die Abwasserprobe wird nach der mechanischen Filtration aus einer kommunalen Kläranlage entnommen (siehe z.B. Abbildung 2) und kann bis zur Verwendung in einem geschlossenen Behälter bei 4 °C gelagert werden. 
	(Hinweis: Je nach Zielsetzung des Experiments kann die genaue anfängliche Zellzahl wichtig sein und sollte dann bestimmt werden. Im gezeigten Beispiel ist die anfängliche Zellzahl nicht wichtig, da der Biofilm Steady-State-Bedingungen erreicht.)</li>
	<li>Spülen Sie das Medium einschließlich des Inokulums mindestens 30 Minuten lang mit Stickstoff, um es zu entlüften, indem Sie eine Nadel in das Medium einführen und den Stickstoffstrom einschalten. Der Strahl sollte stark genug sein, dass Sie eine vollständige Durchmischung des Mediums beobachten können. 
	(Hinweis: Je nach Volumen des Mediums sollte sogar eine Verlängerung der Entgasungszeit in Betracht gezogen werden. Während der Entgasungseinrichtung wird der Fed-Batch-Reaktor (Schritte 2.1-2.2))</li>
</ol>
2. Aufbau des Fed-Batch-Reaktors
<ol>
	<li>Man nehme ein geeignetes Reaktorgefäß – hier kommt ein modifizierter 4-Hals-Rundkolben mit 250 ml zum Einsatz. 
	(Hinweis: Im Allgemeinen sollte das Schiff mindestens vier Buchten haben. Diese sind für die drei Elektroden und für die Probenahme/den Medienaustausch notwendig. Produzierte Gasmengen können vernachlässigt werden, wenn der Reaktor aufgrund von Probenahmen oder Medienwechsel regelmäßig geöffnet wird, alternativ sollte ein Blasenzähler installiert werden. Um unerwünschtes phototropes Wachstum zu vermeiden, sollten die Reaktoren vor direkter Lichteinwirkung geschützt werden.)</li>
	<li>Für den Drei-Elektroden-Aufbau (siehe Abbildung 3 und Abschnitt 3 für Details) die Referenzelektrode (RE) (hier Ag/AgCl, sat. KCl, 0,197 V vs. SHE), die Arbeitselektrode (WE) und die Gegenelektrode (CE) durch einzelne Einlässe über Silikonstopfen in den Kolben legen – luftdicht verschließen. 
	(Hinweis: Da WE und CE Graphitstäbe verwendet werden. Der Draht der Elektroden wird durch den Silikonstecker gezogen und von außen fixiert. Die Referenzelektrode wird über eine Bohrung durch den Silikonstecker geführt. Um Kurzschlüsse zu vermeiden, ist darauf zu achten, dass auch beim Rühren oder bei der Umwälzung des Mediums kein physischer Kontakt der Elektroden besteht. Platzieren Sie die Elektroden so, dass sie vollständig mit mittlerer Lösung bedeckt sind. Zum Abdichten den Silikonstopfen jedes Einlasses mit Parafilm umwickeln.)</li>
	<li>Gießen Sie das Wachstumsmedium einschließlich des Inokulums (hier 250 ml) durch die Probenahmeöffnung in den Reaktor und spülen Sie es mit Stickstoff.</li>
	<li>Verschließen Sie den letzten Einlass mit einem Silikonstopfen und verschließen Sie ihn luftdicht. Hinweis: Spuren von Sauerstoff können den Biofilmen der gemischten Spezies nichts anhaben. Sie sind in der Lage, einem geringen Sauerstoffgehalt standzuhalten und ihn sogar zu verbrauchen, was wiederum den CE-Wert senken kann.</li>
</ol>
3. Wachstum des chronoamperometrischen Biofilms
<ol>
	<li>Verbinden Sie die Elektroden mit den entsprechenden Kabeln des Potentiostaten. Stellen Sie das Gefäß in eine temperierte Kammer, hier wird 35 °C31 verwendet, um konstante Umgebungsbedingungen zu gewährleisten.</li>
	<li>Öffnen Sie die Software zur Steuerung des Potentiostaten und wählen Sie die Technik: Chronoamperometrie. Stellen Sie die Parameter z.B. wie folgt ein: Ein konstantes Potential EWE von 0,2 V (vs. Ag/AgCl) für eine Dauer von t von 500 h (≈ 20 Tage). Der Strom wird minütlich in Zeitschritten dti aufgezeichnet. 
	Hinweis: Die Wahl des angewandten Potentials ist abhängig vom untersuchten System/Mikroorganismus. Im Allgemeinen werden Anodenprozesse bei positivem Potential und Kathodenprozesse bei negativen Potentialen untersucht. Man kann auch aus den Standardpotentialen des Elektronendonors/-akzeptors und dem formalen Potential der zu erwartenden mikrobiellen Elektronentransferstelle ein geeignetes Potential ableiten, hier als Ausgangspunkt verweisen wir auf die aktuelle Literatur.</li>
	<li>Starten Sie die Chronoamperometrie. Ein Diagramm des gemessenen Stroms über die Zeit wird von der Software grafisch dargestellt, der beobachtete maximale Strom (imax) ist ein wichtiger Online-Parameter, wie in den Abschnitten 4 und 5 beschrieben. </li>
</ol>
4. Pflege von Biofilmen
<ol>
	<li>Abhängig von den Umgebungsbedingungen, z.B. der Temperatur, beginnt ein oxidativer Strom zu fließen und erreicht ein Plateau (siehe Abbildung 4). Wenn Sie wieder Nullstrom erreicht haben, unterbrechen Sie die chronoamperometrische Messung und füllen Sie die mittlere Lösung auf. Für ein schnelleres Biofilmwachstum ersetzen Sie das Medium direkt nach Erreichen des Plateaus des maximalen Stroms. Öffnen Sie die Probenahmeöffnung und entladen Sie das Medium vorsichtig, ohne den dünnen Biofilm zu zerstören. Beim Nachfüllen des Mediums wieder mit Stickstoff spülen. Probenahmeöffnung verschließen und luftdicht verschließen.</li>
	<li>Das Verfahren in Schritt 4.1 wird wiederholt, bis der maximale oxidative Strom einen stationären Zustand erreicht (siehe Abbildung 4). 
	(Hinweis: Es wird angenommen, dass eine Konstante imax auf eine stabile Steady-State-Biofilmbildung hinweist.)</li>
	<li>Entnehmen Sie 1 ml Proben der frischen und der ausgetauschten Mediumlösungen für die Substratanalyse, z.B. mittels HPLC. Die anfängliche Substratkonzentration (c0) sowie die Konzentration der restlichen Substratlösung (c1) werden anschließend für die Effizienzberechnung benötigt (siehe Abschnitt Datenanalyse). 
	Hinweis: Um unverfälschte Ergebnisse zu erzielen, z.B. durch weiteren Substratverbrauch, analysieren Sie die Substratproben sofort. Wenn dies nicht möglich ist, lagern Sie die Proben nicht länger als einen Monat in einem Gefrierschrank bei mindestens -18 °C.)</li>
</ol>
5. Anwendung der zyklischen Voltammetrie zur Untersuchung der EET
<ol>
	<li>Führen Sie eine zyklische Voltammetrie bei den Maxima und Minima des Stromflusses durch, wie angegeben (Abbildung 4). Abhängig von der Fragestellung, die von Interesse ist, wird der CV in der Regel durchgeführt, wenn das System den stationären Zustand erreicht hat, um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten. (Anmerkung: Die Stromerzeugung wird als Umsatzbedingungen bezeichnet und bezieht sich auf die mikrobielle Oxidation des Substrats und den anschließenden Elektronentransfer: mikrobielle Bioelektrokatalyse; während die CVs ohne Umsatz bei (nahezu) null Stromfluss in der CA durchgeführt werden.)</li>
	<li>Wählen Sie in der Potentiostatensteuerungssoftware die Technik: Zyklische Voltammetrie und stellen Sie die entsprechenden Parameter ein, hier zum Beispiel: Ein Anfangspotential des EWE bis Ei von -0,5 V vs. RE mit einer Abtastrate v=dE/dt von 1 mV/sec auf ein Vertexpotential E1 von 0,3 V vs. RE und zurück auf das Startpotential E2 = Ei von -0,5 V. 
Anmerkung: Bei Verwendung der zyklischen Voltammetrie wird die angelegte Spannung am WE durch den Potentiostaten linear mit der Zeit geändert (siehe Abbildung 5) - Kasten 2 enthält die wichtigsten Regeln für die Auswahl der Versuchsparameter und die Fehlersuche).</li>
	<li>Starten Sie die zyklische Voltammetrie und zeichnen Sie so viele Zyklen auf, wie für eine reproduzierbare CV erforderlich sind. In der Regel werden mindestens 3 Zyklen benötigt. Das resultierende Diagramm wird als zyklisches Voltammogramm bezeichnet (siehe auch Abbildung 7). Hinweis: Abhängig von den Messbedingungen können unterschiedliche Informationen gewonnen werden, wie im nächsten Abschnitt gezeigt.</li>
</ol>
6. Darstellen von Daten
Hier wird nur das Plotten der Daten besprochen. Eine ausführlichere Abhandlung folgt im nächsten Abschnitt. 
<ol>
	<li>Verwenden Sie eine entsprechende Datenanalysesoftware, hier werden alle Daten als Text exportiert und als ASCII-Datei importiert.</li>
	<li>Berechnen und verwenden Sie bevorzugt die Stromdichten (j) und nicht die absoluten Ströme (i). 
	(Hinweis: Da es jedoch verschiedene Protokolle zur Berechnung von j gibt, machen Sie deutlich, welches verwendet wurde. Hier wird die Stromdichte pro geometrischer, d.h. projiziert, wird die Oberfläche der Elektrode verwendet.)</li>
	<li>Chronoamperometrie: Plotten Sie die gemessene Stromdichte als Funktion der Zeit.</li>
	<li>Zyklische Voltammetrie: Plotten Sie die gemessene Stromdichte als Funktion des Potentials des WE E we.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Das vorgestellte Protokoll zeigt einen einfachen und unkomplizierten Weg zur Züchtung elektroaktiver mikrobieller Biofilme aus Abwasser, die mit Hilfe eines Drei-Elektroden-Aufbaus in einem Fed-Batch-Reaktor geimpft werden. Die Chronoamperometrie ermöglicht das Wachstum und die Selektion von elektroaktiven mikrobiellen Biofilmen aus verschiedenen Inokula sowie die grundlegende Charakterisierung der Biofilme in Bezug auf maximale Stromdichte und coulombische Effizienz. Die zyklische Voltammetrie ist eine nicht-invasive Technik, die es ermöglicht, grundlegende Studien zur EET-Thermodynamik des mikrobiellen Biofilms durchzuführen und somit mögliche und tatsächliche EET-Transferstellen zu identifizieren. Zusammen ermöglichen diese Parameter i) die Charakterisierung und den Vergleich verschiedener mikrobieller Biofilme unter identischen Bedingungen sowie ii) die Untersuchung des Einflusses verschiedener Betriebsbedingungen auf identische elektroaktive mikrobielle Biofilme. Diese Experimente können jedoch nur ein Ausgangspunkt sein. Einerseits erfordert das facettenreiche Feld der mikrobiellen Bioelektrochemie eine weitere und tiefgreifende Nutzung elektrochemischer Methoden und Protokolle. Dazu gehören beispielsweise Modelle zur Extraktion kinetischer und mechanistischer Daten sowie weitere Methoden wie die elektrochemische Impedanzspektroskopie34,35. Auf der anderen Seite können elektrochemische Methoden keine Informationen über die molekulare Beschaffenheit, die mikrobielle Zusammensetzung, die räumliche mikrobielle Organisation usw. liefern. Hier sind weitere Techniken erforderlich, die entweder nicht-invasiv und an die Elektrochemie gekoppelt oder invasiv sind4. Kasten 2 enthält eine kurze Diskussion über die kritischen Schritte bei der Durchführung der Experimente sowie über die erste Fehlerbehebung.

Aus ingenieurtechnischer Sicht ist zu berücksichtigen, dass die elektroaktive Biofilmanode nur eine Komponente der aktuellen mikrobiellen bioelektrochemischen Systeme ist und eine Vielzahl anderer Faktoren für vollständige Systeme analysiert werden muss36. Wir hoffen jedoch, dass dieser Video-Artikel dazu beitragen wird, die Kernelemente von BES, d.h. die mikrobiellen Elektroden, in Zukunft zu verstehen und anzupassen.

Die Aufklärung der Grundlagen des mikrobiellen extrazellulären Elektronentransfers (EET) und seine Nutzung in technischen Systemen ist ein wichtiges und schnell wachsendes Forschungs- und Entwicklungsgebiet1-3. Die Untersuchung dieser elektroaktiven (oder bioelektrokatalytisch oder elektrochemisch aktiven) Mikroorganismen, einschließlich reiner Stämme sowie definierter Co-Kulturen und komplexer Konsortien, erfordert ein komplexes Arsenal an Techniken, Methoden und Protokollen4. Diese Methoden stammen aus verschiedenen wissenschaftlichen Disziplinen, z.B. Elektrochemie, Materialwissenschaften, Mikrobiologie, und liefern Erkenntnisse auf verschiedenen Hierarchieebenen, z.B. vom gesamten mikrobiellen Biofilm bis hin zu einzelnen Molekülen. Dabei stellen die Elektrochemie und elektrochemische Methoden die Grundlage aller Aktivitäten dar.
Traditionell wurden Brennstoffzellen-Setups oft für das Wachstum und die Pflege von elektroaktiven mikrobiellen Kulturen im Archetyp dieser technischen Systeme verwendet: mikrobielle Brennstoffzellen (MFCs)5. Leider erlaubten diese Arten von MFCs oft keine Überwachung oder gar Steuerung des Potentials einer einzelnen Elektrode und somit waren nur begrenzte Einblicke in die Elektrodenprozesse möglich - es wurde nur die Zellspannung angegeben. Mittlerweile wird mehr und mehr anerkannt, dass die individuelle Überwachung und Steuerung der Potentiale einzelner Elektroden in MFCs nicht nur für die Grundlagenforschung, sondern auch für das Engineering einen klaren Vorteil darstellt. Darüber hinaus ist mit der Diversifizierung der Anwendungen mikrobieller elektrochemischer Technologien, die heute z. B. die Sanierung, Entsalzung, Synthese und sogar das Biocomputing in sogenannten mikrobiellen bioelektrochemischen Systemen (BES)2,6,7 umfassen, eine externe Kontrolle der einzelnen Elektrodenpotentiale oft erheblich. Diese Steuerung wird in der Regel durch den Einsatz von externen Stromquellen oder Potentiostaten erreicht. Dabei ermöglicht der Einsatz von Potentiostaten - im Gegensatz zu anderen Aufbauten - eine exakte Einstellung des individuellen Elektrodenpotentials. Dies ist von großer Bedeutung, da die Elektrode den terminalen mikrobiellen Elektronenakzeptor (für Anoden) oder Elektronendonor (für Kathoden) des extrazellulären Elektronentransfers darstellt. Abbildung 1 zeigt den aktuellen Kenntnisstand zur mikrobiellen EET an Anoden - siehe für Details z.B. 2,4,6,8,9 Die EET an der Kathode ist noch weitgehend unerschlossen10.
Die Kontrolle des Elektrodenpotentials ermöglicht somit nicht nur die Verwendung reproduzierbarer mikrobieller Kultivierungsbedingungen, sondern auch deren Anpassung an die EET-Thermodynamik11. In diesem Artikel wird gezeigt, wie die charakteristischen Parameter elektroaktiver mikrobieller Biofilme aus Fed-Batch-Reaktorexperimenten mittels Chronoamperometrie (CA) und zyklischer Voltammetrie (CV) extrahiert werden können. Dazu gehören die Leistungsparameter maximale Stromdichte (jmax) und Coulomb-Wirkungsgrad (CE) sowie EET-Kennlinien. Hier wird die Identifizierung der formalen Potentiale (Ef) von möglichen und tatsächlichen Elektronentransferstellen im Vordergrund stehen. Die Extraktion dieser Parameter wird am Beispiel von aus Abwässern gewonnenen Mischkultur-Biofilmen gezeigt, die von Geobacter spec dominiert werden. 12 Diese aus dem Abwasser gewonnenen Biofilme werden durch ein einfaches elektrochemisches Auswahlverfahren gewonnen, wie zahlreiche Forschungsgruppen auf der ganzen Welt gezeigthaben 13-16.
Dynamische elektrochemische Techniken zur Untersuchung des mikrobiellen extrazellulären Elektronentransfers
Für eine thermodynamische Charakterisierung der EET von elektroaktiven mikrobiellen Kulturen werden dynamische elektrochemische Techniken benötigt. Im Allgemeinen umfassen diese Techniken potentialgesteuerte, d.h. voltammetrische, und stromgesteuerte, d.h. Galvanodynamik, Techniken17. Dabei sind die potentialgesteuerten Techniken weiter verbreitet und umfassen beispielsweise die Rechteck-Voltammetrie und die lineare Sweep-Voltammetrie18. Am beliebtesten ist jedoch die zyklische Voltammetrie (CV)19,20. CV ist in verschiedenen Bereichen der Elektrochemie bekannt und weit verbreitet, die von der Batterieforschung über die Materialwissenschaften bis hin zur Enzymbioelektrochemiereichen 21. Seine Anwendung auf lebende mikrobielle Zellen kann nur auf mehr als ein Jahrzehnt zurückdatiert werden22 und hat in den letzten Jahren deutlich zugenommen23,24. Insbesondere die Kombination von CV- und spektroskopischen Methoden hat beispiellose Einblicke in die EET-Mechanismen und ihre molekulare Natur ermöglicht, z.B.25,26 Parallel dazu wurde der theoretische Rahmen für die Extraktion thermodynamischer und theoretischer Eigenschaften der mikrobiellen EET erweitert und vertieft27-30. Im Gegensatz dazu behindern experimentelle Fehlhandhabungen oder unzureichende Datenanalysen häufig die adäquate Anwendung der CV im Bereich der mikrobiellen Bioelektrochemie. Daher soll dieser Video-Artikel neben Workshops (z.B. auf der EU-ISMET 2012) und Tutorials19 eine grundlegende Anleitung für die Durchführung von zyklischen voltammetrischen Experimenten an elektroaktiven Bakterien bieten. Dabei konzentriert es sich auf die grundlegenden experimentellen Schritte und die grundlegende Datenanalyse und ist nicht dazu gedacht, die neuesten Protokolle der kinetischen Analyse bereitzustellen. Die wichtigsten Termini für die folgende Diskussion sind in Kasten 1 zusammengefasst (adaptiert von Harnisch und Freguia19 und modifiziert).

<table><tbody><tr><td>Primäres Abwasser</td><td>Kläranlage</td><td></td> Nach <td>mechanischer Filtration</td></tr><tr><td>entnommen 250 ml Rundkolben mit drei zusätzlichen Einläufen</td><td>Th.Geyer Berlin GmbH, Deutschland</td><td>9.011 845</td><td>Zusätzliche Einlässe wurden durch unseren hauseigenen Glasbläser angebracht</td></tr><tr><td>Ag/AgCl Referenzelektrode (sat. KCl, 0,195 V vs. SHE) mit Keramikmembran</td><td>Sensortechnik Meinsberg, Deutschland</td><td>SE 11</td><td></td></tr><tr><td>Graphitstäbe (&Oslash;=1 cm, l=3 und 5 cm)</td><td>CP-Handels-GmbH, Wachtberg, Deutschland</td><td></td><td>Als Elektrodenmaterial verwendet</td></tr><tr><td>Edelstahl, Nr. 1.4301, Draht Fe/Cr18/Ni10</td><td>Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Deutschland</td><td>155-923-05</td><td></td></tr><tr><td>Silikonstecker</td><td>Th.Geyer Berlin GmbH, Deutschland</td><td>9.230 512 und</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>neoLab, Heidelberg, Deutschland</td><td>3-1011</td><td>Zur Abdichtung zur Aufrechterhaltung anaerober Bedingungen</td></tr><tr><td>Potentiostat/ Galvanostat Modell MPG2</td><td>BioLogic Science Instruments, Frankreich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EC-Lab</td><td>BioLogic Science Instruments, Frankreich</td><td></td><td>Software zur Durchführung elektrochemischer Messungen</td></tr><tr><td>Origin 8.6</td><td>OriginLab</td><td></td><td>Software zur Datenanalyse</td></tr></tbody></table>

aus abwasser gewonnene elektroaktive mikrobielle biofilme: wachstum, erhaltung und grundlegende charakterisierung

Waste Water Derived Electroactive Microbial Biofilms: Growth, Maintenance, and Basic Characterization

Das Wachstum von anodischen elektroaktiven mikrobiellen Biofilmen aus Abwasserinokula in einem Fed-Batch-Reaktor wird mit einem Drei-Elektroden-Aufbau demonstriert, der von einem Potentiostaten gesteuert wird. Dabei ermöglicht der Einsatz von Potentiostaten eine exakte Einstellung des Elektrodenpotentials und sorgt für reproduzierbare mikrobielle Kultivierungsbedingungen. Während des Wachstums wird die aktuelle Produktion mit Hilfe der Chronoamperometrie (CA) überwacht. Basierend auf diesen Daten werden die maximale Stromdichte (jmax) und der coulombische Wirkungsgrad (CE) als Maße zur Charakterisierung der bioelektrokatalytischen Leistung diskutiert. Zyklische Voltammetrie (CV), eine zerstörungsfreie, d.h. Die nicht-invasive Methode wird verwendet, um den extrazellulären Elektronentransfer (EET) von elektroaktiven Bakterien zu untersuchen. CV-Messungen werden an anodischen Biofilmelektroden in Gegenwart des mikrobiellen Substrats durchgeführt, d.h. und in Abwesenheit des Substrats, d. h. bei Nicht-Umsatzbedingungen, mit unterschiedlichen Abtastraten. Anschließend wird die Datenanalyse veranschaulicht und grundlegende thermodynamische Parameter des mikrobiellen EET abgeleitet und erläutert: Peakpotential (Ep), Peakstromdichte (jp), formales Potential (Ef) und Peakabstand (ΔEp). Zusätzlich werden die Grenzen der Methode und der Stand der Datenanalyse thematisiert. Dabei soll dieser Video-Artikel eine Anleitung für die grundlegenden experimentellen Schritte und die grundlegende Datenanalyse geben.

Das chronoamperometrische Wachstum von anodischen elektroaktiven mikrobiellen Biofilmen in einem Fed-Batch-Reaktor unter Verwendung eines Drei-Elektroden-Aufbaus, gesteuert durch einen Potentiostaten, wird demonstriert. Der extrazelluläre Elektronentransfer wird mittels zyklischer Voltammetrie in Gegenwart des Elektronendonors und in Abwesenheit des Elektronendonors charakterisiert. Die fundamentale Datenanalyse wird demonstriert.

Aus Abwasser gewonnene elektroaktive mikrobielle Biofilme: Wachstum, Erhaltung und grundlegende Charakterisierung

The growth of anodic electroactive microbial biofilms from waste water inocula in a fed-batch reactor is demonstrated using a three-electrode setup ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen anodischen elektroaktiven mikrobiellen Biofilm aus Abwasserinokulation zu züchten und seine bioelektrokatalytischen Eigenschaften zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein potentiell statisch gesteuerter, bioelektrochemisch gespeister Chargenreaktor aufgebaut, geimpft und gestartet wird. Der zweite Schritt besteht darin, die aktuelle Produktion mit Hilfe der Krono-Pyrometrie zu überwachen.Anschließend wird das Medium nach der Substraterschöpfung regelmäßig gewechselt, bis eine reproduzierbare maximale Stromdichte erreicht ist, die eine stationäre Biofilmbildung darstellt. Der letzte Schritt besteht darin, den extrazellulären Elektronentransfer elektroaktiver Bakterien mittels zyklischer Vol telemetrie während des Vorhandenseins und Fehlens des Substrats zu untersuchen. Letztendlich liefert die Datenanalyse grundlegende Einblicke in die Thermodynamik des mikrobiellen Elektronentransfers und ermöglicht die Bestimmung des formalen Potentials möglicher und tatsächlicher extrazellulärer Elektronentransferstellen.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass man einen direkten Einblick in den Elektronentransfer zwischen Mikroorganismen und festen Elektroden erhalten und so grundlegende Informationen über den mikrobiellen extrazellulären Elektronentransfer ableiten kann. Im Allgemeinen werden Personen, die mit der Methode noch nicht vertraut sind, mit der richtigen Parameterwahl und der korrekten Interpretation des abgeleiteten Diagramms zu kämpfen haben. Bei der Datenerfassung und Datenanalyse können schwerwiegende Fehler gemacht werden.Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, bereiten Sie eine geeignete Menge des Wachstumsmediums unter Verwendung eines Phosphatpuffers vor, einschließlich weiterer Nährstoffe gemäß der folgenden Referenz. Verwenden Sie 10 Millimolar Natriumacetat als Substrat. Pro 20 Milliliter Wachstum wird ein Milliliter Primärabwasser zugegeben, Medium als Inokulum.Führen Sie dann eine Nadel in das Medium ein und spülen Sie es mindestens eine halbe Stunde lang mit Stickstoff. Um es beim Spülen mit Stickstoff zu entlüften, messen Sie die Größe der Elektrode für den Aufbau mit drei Elektroden. Die Arbeitselektrode, die Gegenelektrode und die Referenzelektrode werden über Silikonstopfen in einen modifizierten 250-Milliliter-Rundkolben mit vier Halsen eingeführt.Umwickeln Sie die Silikonstopfen mit Paraform, um das System abzudichten, während Sie es mit Stickstoff spülen. Gießen Sie 250 Milliliter des Wachstumsmediums und des Inokulumgemisches durch die Probenahmeöffnung in den Reaktor. Verschließen Sie die Probenahmeöffnung mit einem Silikonstopfen und verschließen Sie sie luftdicht mit Perfil.Stellen Sie das Gefäß in eine 35 Grad Celsius heiße Kammer, um konstante Umgebungsbedingungen zu gewährleisten. Verbinden Sie als nächstes die Elektroden mit den entsprechenden Kabeln des Potentialstats. Öffnen Sie die Software, um den potenziellen Wert zu steuern, und wählen Sie die Technik aus.Chrono-Pyrometrie. Stellen Sie die Arbeitselektrode für eine Dauer von 500 Stunden auf ein konstantes Potential von 0,2 Volt ein und zeichnen Sie danach alle 600 Sekunden auf, starten Sie die Chronopyrometrie und beobachten Sie das Diagramm des gemessenen Stroms über die Zeit. Nach der Berechnung der bevorzugten Stromdichten wird die gemessene Stromdichte als Funktion der Zeit dargestellt.Nachdem der oxidative Strom ein Plateau erreicht hat und auf Nullstrom zurückkehrt, unterbrechen Sie die metrische Chrono-Ampere-Messung für einen Mediumaustausch. Übertragen Sie daher das Gefäß in eine Laminar-Flow-Box und spülen Sie das System mit Stickstoff. Das Medium vorsichtig entleeren und nach dem Nachfüllen des Mediums mit frischem, entlüftetem Medium auffüllen.Verschließen Sie die Probenahmeöffnung und verschließen Sie sie mit Paraform. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte, bis der maximale oxidative Strom einen stationären Zustand erreicht. Entnehmen Sie nach jedem Wachstumszyklus eine Milliliterprobe der frischen und der ausgetauschten Mediumlösungen für die Substratanalyse mittels HPLC. Um den extrazellulären Elektronentransfer zu untersuchen, wählen Sie die Technik zyklische Volumentelemetrie in der Software zur Steuerung der Potentiale.Stellen Sie dann das Anfangspotential EI der Arbeitselektrode auf minus 0,5 Volt gegenüber der Referenzelektrode, das Eckpotential E auf 0,3 Volt und das Endpotential E zwei auf minus 0,5 Volt ein. Verwenden Sie eine Abtastrate von einem Millivolt pro Sekunde. Starten Sie das Experiment und zeichnen Sie mindestens drei Zyklen auf, um einen reproduzierbaren Lebenslauf zu erhalten.Nach der Berechnung der bevorzugten Stromdichten wird die gemessene Stromdichte als Funktion des Potentials der Arbeitselektrode aufgetragen. Aus den metrischen Chrono-Ampere-Messungen können die maximale Stromdichte und der Kula-Wirkungsgrad gemessen werden. Hier ist eine typische chronometrische Biofilmwachstumskurve mehrerer Wachstumszyklen unter Verwendung eines Fed-Batch-Reaktors dargestellt.Nach der anfänglichen Verzögerungsphase beginnt ein erstes Maximum der Stromdichte, dann sinkt der Strom aufgrund der Erschöpfung des Substrats auf nahezu Null. Nach dem Nachfüllen des Substrats. Die Stromdichte steigt mit einer höheren maximalen Stromdichte wieder an.Nach mehreren Wachstumszyklen ist die maximale Stromdichte konstant, was auf eine Steady-State-Biofilmbildung hinweist. Als stationäres Maximum. Der Wert der Stromdichte hängt von mehreren Parametern ab.Es wird oft als eine Eigenschaft von elektroaktiven mikrobiellen Biofilm-Elektrodensystemen angesehen. Die zweite Betriebseigenschaft ist der omische Wirkungsgrad, d. h. die Anzahl der Elektronen, die als elektrischer Stromfluss pro gefüttertem Chargenzyklus aufgezeichnet werden, bezogen auf die theoretische maximale Anzahl von Elektronen. Im Textprotokoll finden Sie Einzelheiten zur Berechnung des Rufwirkungsgrads, des elektrischen Stromflusses und der theoretischen maximalen Anzahl der angezeigten Elektronen.Hier ist ein typischer Lebenslauf für Nicht-Fluktuationsbedingungen. Bei einer hohen Scanrate wird der CV eines Biofilms für hohe Scanraten abgebildet, bei dem nur ein Peakpaar und damit ein formales Potential EF identifiziert werden kann. Hier. Im Allgemeinen kann das formale Potential eines Redoxpaares aus dem Peakpotential des Oxidationspeaks EPA und dem Reduktionspeak der jeweiligen Spezies EPC berechnet werden.Bei der Bildung des arithmetischen Mittels finden Sie im Textprotokoll Einzelheiten zur Berechnung des formalen Potentials. Wenn eine ausreichend niedrige Scanrate auf den identischen Biofilm angewendet wird, können bis zu vier Redoxpaare identifiziert werden. Die Nicht-Umsatz-CV zeigt jedoch nur alle redoxaktiven Verbindungen an der Elektrode und damit die EF der möglichen extrazellulären Elektronentransferstellen.Nur die Analyse des Umsatz-CV liefert die EF der tatsächlichen EET-Standorte bei der weiteren Analyse der nicht umsatzbezogenen CVs. Weitere charakteristische Parameter wie Peakabstand, maximaler Spitzenstrom und minimale Spitzenstromdichte können analysiert werden. Diese Parameter, insbesondere wenn sie für unterschiedliche Abtastraten aufgezeichnet werden, können für mechanistische und kinetische Analysen von Elektronentransferprozessen an Elektroden verwendet werden.Diese kinetische Analyse, die für chemische Systeme gut etabliert ist, ist jedoch für elektroaktive mikrobielle Biofilme nicht einfach. Bei der Durchführung der CV-Messung in Gegenwart von Substrat wird ein Umsatz-CV erhalten. Nach dem Plotten der Daten wird die typische S-förmige bioelektrokatalytische Kurve beobachtet.Bei der weiteren Analyse der Daten liefert das Maximum der ersten Ableitung oder des Wendepunkts der Kurve das formale Potential EF der tatsächlichen EET-Stellen. Im Falle eines dünnen Biofilms, der von Geobacter-Verhältnissen dominiert wird, können zwei Wendepunkte beobachtet werden. Anschließend zeigt das Derivat zwei Maxima, die dem formalen Potential der bioelektrokatalytisch aktiven EET-Stellen entsprechen und als EF zwei bzw. EF drei bezeichnet werden.Dieser Befund zeigt auch, dass die Redoxprozesse, die mit den formalen Potentialen EF eins und EF vier assoziiert sind, nicht mit der Bioelektrolyse zusammenhängen. Wenn der Biofilm wächst und dicker wird, zeigt der CV nur einen Wendepunkt. Dieses formale Potential EEF minus 0,32 Volt gegenüber Silber, Silberchlorid entspricht in etwa dem arithmetischen Mittel der beiden formalen Potentiale, die dem EET des dünnen Biofilms zugeordnet sind.Dieses Ergebnis zeigt, dass die grundlegende CV-Analyse auf schnelle und nicht-invasive Weise Einblicke in die EET-Thermodynamik liefert. Einmal beherrscht, kann diese Technik leicht auf verschiedene Systeme von Interesse zugeschnitten werden und ermöglicht je nach Daten eine unterschiedliche Tiefe der Datenanalyse, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nach diesem Verfahren und dem Erlernen der Grundlagen der mikrobiellen Biofilmgeometrie kann man leicht andere Methoden wie Rechtecktelemetrie oder elektrochemische Impedanzspektroskopie sowie eine eingehende Datenanalyse erlernen.

waste-water-derived-electroactive-microbial-biofilms-growth

Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Quelle: Tokunou, Y. et al., Elektrochemische Detektion des Deuterium-kinetischen Isotopeneffekts auf den extrazellulären Elektronentransport in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video demonstriert den Zusammenbau und Betrieb eines elektrochemischen Reaktormodells, das zur Simulation der Biofilmbildung auf Elektrodenoberflächen entwickelt wurde. Kontrollierte elektrochemische Stimulation fördert die mikrobielle Adhäsion, was zur allmählichen Entwicklung eines bakteriellen...

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