Ein Single-fly-Assay für Sammelverhalten in Drosophila

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Verhaltensänderungen, die durch Nahrungsentzug bei der adulten Fliege Salala Melanogaster ausgelöst werden, zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem die Fliegen zunächst 18 bis 24 Stunden lang verhungert werden. Der zweite Schritt besteht darin, einzelne Fliegen in Verhaltenskammern zu laden, in deren Zentrum sich jeweils eine attraktive Geruchsquelle befindet.

Als nächstes verfolgt ein Computersystem mit einer Digitalkamera die Position jeder Fliege im Laufe der Zeit und zeichnet sie auf. Seine Koordinaten für die spätere Datenanalyse. Der letzte Schritt besteht darin, die Latenz jeder Fliege zu bestimmen, um die Geruchsquelle mit Hilfe einer benutzerdefinierten Software zu erreichen.

Letztendlich kann dieser Hochdurchsatz-Assay für das Verhalten bei der Nahrungssuche verwendet werden, um die Beziehung zwischen der Funktion neuronaler Schaltkreise und Verhaltensreaktionen zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieses Assays gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass er das chemotaktische Verhalten bei einzelnen Fliegen quantifiziert. Diese Methode kann helfen, Fragen in der Neurobiologie zu beantworten, z. B. welche Neuroschaltkreise für das chemotaktische Verhalten wichtig sind und wie diese Neuroschaltkreise durch den internen physiologischen Zustand des Tieres moderiert werden.

Das Ziel dieser Methode ist es, in kurzer Zeit große Verhaltensdatensätze zu erhalten. Obwohl uns diese Methode Einblicke in das Futtersuchverhalten gegeben hat, kann sie auch verwendet werden, um andere Verhaltensweisen wie die Lokalisierung von Marken zu untersuchen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung.

Die richtige Handhabung der Fliege und die Ausführung der Computersoftware sind für den Erfolg dieses Experiments unerlässlich. Im Allgemeinen können Einzelpersonen, die neu in dieser Methode sind, am Anfang ein wenig Schwierigkeiten haben, da es einige Zeit und Geduld braucht, um zu lernen, wie man mit den Fliegen umgeht, was zeigt, dass das Verfahren um die Nadel herum sein wird. Erreichen Sie einen Techniker für mein Labor Vor der Fliegensammlung.

Ziehen Sie die Versuchsfliegen unter kontrollierten Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus auf. Am Tag der EEC-Explosion betäuben Sie die Fliegen unter Kohlendioxid, bevor Sie sie unter einem Mikroskop geschlechtsspezifisch bestimmen. Für die Unterscheidung zwischen Männchen und Weibchen können mehrere grundlegende Kriterien herangezogen werden.

Männchen haben einen Fleck schwarzer Borsten an ihren vier Beinen, die Geschlechtskämme genannt werden, die Weibchen nicht haben. Auch die Spitze des männlichen Hinterleibs ist von einer dunklen Kutikula bedeckt und zeigt Genitalien, die bei Weibchen nicht zu sehen sind, sammeln Sie weibliche Fliegen und legen Sie sie zusammen mit vier bis fünf weißäugigen Männchen in neue Futterfeilen mit maximal 30 Fliegen pro Fläschchen Alter. Die Fliegen bereiten die Kammern zwei bis fünf Tage lang auf den Fliegenhunger vor, indem sie zuerst ein einzelnes Taschentuch auf den Boden eines leeren Plastikfläschchens drücken und das Gewebe vollständig mit destilliertem Wasser tränken.

Drücken Sie dann mit einem Gegenstand auf das Taschentuch und drücken Sie überschüssiges Wasser vorsichtig aus. Drehen Sie das Fläschchen um, um das überschüssige Wasser zu entsorgen. Es sollte genug Wasser vorhanden sein, um die Fliegen mit Feuchtigkeit zu versorgen und die Hungerkammer feucht zu halten, aber nicht genug, um die Fliegen zu ertränken.

Etwa 18 bis 24 Stunden vor Beginn des Experiments setzen Sie die Fliegen aus dem Futterfläschchen in eine Hungerkammer um und verschließen das Fläschchen. Lagern Sie die Fläschchen über Nacht unter kontrollierten Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen bis zum Beginn des Experiments. Bereiten Sie eine 1%ige Agro-Lösung vor, indem Sie 100 Milligramm Aros mit niedriger Schmelztemperatur zu 10 Millilitern destilliertem Wasser hinzufügen.

In einem Glaskolben. Erhitzen Sie die Agro-Lösung in der Mikrowelle, bis sie zu kochen beginnt, aber bevor sie überkocht, stoppen Sie die Mikrowelle und schwenken Sie den Kolben einmal. Wiederhole diesen Schritt noch zweimal, bis sich der Aros vollständig aufgelöst hat.

Halten Sie die Aros-Lösung in flüssigem Zustand, indem Sie den Kolben auf einer heißen Platte warm halten. Bei 50 Grad Celsius 990 Mikroliter der 1%aro-Lösung und 10 Mikroliter Apfelessig in ein 1,5-Milliliter-Upend-DF-Röhrchen geben. Um eine 1%ige Apfelessiglösung herzustellen, wirbeln Sie die Lösung ein, bis sie vermischt ist, bevor Sie sie in einen auf 50 Grad Celsius eingestellten Trockenbad-Inkubator geben und den Testraum auf die gewünschten Bedingungen wie Temperatur und Luftfeuchtigkeit einstellen.

Schalten Sie das 660-Nanometer-LED-Panel ein. Spülen Sie die Siebe und Prüfplatten mit heißem Wasser ab und erhitzen Sie sie in einem Trockenofen, bis die gesamte Feuchtigkeit verdunstet ist. Kühl. Die Siebe und Platten bis auf die Prüfraumtemperatur herunter.

Bevor Sie mit den Experimenten beginnen, positionieren Sie eine flache Schale auf der Diffusorplatte und füllen Sie sie mit Wasser, um die lokale Luftfeuchtigkeit zu erhöhen und das Wasser im Arros-Tröpfchen zu überdecken. Zum Schluss die Siebe über die Wasserschale legen. Die Prüfplatte besteht aus klarem Acryl und besteht aus sechs Prüfarenen.

Ein Schieber enthält Haltekammern, die das Laden von Fliegen, das vorübergehende Einschließen und die gleichzeitige Freisetzung von sechs Fliegen in ihre jeweiligen Kammern ermöglichen. Zu Beginn des Experiments zeigt ein Fadenkreuz in der Mitte jeder Arena in der Platte an, dass Geruchsstoffe pipettiert werden sollten. Setzen Sie die Schieber in die Acryl-Testplatte ein.

Schieben Sie den Aspirator vorsichtig am Wattestopfen vorbei in das Fläschchen und lassen Sie etwa sechs Fliegen in den Aspirator laufen. Es ist wichtig, so sanft wie möglich mit ihnen umzugehen. Man kann sich die Fototaktik zunutze machen, das Fliegenverhalten ausnutzen, um Fliegen zu induzieren, auf den Aspirator zuzugehen, indem man die Öffnung des Fläschchens auf eine schwache Lichtquelle richtet.

Bei Bedarf können etwa sechs weibliche Fliegen durch sanftes Saugen abgesaugt werden. Vermeiden Sie die Auswahl von weißäugigen männlichen Fliegen. Führen Sie die Spitze des Aspirators in das erste Loch der Testplatte ein.

Lassen Sie eine einzelne Fliege in die Haltezelle passieren und schieben Sie den Schieber vorsichtig nach vorne, um eine weitere Fliege in das nächste Loch zu laden. Fahre fort, bis die Fliegen fliegen. Besetzen Sie alle sechs Haltezellen der Platte.

Pipettieren Sie dann fünf Mikroliter einer 1%igen Apfelessig-Agarro-Lösung direkt auf die Mitte des Fadenkreuzes auf der Innenseite der Testplatte. Um die Prüfplatte zu zentrieren, öffnen Sie die Datei mit dem Namen Positionierungswerkzeug vi. Führen Sie die Datei aus, indem Sie auf den weißen Pfeil in der oberen linken Ecke des Bildschirms klicken.

Platzieren Sie die Testplatte so auf dem SIV, dass die Arenaöffnung zum SIV-Boden zeigt und sich das Geruchsziel an der Decke der Platte befindet. Richten Sie das Fadenkreuz der Prüfplatte mit den Querstrahlen auf dem Monitorbildschirm aus, wenn die Ausrichtung abgeschlossen ist. Brechen Sie die Ausführung ab, indem Sie auf den roten Punkt in der oberen linken Ecke des Monitors klicken, um die Koordinaten des Fluges zu verfolgen und aufzuzeichnen.

Öffnen Sie bei jedem Versuch der Lebensmittelsuche die Datei mit der Erfassungssoftware. Fliegenverfolgung sechs vi. Führen Sie die Datei aus, indem Sie auf den weißen Pfeil in der oberen linken Ecke des Monitors klicken.

Weisen Sie der Datei einen Namen zu und klicken Sie dann auf OK. Schieben Sie die Schieberegler in den Testkammern vor, um die Fliegen in die Testarenen zu entlassen. Achten Sie darauf, die Prüfkammern nicht zu bewegen, da dies zu einer unsachgemäßen Aufzeichnung der Koordinaten führt.

Klicken Sie auf Start und stellen Sie sicher, dass die einzige Lichtquelle in der Prüfkammer das LED-Panel ist. Wenn der Versuch beendet ist, entfernen Sie das Sieb und die Verhaltenskammer. Heben Sie die Testplatte vom Sieb und entfernen Sie die Fliegen, indem Sie die Platte in Eis tauchen.

Reinigen Sie die Platte vorsichtig mit heißem Wasser und entfernen Sie alle Agros-Ablagerungen. Stellen Sie die Testplatten in einen Trockenofen, um Feuchtigkeit zu entfernen. Lüften Sie den Testbereich, indem Sie einen kleinen Lüfter etwa zwei Minuten lang einschalten.

Schalten Sie den Lüfter aus und laden Sie die nächste Gruppe von Fliegen in die nächste Testplatte. Fahren Sie mit der Datenanalyse mit benutzerdefinierter Software fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Datenanalysesoftware und das Layout werden verwendet, um die Leistung jeder Fliege während ihres 10-minütigen Versuchs nach einer Reihe von Analysekriterien zu bewerten.

Diese Kriterien werden verwendet, um zu bestimmen, ob die Daten jeder Fliege für die Datenanalyse verwendet werden, und sollen diejenigen Fliegen eliminieren, die aufgrund von Verletzungen, Krankheiten, Stress oder mangelnder Motivation nicht in der Lage sind, die Aufgabe der Nahrungssuche auszuführen. Fliegen, die länger als 300 Sekunden inaktiv sind, gelten als inaktiv und werden aus dem Datensatz abgelehnt, es sei denn, es ist ihnen bereits gelungen, die Nahrungsquelle oder das Exponat zu lokalisieren. Eine durchschnittliche Geschwindigkeit von mehr als 10 Millimetern pro Sekunde für mindestens 100 Sekunden nach der inaktiven Periode, um nur diejenigen Fliegen auszuwählen, die in den frühen Stadien des aktiven Geruchs eine gesunde Geschwindigkeit aufweisen. Nur Suchfliegen, die sich in den ersten 50 Sekunden des Versuchs innerhalb eines bestimmten Geschwindigkeitsbereichs bewegen, werden für die Datenanalyse akzeptiert Fliegen, die sich nicht durch alle vier Quadranten in der Arena bewegen und nach Beginn des Versuchs direkt auf die Nahrungsquelle zusteuern, werden abgelehnt.

Fliegen, die sich mindestens 50 Sekunden lang in einem Radius von 10 Millimetern auf die Nahrungsquelle zu- und von ihr weg bewegen, gelten als erfolgreich gefunden. Das Diagramm, das die Entfernung der Fliege von der Geruchsquelle über die Zeit darstellt, kann verwendet werden, um diese seltenen Fallarenen mit sichtbaren Artefakten in Fliegenposition zu bewerten. Ablaufverfolgungen werden ebenfalls abgelehnt.

Artefakte können durch jedes Ereignis erzeugt werden, bei dem die Datenerfassungssoftware ein anderes Objekt als die Fliege erkennt. Sie erscheinen oft als lange gerade Linien, die sich über die Arena erstrecken oder von ihrer Mitte ausgehen. Erwachsene Fliegen, die 18 bis 24 Stunden hungern, zeigen eine höhere Geruchsempfindlichkeit gegenüber nahrungsbedingten Gerüchen als ihre gefütterten Artgenossen.

Ein grafisches Diagramm des kumulativen Prozentsatzes der Fliegen, die erfolgreich eine Nahrungsgeruchsquelle lokalisiert haben, zeigt, dass 30 % aller verhungerten Fliegen innerhalb eines 10-Minuten-Fensters erfolgreich sind. Im Gegensatz dazu tun dies nur 7 % aller gefütterten Fliegen. Verhungerte Fliegen sollten eine deutlich größere Anziehungskraft auf Essig ausüben als auf ein Agros-Vehikel allein, und diese Beobachtung kann zur Fehlerbehebung unter Testbedingungen verwendet werden.

Als zum Beispiel dieses Nahrungssuchexperiment, das bei 32 Grad Celsius und einer Umgebungsfeuchtigkeit von 35 % mit Wildtyp-Fliegen durchgeführt wurde, kein signifikanter Unterschied zwischen der Anziehungskraft der Fliegen auf Essig und der Arous-Kontrolle festgestellt wurde, ist dies wahrscheinlich auf eine zunehmende Anziehungskraft auf das Wasser zurückzuführen, das im Agros-Tröpfchen bei wärmeren Testtemperaturen gefunden wurde. Durch die Erhöhung der Testfeuchte auf 50 bis 60 % wurde diese Verhaltensänderung korrigiert und der signifikante Unterschied zwischen der Anziehungskraft auf Essig und dem Agros-Vehikel wiederhergestellt. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in 12 Minuten durchgeführt werden, einschließlich der 10-minütigen experimentellen Probe, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Fliegen sehr vorsichtig zu behandeln, um sie nicht zu verletzen oder zu stören. Bitte denken Sie daran, dass die Prüfplatten und Siebe im Trockenschrank extrem heiß sein können und daher nach der Entwicklung mit Ofenhandschuhen entfernt werden sollten. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Neurobiologie den Weg, chemotaktische Verhaltensweisen zu erforschen.

Diese Technik kann auch angepasst werden, um die Fähigkeit der Fliege zu untersuchen, andere Geruchsobjekte zu lokalisieren. Zum Beispiel kann es zur Untersuchung des Lokalisierungsverhaltens von Partnern bei männlichen Fliegen eingesetzt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie sich auf das Experiment vorbereiten, die Versuchsbedingungen anpassen, das Experiment durchführen und die Leistung jeder Fliege analysieren, wodurch Sie letztendlich ein kumulatives Diagramm erhalten, das den Prozentsatz der Fliegen zeigt, die die Geruchsquelle erfolgreich lokalisiert haben.