Aus Abwasser gewonnene elektroaktive mikrobielle Biofilme: Wachstum, Erhaltung und grundlegende Charakterisierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen anodischen elektroaktiven mikrobiellen Biofilm aus Abwasserinokulation zu züchten und seine bioelektrokatalytischen Eigenschaften zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein potentiell statisch gesteuerter, bioelektrochemisch gespeister Chargenreaktor aufgebaut, geimpft und gestartet wird. Der zweite Schritt besteht darin, die aktuelle Produktion mit Hilfe der Krono-Pyrometrie zu überwachen.

Anschließend wird das Medium nach der Substraterschöpfung regelmäßig gewechselt, bis eine reproduzierbare maximale Stromdichte erreicht ist, die eine stationäre Biofilmbildung darstellt. Der letzte Schritt besteht darin, den extrazellulären Elektronentransfer elektroaktiver Bakterien mittels zyklischer Vol telemetrie während des Vorhandenseins und Fehlens des Substrats zu untersuchen. Letztendlich liefert die Datenanalyse grundlegende Einblicke in die Thermodynamik des mikrobiellen Elektronentransfers und ermöglicht die Bestimmung des formalen Potentials möglicher und tatsächlicher extrazellulärer Elektronentransferstellen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass man einen direkten Einblick in den Elektronentransfer zwischen Mikroorganismen und festen Elektroden erhalten und so grundlegende Informationen über den mikrobiellen extrazellulären Elektronentransfer ableiten kann. Im Allgemeinen werden Personen, die mit der Methode noch nicht vertraut sind, mit der richtigen Parameterwahl und der korrekten Interpretation des abgeleiteten Diagramms zu kämpfen haben. Bei der Datenerfassung und Datenanalyse können schwerwiegende Fehler gemacht werden.

Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, bereiten Sie eine geeignete Menge des Wachstumsmediums unter Verwendung eines Phosphatpuffers vor, einschließlich weiterer Nährstoffe gemäß der folgenden Referenz. Verwenden Sie 10 Millimolar Natriumacetat als Substrat. Pro 20 Milliliter Wachstum wird ein Milliliter Primärabwasser zugegeben, Medium als Inokulum.

Führen Sie dann eine Nadel in das Medium ein und spülen Sie es mindestens eine halbe Stunde lang mit Stickstoff. Um es beim Spülen mit Stickstoff zu entlüften, messen Sie die Größe der Elektrode für den Aufbau mit drei Elektroden. Die Arbeitselektrode, die Gegenelektrode und die Referenzelektrode werden über Silikonstopfen in einen modifizierten 250-Milliliter-Rundkolben mit vier Halsen eingeführt.

Umwickeln Sie die Silikonstopfen mit Paraform, um das System abzudichten, während Sie es mit Stickstoff spülen. Gießen Sie 250 Milliliter des Wachstumsmediums und des Inokulumgemisches durch die Probenahmeöffnung in den Reaktor. Verschließen Sie die Probenahmeöffnung mit einem Silikonstopfen und verschließen Sie sie luftdicht mit Perfil.

Stellen Sie das Gefäß in eine 35 Grad Celsius heiße Kammer, um konstante Umgebungsbedingungen zu gewährleisten. Verbinden Sie als nächstes die Elektroden mit den entsprechenden Kabeln des Potentialstats. Öffnen Sie die Software, um den potenziellen Wert zu steuern, und wählen Sie die Technik aus.

Chrono-Pyrometrie. Stellen Sie die Arbeitselektrode für eine Dauer von 500 Stunden auf ein konstantes Potential von 0,2 Volt ein und zeichnen Sie danach alle 600 Sekunden auf, starten Sie die Chronopyrometrie und beobachten Sie das Diagramm des gemessenen Stroms über die Zeit. Nach der Berechnung der bevorzugten Stromdichten wird die gemessene Stromdichte als Funktion der Zeit dargestellt.

Nachdem der oxidative Strom ein Plateau erreicht hat und auf Nullstrom zurückkehrt, unterbrechen Sie die metrische Chrono-Ampere-Messung für einen Mediumaustausch. Übertragen Sie daher das Gefäß in eine Laminar-Flow-Box und spülen Sie das System mit Stickstoff. Das Medium vorsichtig entleeren und nach dem Nachfüllen des Mediums mit frischem, entlüftetem Medium auffüllen.

Verschließen Sie die Probenahmeöffnung und verschließen Sie sie mit Paraform. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte, bis der maximale oxidative Strom einen stationären Zustand erreicht. Entnehmen Sie nach jedem Wachstumszyklus eine Milliliterprobe der frischen und der ausgetauschten Mediumlösungen für die Substratanalyse mittels HPLC. Um den extrazellulären Elektronentransfer zu untersuchen, wählen Sie die Technik zyklische Volumentelemetrie in der Software zur Steuerung der Potentiale.

Stellen Sie dann das Anfangspotential EI der Arbeitselektrode auf minus 0,5 Volt gegenüber der Referenzelektrode, das Eckpotential E auf 0,3 Volt und das Endpotential E zwei auf minus 0,5 Volt ein. Verwenden Sie eine Abtastrate von einem Millivolt pro Sekunde. Starten Sie das Experiment und zeichnen Sie mindestens drei Zyklen auf, um einen reproduzierbaren Lebenslauf zu erhalten.

Nach der Berechnung der bevorzugten Stromdichten wird die gemessene Stromdichte als Funktion des Potentials der Arbeitselektrode aufgetragen. Aus den metrischen Chrono-Ampere-Messungen können die maximale Stromdichte und der Kula-Wirkungsgrad gemessen werden. Hier ist eine typische chronometrische Biofilmwachstumskurve mehrerer Wachstumszyklen unter Verwendung eines Fed-Batch-Reaktors dargestellt.

Nach der anfänglichen Verzögerungsphase beginnt ein erstes Maximum der Stromdichte, dann sinkt der Strom aufgrund der Erschöpfung des Substrats auf nahezu Null. Nach dem Nachfüllen des Substrats. Die Stromdichte steigt mit einer höheren maximalen Stromdichte wieder an.

Nach mehreren Wachstumszyklen ist die maximale Stromdichte konstant, was auf eine Steady-State-Biofilmbildung hinweist. Als stationäres Maximum. Der Wert der Stromdichte hängt von mehreren Parametern ab.

Es wird oft als eine Eigenschaft von elektroaktiven mikrobiellen Biofilm-Elektrodensystemen angesehen. Die zweite Betriebseigenschaft ist der omische Wirkungsgrad, d. h. die Anzahl der Elektronen, die als elektrischer Stromfluss pro gefüttertem Chargenzyklus aufgezeichnet werden, bezogen auf die theoretische maximale Anzahl von Elektronen. Im Textprotokoll finden Sie Einzelheiten zur Berechnung des Rufwirkungsgrads, des elektrischen Stromflusses und der theoretischen maximalen Anzahl der angezeigten Elektronen.

Hier ist ein typischer Lebenslauf für Nicht-Fluktuationsbedingungen. Bei einer hohen Scanrate wird der CV eines Biofilms für hohe Scanraten abgebildet, bei dem nur ein Peakpaar und damit ein formales Potential EF identifiziert werden kann. Hier. Im Allgemeinen kann das formale Potential eines Redoxpaares aus dem Peakpotential des Oxidationspeaks EPA und dem Reduktionspeak der jeweiligen Spezies EPC berechnet werden.

Bei der Bildung des arithmetischen Mittels finden Sie im Textprotokoll Einzelheiten zur Berechnung des formalen Potentials. Wenn eine ausreichend niedrige Scanrate auf den identischen Biofilm angewendet wird, können bis zu vier Redoxpaare identifiziert werden. Die Nicht-Umsatz-CV zeigt jedoch nur alle redoxaktiven Verbindungen an der Elektrode und damit die EF der möglichen extrazellulären Elektronentransferstellen.

Nur die Analyse des Umsatz-CV liefert die EF der tatsächlichen EET-Standorte bei der weiteren Analyse der nicht umsatzbezogenen CVs. Weitere charakteristische Parameter wie Peakabstand, maximaler Spitzenstrom und minimale Spitzenstromdichte können analysiert werden. Diese Parameter, insbesondere wenn sie für unterschiedliche Abtastraten aufgezeichnet werden, können für mechanistische und kinetische Analysen von Elektronentransferprozessen an Elektroden verwendet werden.

Diese kinetische Analyse, die für chemische Systeme gut etabliert ist, ist jedoch für elektroaktive mikrobielle Biofilme nicht einfach. Bei der Durchführung der CV-Messung in Gegenwart von Substrat wird ein Umsatz-CV erhalten. Nach dem Plotten der Daten wird die typische S-förmige bioelektrokatalytische Kurve beobachtet.

Bei der weiteren Analyse der Daten liefert das Maximum der ersten Ableitung oder des Wendepunkts der Kurve das formale Potential EF der tatsächlichen EET-Stellen. Im Falle eines dünnen Biofilms, der von Geobacter-Verhältnissen dominiert wird, können zwei Wendepunkte beobachtet werden. Anschließend zeigt das Derivat zwei Maxima, die dem formalen Potential der bioelektrokatalytisch aktiven EET-Stellen entsprechen und als EF zwei bzw. EF drei bezeichnet werden.

Dieser Befund zeigt auch, dass die Redoxprozesse, die mit den formalen Potentialen EF eins und EF vier assoziiert sind, nicht mit der Bioelektrolyse zusammenhängen. Wenn der Biofilm wächst und dicker wird, zeigt der CV nur einen Wendepunkt. Dieses formale Potential EEF minus 0,32 Volt gegenüber Silber, Silberchlorid entspricht in etwa dem arithmetischen Mittel der beiden formalen Potentiale, die dem EET des dünnen Biofilms zugeordnet sind.

Dieses Ergebnis zeigt, dass die grundlegende CV-Analyse auf schnelle und nicht-invasive Weise Einblicke in die EET-Thermodynamik liefert. Einmal beherrscht, kann diese Technik leicht auf verschiedene Systeme von Interesse zugeschnitten werden und ermöglicht je nach Daten eine unterschiedliche Tiefe der Datenanalyse, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nach diesem Verfahren und dem Erlernen der Grundlagen der mikrobiellen Biofilmgeometrie kann man leicht andere Methoden wie Rechtecktelemetrie oder elektrochemische Impedanzspektroskopie sowie eine eingehende Datenanalyse erlernen.