Name: Ein Single-fly-Assay für Sammelverhalten in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-04T21:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Lernen Sie einen automatisierten Single-fly-Assay zur Untersuchung des Sammelverhaltens bei Drosophila melanogaster. Diese Methode erfasst geruchsgesteuerte Suchverhaltensänderungen durch Hunger quantitativ.

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Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien JWW aus dem National Institute of Health (R01DK092640) und der National Science Foundation (0920668) unterstützt.

1. Fly-Sammlung und Hunger <ol><li> Rück die Versuchsfliegen unter kontrollierten Temperatur-und Feuchtigkeitsbedingungen (zB 21 ° C, 50-60% relative Luftfeuchtigkeit) auf einem 12-Stunden Licht / Dunkel-Zyklus. </li><li> Sammeln weiblichen fliegt am Tag des Schlüpfens und sie, zusammen mit 4-5 Männchen, in neue Lebensmittelflaschen (maximal 30 pro Fläschchen). Alter fliegt 2-5 Tage. </li><li> Bereiten Sie die Kammern für Fliegen Hunger. <ol><li> Drücken Sie eine einzelne Gewebe (4,8 x 8,4 Zoll) bis auf den Boden eines leeren Kunststoffröhrchen. Komplett genießen das Gewebe mit destilliertem Wasser. Verwenden Sie ein Objekt auf dem Gewebe nach unten drücken, und drücken Sie leicht heraus überschüssiges Wasser. </li><li> Drehen Sie die Durchstechflasche um das zusätzliche Wasser zu verwerfen. Es sollte genug Wasser, um die Fliegen mit Feuchtigkeit versorgt und der Hunger Kammer feucht zu halten, aber nicht genug, um die Fliegen ertrinken. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Fliegen aus der Lebensmittel Fläschchen in einen Hungerkammer und stecken Sie das Fläschchen etwa 18-24 Stunden, bevor das Experiment beginnt. Bewahren Sie dieFläschchen unter kontrollierten Temperatur-und Feuchtigkeitsbedingungen über Nacht, bis das Experiment beginnt am nächsten Tag. </li></ol> 2. Vorbereitung der Speisen Geruch <ol><li> Vorbereitung einer 1%-igen Lösung durch Zugabe von 0,1 g Agarose mit niedriger Schmelztemperatur zu 10 ml destilliertem Wasser in einem Glaskolben. Erhitzen Sie die Agarose-Lösung in der Mikrowelle nur, bis es anfängt zu kochen, aber gut, bevor es überkocht. <ol><li> Stoppen Sie die Mikrowelle und die Flasche einmal wirbeln. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal, bis die Agarose vollständig gelöst hat. Halten Sie die Agarose-Lösung in einem flüssigen Zustand durch, das den Kolben warmen auf einer Heizplatte bei 50 ° C eingestellt </li></ol></li><li> In 990 ul der 1% igen Lösung und 10 ul von Apfelessig in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen, um eine 1% Apfelessig Lösung. Vortex, bis die Lösung gemischt und in ein trockenes Bad Inkubator auf 50 ° C eingestellt </li></ol> 3. Testraum und Verhalten Kammer-Setup <ol><li&gt; Stellen Sie den Testraum, um den gewünschten Bedingungen (zB Temperatur und Luftfeuchtigkeit). </li><li> Schalten Sie das LED-Panel (660 nm). </li><li> Spülen der Siebe und Testplatten mit heißem Wasser und Wärme sie in einem Trockenofen, bis alle Feuchtigkeit verdunstet. Kühlen Sie die Siebe und Platten auf den Testraum Temperatur vor Beginn der Experimente. </li><li> Positionieren Sie eine flache Schale auf der Oberseite der Diffusorplatte und füllen es mit Wasser, um die lokale Luftfeuchte zu erhöhen und das Wasser in der Agarose Tröpfchen maskieren. </li><li> Positionieren Sie die Siebe über die Wasserschale. </li></ol> 4. Fly Laden in die Testplatten Diagramme mit den Spezifikationen für die Prüfung Platten können in dem Abschnitt Zusätzliche Dateien gefunden werden. Die Testplatte aus klarem Acryl gefertigt und besteht aus 6 Tests Arenen. Eine einfache Schieberegler enthält Haltekammern, die Fliegenbelastung, Zeitbegrenzung, und gleichzeitiger Freisetzung von 6 Fliegen zu ermöglichen, in ihren jeweiligen Kammern andie zu Beginn des Experiments. Fadenkreuz in der Mitte jeder Arena in die Platte geätzt angeben, wo Duftstoffe sollten pipettiert werden. <ol><li> Legen Sie die Schieberegler in die Acryltestplatte. </li><li> Schieben Sie den Absauger in das Fläschchen an der Watte und ermöglichen über 6 Fliegen in die aspirator.it Fuß ist von entscheidender Bedeutung, so sanft wie möglich zu sein im Umgang mit ihnen. Man kann Vorteil der phototaktischen Verhalten fly nehmen, um Fliegen zu bewegen, indem er das Fläschchen Öffnung hin zu einem trüben Licht der Quelle bis zum Wasserstrahlpumpe kriechen. Wenn nötig, kann man auch sanfte Saugwirkung gelten für ca. 6 weibliche Fliegen zu saugen. </li><li> Führen Sie die Spitze der Saugvorrichtung in das erste Loch der Testplatte. Lassen Sie eine Fliege in die Arrestzelle weitergeben und vorsichtig voran den Schieberegler nach vorne, eine Fliege in die nächste Loch zu laden. Fortfahren, bis alle Fliegen 6 Arrestzellen der Platte zu besetzen. </li><li> Pipette 5 ul 1% Apfelessig Agarose-Lösung direkt auf das Zentrum der Cross-Haare auf der Innenseite der Testplatte. </li></ol> 5. Die Positionierung des Testing-Kennzeichen <ol><li> Um die Testplatte zu zentrieren, öffnen Sie die Datei mit dem Namen &quot;Positionierung Tool.vi.&quot; &quot;LabVIEW-VIs für Positionierungswerkzeug. vi kann im Abschnitt Zusätzliche Dateien gefunden werden. Führen Sie die Datei, indem Sie auf den weißen Pfeil in der linken oberen Ecke des Bildschirms. </li><li> Legen Sie die Testplatte oben auf das Sieb, so dass die Arena steht vor der Eröffnung Siebboden und der Geruch Ziel ist an der Decke der Platte. Richten Sie das Fadenkreuz mit dem Fadenkreuz auf dem Bildschirm in den Rücken der Testplatte geätzt. </li><li> Wenn die Ausrichtung abgeschlossen ist, brechen Sie die Ausführung durch einen Klick auf den roten Punkt in der Nähe der oberen linken Ecke des Monitors. </li></ol> 6. Notieren Sie die Fly Position während des Experiments <ol><li> Um bei jeder Nahrungssuche Prozess verfolgen und aufzeichnen die Koordinaten der Fliege, öffnen Sie die Datei Erfassungssoftware &quot;Fly-Tracking - Sechs Zones.vi &quot;LabVIEW-VIs für&quot; Fliege-Tracking -. Six Zones.vi &quot;finden Sie im Abschnitt Zusätzliche Dateien gefunden werden Führen Sie die Datei, indem Sie auf den weißen Pfeil in der linken oberen Ecke des Monitors. . </li><li> Geben Sie der Datei einen Namen und klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Voraus die Schieberegler, der in den Testkammern, um die Fliegen in die Arenen Prüfung freizugeben. Achten Sie darauf, die Testkammern zu bewegen, da dies zu falschen Ausrichtung mit Analyse-Software Koordinaten führen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Start&quot; (die Aufnahme beginnt), und sicherzustellen, dass die einzige Lichtquelle in der Testkammer ist der 660 nm LED-Panel. </li><li> Als der Prozess abgeschlossen ist, entfernen Sie das Sieb und Verhalten Kammer. Heben Sie die Testplatte aus dem Sieb zu entfernen und die Fliegen durch Eintauchen der Platte in Eis. Reinigen Sie die Platte mit heißem Wasser und entfernen Sie Agarose Schutt. Platzieren Sie die Testplatten in einem Trockenofen, um Feuchtigkeit zu entfernen. </li><li> Lüften Sie den Testbereich durch Einschalten eines small Gebläse für ca. 2 min. Drehen Sie den Lüfter aus und laden Sie die nächste Gruppe von Fliegen in die nächste Testplatte. </li></ol> 7. Datenanalyse mit Custom Software &quot;Datenanalyse für Fly-Tracking-Six Zones&quot; finden Sie im Abschnitt Zusätzliche Dateien gefunden werden. Während der Datenerfassung, koordiniert die Übernahme-Software zeichnet einzelnen Flugposition für jeden Zeitpunkt in eine Textdatei. Eine einzelne Digitalkamera über den Testplatten angeordnet nimmt Bilder mit einer Bildfrequenz von 0,5 Hz ist. Die Analyse-Software-Programm &quot;Data Analysis für Fly-Tracking-Six Zones&quot; extrahiert Informationen aus dieser Textdatei auf a) die Berechnung der Durchschnittsgeschwindigkeit, b) den Zeitpunkt, zu dem eine Fliege erfolgreich die Geruchsquelle befindet, und c) bauen Grafikfenstern , die den Benutzer über einen Blick ermöglichen: Fliegen Lage, Abstand der Fliege von der Geruchsquelle über die Zeit und die Durchschnittsgeschwindigkeit fliegen über die Zeit. Es formatiert die Daten auch für einfachen Export in eine spreadsheet Programm. In diesem Makro wird Nahrungssuche Latenz als Zeitpunkt, an dem fliegt verbringen mindestens 5 s innerhalb eines Radius von 5 mm von der Mitte der Arena definiert. <ol><li> Öffnen Sie die Datei-Analyse-Software &quot;Data Analysis für Fly-Tracking - sechs Zonen&quot;. Unter dem Reiter &quot;Windows&quot;, klicken Sie auf &quot;Create New Table.&quot; Wiederholen Sie diesen Schritt, bis sechs Tabellen erstellt wurden. </li><li> Unter dem Reiter &quot;Makros&quot;, klicken Sie auf &quot;Foodfinding.&quot; Ein Hauptsteuerung sollte mit den folgenden Optionen angezeigt: Open Raw-Datendatei für Layout-, Open Rohmaterial-Datendatei für Data File; Fly Location; Entfernung, Geschwindigkeit, Layout-, FormatDataFile. </li><li> Um Rohdaten ohne Anhängen von Werten in einer Textdatei anzuzeigen, klicken Sie auf &quot;Öffnen Rohdaten-Datei für Layout.&quot; Suchen und wählen Sie die Versuchsdaten-Datei im Browser-Fenster, das erscheint. Klicken Sie auf &quot;Öffnen&quot;. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Fly Location&quot; auf Position jedes Haar in jeder der sechs Arenen (sechs XY-Plots Darstellung jedes fly &#39;ansehens Position im Laufe der Zeit sollte auf dem Bildschirm angezeigt). </li><li> Klicken Sie auf &quot;Distanz&quot; zu jeder Fliege Abstand von der Geruchsquelle (sechs Parzellen Darstellung der Fliege Abstand von der Geruchsquelle im Laufe der Zeit sollte auf dem Bildschirm) zu sehen. Die horizontale Linie bei y = 5 mm gibt die Schwelle, bei der die Fliege als bei der Nahrungsmittelquelle angeordnet sein. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Speed&quot; zu Durchschnittsgeschwindigkeit der einzelnen Fliege während der Studie (sechs Grundstücke darstellt Geschwindigkeit der Fliege im Laufe der Zeit sollte auf dem Bildschirm) zu sehen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Layout&quot; ein Layout mit allen fly Lage, Distanz und Geschwindigkeitskurven neben der Durchschnittsgeschwindigkeit (während der ersten 50 sec) und Latenz der Suche nach der Geruchsquelle für jede Fliege (Abbildung 1) anzuzeigen. Um das Layout korrekt anzuzeigen, kann es notwendig sein, die Ränder anpassen. Um dies zu tun, klicken Sie zuerst auf das Layout-Fenster. Unter dem Reiter &quot;Datei&quot;, klicken Sie auf &quot;Seite einrichten für Layout.&quot; Stellen Sie die Ränder auf0,2 Zoll und klicken Sie auf &quot;OK&quot;. Sofort von jedem Standort Grundstück links ist eine kleine Tabelle mit den Überschriften &quot;Speed&quot; und &quot;Latency&quot;. Die unter den einzelnen Positionen eingegeben Werte geben die Durchschnittsgeschwindigkeit in mm / s und Nahrungssuche Latenzzeit in Sekunden. Blank Einträge unter Latency zeigen die Fliege nicht die Geruchsquelle zu lokalisieren. Essen Suche Latenz wird als Zeitpunkt, an dem die Fliegen verbrachte mindestens 5 s innerhalb eines Radius von 5 mm von der Mitte der Kammer definiert. </li><li> Um ein Layout zu drucken, klicken Sie auf den Layoutbereich (Updates auf aktuelle Layout-Datei). Klicken Sie auf &quot;Datei&quot; und dann auf &quot;Seitenlayout.&quot; </li><li> Um die nächste Datei anzuzeigen, klicken Sie einfach auf &quot;Open Raw Data File zum Layout.&quot; Klicken Sie auf der nächsten Rohdatendatei, die Sie anzeigen möchten, und klicken Sie auf &quot;OK&quot;. Klicken Sie auf das Layout-Fenster, das Fenster mit der neuen Datendatei zu aktualisieren. </li><li> Die Einstellungen können in einem Experiment Datei zur späteren Verwendung gespeichert werden. </li></ol> 8. Export von Daten ausder Datenanalyse-Software auf einem Tabellenkalkulationsprogramm <ol><li> Um die Geschwindigkeit und Latenz-Daten für jede Datei zu exportieren, klicken Sie auf &quot;Open Raw-Datendatei für Datendatei.&quot; Wählen Sie einen experimentellen Daten-Datei und klicken Sie auf &quot;Öffnen&quot;. Ein neues Browser-Fenster wird angezeigt. </li><li> In der neuen Browser-Fenster mit der rechten Maustaste auf &quot;Neu&quot; und dann auf &quot;Textdokument.&quot; Nennen Sie den neuen Textdokument. Wählen Sie das neu benannte Textdatei und klicken Sie auf &quot;Öffnen&quot;. Diese speichert Daten von der Rohdatendatei in die Textdatei. </li><li> Um Daten aus einer anderen Datei zu exportieren, klicken Sie auf &quot;Öffnen Rohdaten-Datei für Datendatei.&quot; Klicken Sie auf eine andere Datei und klicken Sie auf &quot;Öffnen&quot;. Wählen Sie die Textdatei aus Schritt 8.2). Wiederholen Sie diesen Vorgang für die übrigen Dateien, die Sie exportieren möchten. </li><li> Sobald alle gewünschten Daten-Dateien in der Textdatei hinzugefügt wurde, klicken Sie auf &quot;Format-Datendatei.&quot; Wählen Sie die verwendet werden, um Daten aus den vorherigen Schritten zu speichern, und klicken Sie auf &quot;Öffnen&quot; (ein neues Textdokument window wird automatisch geöffnet). </li><li> Erstellen Sie ein neues Textdokument in dem Fenster, weisen Sie der Datei einen Namen, und klicken Sie auf &quot;Speichern&quot;. Dieser erstellt eine Textdatei, die die Dateinamen, Durchschnittsgeschwindigkeit, und Latenz enthält für jede fliegen und kann in ein Tabellenkalkulationsprogramm importiert werden. </li><li> Kumulative Stücke werden aus Daten über die Anzahl der Fliegen Erreichen der Nahrungsmittelgeruch Ziel als Funktion der Zeit (Fig. 3) ausgebildet ist. </li><li> Experimentelle Daten-Sets sind für die statistische Signifikanz mit einem z-Test für Proportionen analysiert. </li></ol>

<ol><li>Dethier, V. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDethier%2C+VG+%22The+hungry+fly+%3A+a+physiological+study+of+the+behavior+associated+with+feeding%22">The hungry fly : a physiological study of the behavior associated with feeding</a>. , Harvard University Press. (1976).</li>
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<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden Finanz Interesse.

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Lebensmittel-Suchverhalten Assay. Zusätzlich zu Lebensmitteln Gerüche, können aber auch für die Untersuchung des Fliegen Fähigkeit, andere Objekte zu lokalisieren Geruch angepasst werden. Zum Beispiel kann es zu der Studie von Mate-Lokalisierung Verhalten in männlichen Fliegen 3 angewendet werden Es gibt einige zusätzliche Überlegungen für dieses Protokoll, das wir zu diesem Verfahren hier zu erwähnen.: ...

Staaten von Hunger fördern zwei Arten von appetitive Verhalten: Nahrungssuche und der Nahrungsaufnahme ein. Diese einfache Verhaltenstest ist nützlich für die Untersuchung der chemotaktischen Verhalten mit Futter 2,3 verbunden. Insbesondere verfolgt sie fly Position, Laufgeschwindigkeit und Latenz auf der Suche nach einem Lebensmittelgeruch Ziel. Latenz von Lebensmitteln Stellung dient als Maß für die Messung von Veränderungen in der Empfindlichkeit des Fliegengeruchserkennungssystem stromabwärts von Änderungen im internen Zustand appetitive. Eine manuelle Version dieses Tests wurde zuvor verwendet, um zu zeigen GABA-B-Rezeptor-Signal ist für die Geruchslokalisierung Verhalten wichtig in der Erwachsenen 3 fliegt. Die aktuelle Version des automatisierten Test war maßgeblich an der Studie, wie kurz Neuropeptid-F (sNPF) Signalisierung formt die olfaktorischen Karte in Drosophila und Einflüsse appetitive Verhaltensweisen 2. Tests in einem dunklen, Temperatur und Feuchtigkeit kontrollierten Raum erfolgen. DigitalVideokameras über den klaren Acryl-Testplatten gesetzt verfolgen Fliegen durch 660-nm-LED-Beleuchtung hinterleuchtet. Informationen von der Kamera in Echtzeit von einem Computer stationiert neben dem Testbereich verarbeitet. Wir verwenden Datenerfassungssoftware, die während der Testphase und speichert die Koordinaten der Flugpositionen. In diesem Paradigma wird das Thema in einer Arena, die eine Nahrungsmittelgeruch in der Mitte enthält freigesetzt; der Geruch Objekt schafft eine Nahrungsmittelgeruch Gradienten in der Arena, die Nahrungssuche in der Flugverhalten auslöst. Ein ähnlicher Geruch Suche Protokoll zu der Studie der Chemosensorik in einzelnen Drosophila-Larven 7 angewandt. Während andere Verhaltenstests, wie der Vier-Felder-Olfaktometer 4,5 oder dem T-Labyrinth 6 bewerten Geruchsaversion oder Anziehung Verhalten, wird dieses Paradigma besten geeignet, um Geruchsempfindlichkeit und Chemotaxis Verhalten zu beurteilen. Mehrere wichtige Vorteile begleiten diese assay. Erstens ermöglicht sie schnelle Erfassung großer Datenmengen, da die Datenerhebung und-analyse sind meist automatisiert. Zweitens trennt dieser Test und misst das Verhalten von Einzellinie, wodurch soziale olfaktorische Signale, die ihr Verhalten beeinflussen können. Drittens, die Einfachheit des Protokolls und einfachen experimentellen Design machen den Test effizient und einfach, andere zu lehren. Zusätzlich kann dieser Test verwendet werden, um weitere Sonde neuronalen Schaltkreise durch die Kombination mit der umfangreichen genetischen Toolkit zur Verfügung, um Drosophila melanogaster 8 zugrunde liegenden Nahrungssuchverhalten werden. Gezielte Expression von Transgenen, dass Schweigen zu erregen oder Neuronen können mit Tools wie der GAL4-UAS-System sowie der FH-shibire ts1, UAS-Tetanus-Toxin und UAS-TRPA1 (B) erreicht werden Transgene 12.09.

<table><tbody><tr><td>Apple Cider Vinegar</td><td>Spectrum</td><td></td><td>kommerziell erhältlich</td></tr><tr><td>Agarose, Typ VII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td>niedrige Geliertemperatur Agarose</td></tr><tr><td>Acryl Testplatte</td><td></td><td>benutzerdefinierte</td><td>Platte enthält 6 Arenen. Jede Arena hat einen Durchmesser von 60 mm und eine Höhe von 6 mm. Siehe Prüfplattendiagramme für spezifische Messungen.</td></tr><tr><td>LabVIEW V.8.5</td><td>National Instruments</td><td>776670-09</td><td>Plattform für Programme: PositioningTool.vi, FlyTracking - Six Zones.vi HINWEIS: "elapsed time.vi", "time into file.vi" und "two object detect.vi" sind enthaltene Unterprogramme, die verfügbar sein müssen, damit das Hauptdatenerfassungsprogramm "FlyTracking - Six zones.vi" ausgeführt werden kann.</td></tr><tr><td>LabVIEW Vision 8.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW Software für die Bildverarbeitung 8.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW Vision Builder AI 3.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro V.6</td><td>Wavemetric, Inc.</td><td></td><td>Plattform für Makro: Datenanalyse für Fly Tracking - Six Zones</td></tr><tr><td>Basler scA1390-17fm</td><td>National Instruments</td><td>779980-01</td><td>Digitalkamera HINWEIS: Treiber für Kamera verfügbar bei Baslerweb.com</td></tr><tr><td>8 mm Objektiv</td><td>National Instruments</td><td>780024-01</td><td>Objektiv für Basler Digitalkamera</td></tr><tr><td>Ground Glass Diffusor Plate</td><td>Edmund Optics</td><td>custom</td><td>Diffusor Light, 25 cm x 30 cm</td></tr><tr><td>US Std. Nr. 100</td><td>Fischer Scientific</td><td>04-881X</td><td>Sieb mit Nennöffnung von 150 &mu; m</td></tr><tr><td colspan="4">Beleuchtungsoption 1LED-Hintergrundbeleuchtung</td></tr> <tr><td>660 nm (20 cm x 20 cm)</td><td>Spectra West</td><td>BL47192</td><td>eine einfachere, aber teurere Beleuchtungsoption.</td></tr><tr><td>Netzteil für LED-Hintergrundbeleuchtung</td><td>Spectra West</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Beleuchtung Option 2</td></tr><tr><td>660 nm LEDs</td><td>Superbrightleds</td><td>RL5R1330</td><td>Wellenlänge 660 nm (ca. 7 x 7 LED-Array für ein 14,7 Zoll x 9,75 Zoll Panel)</td></tr><tr><td>Lineares Gleichstrom-Netzteil</td><td>GW Instek</td><td>GPS-1830D</td><td>Netzteil für LED-Panel</td></tr><tr><td>Lötfreies Breadboard</td><td>Digikey</td><td>922354-ND</td><td>Steckbrett für LEDs</td></tr></tbody></table>

ein single-fly-assay für sammelverhalten in drosophila

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

Für viele Tiere, Hunger fördert Veränderungen im olfaktorischen System in einer Weise, die die Suche nach geeigneten Nahrungsquellen erleichtert. In diesem Video-Artikel beschreiben wir einen automatisierten Test, um die Wirkung von Hunger oder Sättigung auf olfaktorische abhängige Nahrungsmittel Suchverhalten in der Erwachsenen Obst messen Drosophila melanogaster. In einem lichtdichten Gehäuse mit rotem Licht, die unsichtbar für Fruchtfliegen ist beleuchtet, eine Kamera, um benutzerdefinierte Datenerfassungssoftware verknüpft überwacht die Position von sechs Fliegen gleichzeitig. Jede Fliege beschränkt sich auf in einzelnen Arenen, die eine Nahrungsmittelgeruch in der Mitte gehen. Die Testarenen ruhen auf einem porösen Boden, die Funktionen, um Geruch Ansammlung zu verhindern. Latenz, um die Geruchsquelle, eine Metrik, Geruchsempfindlichkeit unter verschiedenen physiologischen Zuständen spiegelt zu finden, wird von der Software-Analyse bestimmt. Hier diskutieren wir die kritische Mechanik der Ausführung dieses Verhaltens-Paradigma und decken spezifische Fragen der Fliege loading, Geruchsbelastung, Temperatur-Test, Datenqualität und statistische Analyse.

Die Datenanalyse-Software und die Anordnung, von der ein Beispiel in Fig. 1 zu sehen ist, werden nach einer Reihe von Analysekriterien verwendet, um die Leistung der einzelnen Fliegen während der 10 Minuten Versuchs auszuwerten. Die folgenden Kriterien werden verwendet, um festzustellen, ob Daten von jeder Fliege wird für die Datenanalyse verwendet werden und sind entworfen, um jene Fliegen, die nicht in der Lage, die Nahrung Suchaufgabe aufgrund einer Verletzung, Krankheit, Stress oder mangelnde Motiva...

In diesem Video-Artikel beschreiben wir einen automatisierten Test, um die Wirkung von Hunger oder Sättigung auf olfaktorische abhängige Nahrungsmittel Suchverhalten in der Erwachsenen Obst messen Drosophila melanogaster.

Ein Single-fly-Assay für Sammelverhalten in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Verhaltensänderungen, die durch Nahrungsentzug bei der adulten Fliege Salala Melanogaster ausgelöst werden, zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem die Fliegen zunächst 18 bis 24 Stunden lang verhungert werden. Der zweite Schritt besteht darin, einzelne Fliegen in Verhaltenskammern zu laden, in deren Zentrum sich jeweils eine attraktive Geruchsquelle befindet.Als nächstes verfolgt ein Computersystem mit einer Digitalkamera die Position jeder Fliege im Laufe der Zeit und zeichnet sie auf. Seine Koordinaten für die spätere Datenanalyse. Der letzte Schritt besteht darin, die Latenz jeder Fliege zu bestimmen, um die Geruchsquelle mit Hilfe einer benutzerdefinierten Software zu erreichen.Letztendlich kann dieser Hochdurchsatz-Assay für das Verhalten bei der Nahrungssuche verwendet werden, um die Beziehung zwischen der Funktion neuronaler Schaltkreise und Verhaltensreaktionen zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieses Assays gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass er das chemotaktische Verhalten bei einzelnen Fliegen quantifiziert. Diese Methode kann helfen, Fragen in der Neurobiologie zu beantworten, z. B. welche Neuroschaltkreise für das chemotaktische Verhalten wichtig sind und wie diese Neuroschaltkreise durch den internen physiologischen Zustand des Tieres moderiert werden.Das Ziel dieser Methode ist es, in kurzer Zeit große Verhaltensdatensätze zu erhalten. Obwohl uns diese Methode Einblicke in das Futtersuchverhalten gegeben hat, kann sie auch verwendet werden, um andere Verhaltensweisen wie die Lokalisierung von Marken zu untersuchen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung.Die richtige Handhabung der Fliege und die Ausführung der Computersoftware sind für den Erfolg dieses Experiments unerlässlich. Im Allgemeinen können Einzelpersonen, die neu in dieser Methode sind, am Anfang ein wenig Schwierigkeiten haben, da es einige Zeit und Geduld braucht, um zu lernen, wie man mit den Fliegen umgeht, was zeigt, dass das Verfahren um die Nadel herum sein wird. Erreichen Sie einen Techniker für mein Labor Vor der Fliegensammlung.Ziehen Sie die Versuchsfliegen unter kontrollierten Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus auf. Am Tag der EEC-Explosion betäuben Sie die Fliegen unter Kohlendioxid, bevor Sie sie unter einem Mikroskop geschlechtsspezifisch bestimmen. Für die Unterscheidung zwischen Männchen und Weibchen können mehrere grundlegende Kriterien herangezogen werden.Männchen haben einen Fleck schwarzer Borsten an ihren vier Beinen, die Geschlechtskämme genannt werden, die Weibchen nicht haben. Auch die Spitze des männlichen Hinterleibs ist von einer dunklen Kutikula bedeckt und zeigt Genitalien, die bei Weibchen nicht zu sehen sind, sammeln Sie weibliche Fliegen und legen Sie sie zusammen mit vier bis fünf weißäugigen Männchen in neue Futterfeilen mit maximal 30 Fliegen pro Fläschchen Alter. Die Fliegen bereiten die Kammern zwei bis fünf Tage lang auf den Fliegenhunger vor, indem sie zuerst ein einzelnes Taschentuch auf den Boden eines leeren Plastikfläschchens drücken und das Gewebe vollständig mit destilliertem Wasser tränken.Drücken Sie dann mit einem Gegenstand auf das Taschentuch und drücken Sie überschüssiges Wasser vorsichtig aus. Drehen Sie das Fläschchen um, um das überschüssige Wasser zu entsorgen. Es sollte genug Wasser vorhanden sein, um die Fliegen mit Feuchtigkeit zu versorgen und die Hungerkammer feucht zu halten, aber nicht genug, um die Fliegen zu ertränken.Etwa 18 bis 24 Stunden vor Beginn des Experiments setzen Sie die Fliegen aus dem Futterfläschchen in eine Hungerkammer um und verschließen das Fläschchen. Lagern Sie die Fläschchen über Nacht unter kontrollierten Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen bis zum Beginn des Experiments. Bereiten Sie eine 1%ige Agro-Lösung vor, indem Sie 100 Milligramm Aros mit niedriger Schmelztemperatur zu 10 Millilitern destilliertem Wasser hinzufügen.In einem Glaskolben. Erhitzen Sie die Agro-Lösung in der Mikrowelle, bis sie zu kochen beginnt, aber bevor sie überkocht, stoppen Sie die Mikrowelle und schwenken Sie den Kolben einmal. Wiederhole diesen Schritt noch zweimal, bis sich der Aros vollständig aufgelöst hat.Halten Sie die Aros-Lösung in flüssigem Zustand, indem Sie den Kolben auf einer heißen Platte warm halten. Bei 50 Grad Celsius 990 Mikroliter der 1%aro-Lösung und 10 Mikroliter Apfelessig in ein 1,5-Milliliter-Upend-DF-Röhrchen geben. Um eine 1%ige Apfelessiglösung herzustellen, wirbeln Sie die Lösung ein, bis sie vermischt ist, bevor Sie sie in einen auf 50 Grad Celsius eingestellten Trockenbad-Inkubator geben und den Testraum auf die gewünschten Bedingungen wie Temperatur und Luftfeuchtigkeit einstellen.Schalten Sie das 660-Nanometer-LED-Panel ein. Spülen Sie die Siebe und Prüfplatten mit heißem Wasser ab und erhitzen Sie sie in einem Trockenofen, bis die gesamte Feuchtigkeit verdunstet ist. Kühl. Die Siebe und Platten bis auf die Prüfraumtemperatur herunter.Bevor Sie mit den Experimenten beginnen, positionieren Sie eine flache Schale auf der Diffusorplatte und füllen Sie sie mit Wasser, um die lokale Luftfeuchtigkeit zu erhöhen und das Wasser im Arros-Tröpfchen zu überdecken. Zum Schluss die Siebe über die Wasserschale legen. Die Prüfplatte besteht aus klarem Acryl und besteht aus sechs Prüfarenen.Ein Schieber enthält Haltekammern, die das Laden von Fliegen, das vorübergehende Einschließen und die gleichzeitige Freisetzung von sechs Fliegen in ihre jeweiligen Kammern ermöglichen. Zu Beginn des Experiments zeigt ein Fadenkreuz in der Mitte jeder Arena in der Platte an, dass Geruchsstoffe pipettiert werden sollten. Setzen Sie die Schieber in die Acryl-Testplatte ein.Schieben Sie den Aspirator vorsichtig am Wattestopfen vorbei in das Fläschchen und lassen Sie etwa sechs Fliegen in den Aspirator laufen. Es ist wichtig, so sanft wie möglich mit ihnen umzugehen. Man kann sich die Fototaktik zunutze machen, das Fliegenverhalten ausnutzen, um Fliegen zu induzieren, auf den Aspirator zuzugehen, indem man die Öffnung des Fläschchens auf eine schwache Lichtquelle richtet.Bei Bedarf können etwa sechs weibliche Fliegen durch sanftes Saugen abgesaugt werden. Vermeiden Sie die Auswahl von weißäugigen männlichen Fliegen. Führen Sie die Spitze des Aspirators in das erste Loch der Testplatte ein.Lassen Sie eine einzelne Fliege in die Haltezelle passieren und schieben Sie den Schieber vorsichtig nach vorne, um eine weitere Fliege in das nächste Loch zu laden. Fahre fort, bis die Fliegen fliegen. Besetzen Sie alle sechs Haltezellen der Platte.Pipettieren Sie dann fünf Mikroliter einer 1%igen Apfelessig-Agarro-Lösung direkt auf die Mitte des Fadenkreuzes auf der Innenseite der Testplatte. Um die Prüfplatte zu zentrieren, öffnen Sie die Datei mit dem Namen Positionierungswerkzeug vi. Führen Sie die Datei aus, indem Sie auf den weißen Pfeil in der oberen linken Ecke des Bildschirms klicken.Platzieren Sie die Testplatte so auf dem SIV, dass die Arenaöffnung zum SIV-Boden zeigt und sich das Geruchsziel an der Decke der Platte befindet. Richten Sie das Fadenkreuz der Prüfplatte mit den Querstrahlen auf dem Monitorbildschirm aus, wenn die Ausrichtung abgeschlossen ist. Brechen Sie die Ausführung ab, indem Sie auf den roten Punkt in der oberen linken Ecke des Monitors klicken, um die Koordinaten des Fluges zu verfolgen und aufzuzeichnen.Öffnen Sie bei jedem Versuch der Lebensmittelsuche die Datei mit der Erfassungssoftware. Fliegenverfolgung sechs vi. Führen Sie die Datei aus, indem Sie auf den weißen Pfeil in der oberen linken Ecke des Monitors klicken.Weisen Sie der Datei einen Namen zu und klicken Sie dann auf OK. Schieben Sie die Schieberegler in den Testkammern vor, um die Fliegen in die Testarenen zu entlassen. Achten Sie darauf, die Prüfkammern nicht zu bewegen, da dies zu einer unsachgemäßen Aufzeichnung der Koordinaten führt.Klicken Sie auf Start und stellen Sie sicher, dass die einzige Lichtquelle in der Prüfkammer das LED-Panel ist. Wenn der Versuch beendet ist, entfernen Sie das Sieb und die Verhaltenskammer. Heben Sie die Testplatte vom Sieb und entfernen Sie die Fliegen, indem Sie die Platte in Eis tauchen.Reinigen Sie die Platte vorsichtig mit heißem Wasser und entfernen Sie alle Agros-Ablagerungen. Stellen Sie die Testplatten in einen Trockenofen, um Feuchtigkeit zu entfernen. Lüften Sie den Testbereich, indem Sie einen kleinen Lüfter etwa zwei Minuten lang einschalten.Schalten Sie den Lüfter aus und laden Sie die nächste Gruppe von Fliegen in die nächste Testplatte. Fahren Sie mit der Datenanalyse mit benutzerdefinierter Software fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Datenanalysesoftware und das Layout werden verwendet, um die Leistung jeder Fliege während ihres 10-minütigen Versuchs nach einer Reihe von Analysekriterien zu bewerten.Diese Kriterien werden verwendet, um zu bestimmen, ob die Daten jeder Fliege für die Datenanalyse verwendet werden, und sollen diejenigen Fliegen eliminieren, die aufgrund von Verletzungen, Krankheiten, Stress oder mangelnder Motivation nicht in der Lage sind, die Aufgabe der Nahrungssuche auszuführen. Fliegen, die länger als 300 Sekunden inaktiv sind, gelten als inaktiv und werden aus dem Datensatz abgelehnt, es sei denn, es ist ihnen bereits gelungen, die Nahrungsquelle oder das Exponat zu lokalisieren. Eine durchschnittliche Geschwindigkeit von mehr als 10 Millimetern pro Sekunde für mindestens 100 Sekunden nach der inaktiven Periode, um nur diejenigen Fliegen auszuwählen, die in den frühen Stadien des aktiven Geruchs eine gesunde Geschwindigkeit aufweisen. Nur Suchfliegen, die sich in den ersten 50 Sekunden des Versuchs innerhalb eines bestimmten Geschwindigkeitsbereichs bewegen, werden für die Datenanalyse akzeptiert Fliegen, die sich nicht durch alle vier Quadranten in der Arena bewegen und nach Beginn des Versuchs direkt auf die Nahrungsquelle zusteuern, werden abgelehnt.Fliegen, die sich mindestens 50 Sekunden lang in einem Radius von 10 Millimetern auf die Nahrungsquelle zu- und von ihr weg bewegen, gelten als erfolgreich gefunden. Das Diagramm, das die Entfernung der Fliege von der Geruchsquelle über die Zeit darstellt, kann verwendet werden, um diese seltenen Fallarenen mit sichtbaren Artefakten in Fliegenposition zu bewerten. Ablaufverfolgungen werden ebenfalls abgelehnt.Artefakte können durch jedes Ereignis erzeugt werden, bei dem die Datenerfassungssoftware ein anderes Objekt als die Fliege erkennt. Sie erscheinen oft als lange gerade Linien, die sich über die Arena erstrecken oder von ihrer Mitte ausgehen. Erwachsene Fliegen, die 18 bis 24 Stunden hungern, zeigen eine höhere Geruchsempfindlichkeit gegenüber nahrungsbedingten Gerüchen als ihre gefütterten Artgenossen.Ein grafisches Diagramm des kumulativen Prozentsatzes der Fliegen, die erfolgreich eine Nahrungsgeruchsquelle lokalisiert haben, zeigt, dass 30 % aller verhungerten Fliegen innerhalb eines 10-Minuten-Fensters erfolgreich sind. Im Gegensatz dazu tun dies nur 7 % aller gefütterten Fliegen. Verhungerte Fliegen sollten eine deutlich größere Anziehungskraft auf Essig ausüben als auf ein Agros-Vehikel allein, und diese Beobachtung kann zur Fehlerbehebung unter Testbedingungen verwendet werden.Als zum Beispiel dieses Nahrungssuchexperiment, das bei 32 Grad Celsius und einer Umgebungsfeuchtigkeit von 35 % mit Wildtyp-Fliegen durchgeführt wurde, kein signifikanter Unterschied zwischen der Anziehungskraft der Fliegen auf Essig und der Arous-Kontrolle festgestellt wurde, ist dies wahrscheinlich auf eine zunehmende Anziehungskraft auf das Wasser zurückzuführen, das im Agros-Tröpfchen bei wärmeren Testtemperaturen gefunden wurde. Durch die Erhöhung der Testfeuchte auf 50 bis 60 % wurde diese Verhaltensänderung korrigiert und der signifikante Unterschied zwischen der Anziehungskraft auf Essig und dem Agros-Vehikel wiederhergestellt. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in 12 Minuten durchgeführt werden, einschließlich der 10-minütigen experimentellen Probe, wenn sie richtig ausgeführt wird.Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Fliegen sehr vorsichtig zu behandeln, um sie nicht zu verletzen oder zu stören. Bitte denken Sie daran, dass die Prüfplatten und Siebe im Trockenschrank extrem heiß sein können und daher nach der Entwicklung mit Ofenhandschuhen entfernt werden sollten. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Neurobiologie den Weg, chemotaktische Verhaltensweisen zu erforschen.Diese Technik kann auch angepasst werden, um die Fähigkeit der Fliege zu untersuchen, andere Geruchsobjekte zu lokalisieren. Zum Beispiel kann es zur Untersuchung des Lokalisierungsverhaltens von Partnern bei männlichen Fliegen eingesetzt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie sich auf das Experiment vorbereiten, die Versuchsbedingungen anpassen, das Experiment durchführen und die Leistung jeder Fliege analysieren, wodurch Sie letztendlich ein kumulatives Diagramm erhalten, das den Prozentsatz der Fliegen zeigt, die die Geruchsquelle erfolgreich lokalisiert haben.

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Forschung

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