Name: Maus embryonalen Entwicklung in einem Serum-freien Whole Embryo Culture-System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Erfahren Sie die serumfreie Sauerstoffkultur für Mausembryonen zur Entwicklungsbiologie. Diese Methode ermöglicht kontrollierte Studien embryonaler Entwicklung ohne unbekannte Serumkomponenten.

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Wir möchten Dr. Julie Gordon und Dr. Nancy Manley für ihre hilfreiche Ratschläge mit der Kulturtechnik zu danken. Diese Arbeit wurde von der Kinder-Glaukom-Stiftung und Sharon-Stewart Aniridie Research Trust unterstützt.

Maus-Embryokultur: Alle Experimente wurden in strikter Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien folgende Protokoll # A2010 07-119, die überprüft und von der Universität von Georgia Institutional Animal Care und Verwenden Committee, das weiterhin Regulierungsaufsicht unterhält genehmigt wurde, durchgeführt. 1. Herstellung von Nährmedien <ol><li> Bereiten Kulturmedium unter Verwendung kommerziell verfügbarer Stammzellen Medien und Ergänzungen in folgenden Mengen: KnockOut DMEM, KnockOut Serum Replacement (KSR) (10%), N-2-Beilage (1x), Albumin aus Rinderserum (2%), Penicillin ( 50 IU / ml), Streptomycin (50 ug / ml) und Amphotericin B (1,25 ug / ml). Das Kulturmedium hergestellt ist ähnlich dem vorher beschriebenen 15 mit den folgenden Änderungen: Zugabe von Antimykotika und unter Verdoppelung der Konzentration der Antibiotika (für Details der spezifischen Reagenzien und Geräte, siehe List des Materials). Hinweis: Antibiotika-Konzentration wie zuvor verwendet (. Moore-Scott, et al 15) war ausreichend für die Embryokulturen durchgeführt bis zu 24 Stunden Zeitraum. Allerdings, wenn Kultur wurde über 24 Stunden fortgesetzt, erlebten wir eine Kontamination der Kultur, und dies wurde erfolgreich durch die Verdoppelung der Antibiotikakonzentration gesteuert. </li><li> Bewahren Sie die Media-Komponenten bei 4 ° C oder bei -20 ° C nach Herstellerempfehlungen. KSR-und N-2 Supplement sollten in Aliquots bei -20 ° C gelagert werden, um ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden. KnockOut DMEM einmal geöffnet sollte innerhalb von 30 Tagen nach der Empfehlung des Herstellers verwendet werden. Vor der Verwendung erwärmen die Komponenten in einem Wasserbad auf 37 ° C </li><li> Bereiten Sie die Medien unter sterilen Bedingungen. Desinfizieren Sie die Oberfläche der gesamten Ausrüstung und Flaschen die Media-Komponenten mit 70% Alkohol Spray, bevor Sie sie in der Kultur Kapuze. </li><li> Die Mediumkomponenten können entweder in einer sterilen Becher oder direkt in das Filtersystem (Corning) gemischt werden. Zuerst fügen Sie die Albuminpulver auf den KnockOut DMEM. Mischen Sie gründlich durch vorsichtiges Schütteln, bis das Albumin vollständig auflöst. Dann fügen Sie die N-2-Beilage, KSR und die Antibiotika und mischen mit einer Pipette. Dann filtern sterilisieren die Medien mit einer Porengröße 0,22 um Filter mit Vakuumsauger. Verzichten die Medien in 50 ml konische Röhrchen und bei 4 ° C bis zur Verwendung. Die einst vorbereitet Medien sollten innerhalb von 4-5 Tagen für die Kultur verwendet werden. </li></ol> 2. Vorbereitung der Kultur-Ausrüstung <ol><li> Sterilisieren der Glaskulturflaschen und Gummikorken. Wickeln Sie die Kulturflaschen in einer Aluminiumfolie und legen Sie die Gummiflaschenkorken in einem Wasserbecher und durch Autoklavieren sterilisieren. </li><li> Sterilisieren Sie die Kulturkammer (Precision Incubator Unit) mit 70% Alkohol-Spray und warm bis 37 ° C vor dem Beginn der Kultur. Der Kulturraum ist emit einer rollenden Scheibe in der Mitte, die die Kulturflaschen hält witzelte. Gasstrom in die Kammer durch einen Druckmesser geregelt und die Strömungsrate kann durch Beobachten der Abfluss von Luftblasen durch das Wasser in eine Glasröhre an dem Ende eingestellt werden. Diese Rollflaschenkultur Gerät ist eine modifizierte Version des von Neu-und Cockroft 17 eingeführt Originalgerät. </li><li> Verbinden einer Gasflasche mit einer Gasmischung aus 95% O 2/5% CO 2 in der Kulturkammer und der Gasströmung einzustellen, um &quot;eine Luftblase pro Sekunde&quot;, der eine Strömungsgeschwindigkeit von 50 cc / min ergibt und gewährleistet eine ausreichende Sauerstoffversorgung die Kultur Embryonen. </li></ol> 3. Maus-Embryogewinnung und Vorbereitung für die Kultur <ol><li> Um Wildtyp-Maus-Embryonen zu erhalten, verwendeten wir Mäuse C57BL/6J und CD-1 (Charles River Laboratories) genetischen Hintergrund Stämme. </li><li> Überprüfen Sie den weiblichen Mäusen für vaginale Stecker jeden Tag am Morgen. Die Uhr am Tag der Suche nach thE Vaginalpfropf als E0.5 dpc (Tage nach dem Koitus) berücksichtigt werden. </li><li> Sammeln Maus-Embryonen bei E10.5 dpc von euthanizing die schwangeren Mäusen nach Standardprotokollen. Die Mäuse wurden mit einer CO 2-Inhalationsgerät wie von der American Veterinary Medical Association (AVMA) Richtlinien für die Euthanasie von Tieren (2013) angegeben eingeschläfert. Um den Tod zu gewährleisten, wurde Genickbruch nach Exposition mit CO 2 durchgeführt. </li><li> Spray 70% Ethanol auf der ventralen Bauchoberfläche, um ein Anhaften von Bauchhaar auf die Instrumente zu vermeiden. Öffnen Sie dann die Bauchhöhle ventral mit einer scharfen Schere-blunt Betriebs und ein Paar von 4-3/4 in microdissecting Zange, um die Gebärmutter zu finden. Mit einer 4 in microdissecting Pinzette heben Sie die gesamte Gebärmutter und trennen sie vom Körper durch Schneiden mit einer Schere am Betriebs Licht der Gebärmutterkörper und an den Spitzen der Uterushörner. </li><li> Schnell spülen die gesamte Gebärmutter in 1x PBS auf 37 ° Cum das Blut Anhaften an der Gebärmutter zu entfernen, und sofort in DMEM platzieren erwärmt auf 37 ° C in einer Petrischale. Sterilisieren der Instrumente von 70% Ethanol Spray vor der weiteren Verwendung. Hinweis: Vorwärmen der Lösungen einschließlich der PBS und DMEM Kulturmedium und Halten derselben bei 37 ° C während des gesamten Verfahrens wird empfohlen. </li><li> Unter einem Binokular, sollte die Gebärmutter segment mit einem leichten Betriebs Schere zerschnitten werden. Dies führt zu kleinen Öffnungen auf jeder Seite des segmentierten Gebärmutter durch die ein Paar von modifizierten (stumpfe Enden) microdissecting Pinzette vorsichtig eingesetzt, um die Öffnung zu erweitern werden. Dies ermöglicht die Exposition der Plazenta decidua, die dann durch leichtes Reißen mit einem Paar microdissecting Pinzette, um die parietalen Dottersack (PYS) mit der Reichert-Membran aussetzen entfernt werden können. Mit einem Rand der Pinzette vorsichtig durchbohren das Reichert-Membran zusammen mit den PYS und getrennt von thE viszeralen Dottersack (VYS) zugrunde liegenden Schicht, um die Embryonen mit intakter VYS aussetzen. Der Konus und die ectoplacental Trophoektoderm Derivate können entweder mit der Dezidua oder der Plazenta mit der Reichert-Membran entfernt werden. Es muss darauf geachtet werden, um ein Bersten des VYS zu vermeiden, da die Embryonen sofort herausspringen. </li><li> Die Embryonen mit intakter VYS sollte dann auf eine Petrischale mit Kulturmedium auf 37 ° C unter Verwendung eines Kunststofftransferpipette überführt werden. Hinweis: Transfer zum Kulturmedium unmittelbar nach der Trennung vom Uterus hilft für eine bessere Entwicklung des Embryos in Kultur. </li><li> Eine kleine Öffnung ist in den Dottersack mit einem Paar Pinzetten microdissecting Vermeidung größerer Blutgefäße hergestellt werden. Eine scharfe Pinzette kann die Öffnung durch leichtes Piercing in einem Bereich neben dem Kopfbereich zu machen. Alternativ zwei Paare von stumpfen Pinzette kann der Dottersack zu halten und schonend zu reißen, um eine kleine Öffnung zu machen.Dann vorsichtig eine breitere Öffnung durch die Erweiterung mit der Pinzette zu einer Größe gerade genug, um die embryonale Kopf passen. Das Frucht Membran, die eng Wickeln wird der Embryo sollte sanft gehalten werden vom Körper gerissen und mit einer Pinzette. Die embryonale Kopf und später der ganze Embryo sollte vorsichtig aus dem Dottersack nach außen gelegt werden, während die Integrität der embryonalen Gefäßsystems mit der des Dottersack 15. Hinweis: Jeder Schaden, den Dottersack Gefäßsystem kann potenziell Einfluss auf die Entwicklung des Embryos in der Kultur. Diese Embryonen mit beschädigten Gefäßsystem nicht für die Kultur verwendet werden, und können für die Ausrichtung der Embryonen, die später verworfen werden, verwendet werden. </li><li> Embryonale Inszenierung Kriterien: Untersuchen Sie die Embryonen unter dem Binokular und Gruppen durch morphologische Kriterien wie Körper-und Kopfgröße, Körper-und Augen Morphologie und Bühne, indem die Anzahl der Somiten (s) für mindestens zwei Embryonen aus jeder Gruppe. &lt;strong&gt; Hinweis: In der Regel Embryonen aus den gleichen Wurf zeigen Unterschiede in der Entwicklung im Mutterleib erhalten und unterscheiden sich in der Körpergröße, morphologische Merkmale und die Anzahl der Somiten. Wir fanden jedoch, dass Embryonen, die durch unsere morphologischen Kriterien gruppiert ausgestellt in der Regel ähnlich Somitenzahl (± 1). Aus diesem Grund ist es nicht erforderlich, für jeden Somiten Embryo zu zählen, da dies die Zeit für den Beginn der Kultur zu verzögern. Hinweis: Verwenden Sie nicht die Embryonen, die verwendet wurden, um die Somiten für Kultur zählen. Zählen der Somiten nach Beginn der Anzucht für andere Embryonen, um die Zeitverzögerung beim Starten der Kultur zu vermeiden. Die Embryonen, die Kultur nach der Trennung von der Gebärmutter verzögert wurden weisen in der Regel schlechte Entwicklung. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen sofort in eine Petrischale mit frischem Kulturmedium auf 37 ° C und nehmen Sie an der Kultur Haube, wo die Embryonen wieder in eine Petrischale mit sterilem cultur übertragen werdenE Medien, bevor sie in den Kulturflaschen mit Medium, um die Kultur zu starten. Anmerkung: Die unterschiedliche Medien Transfers für die Embryonen vor Kultur hilft bei der Verhinderung von Verunreinigungen ist, wie die verschiedenen Schritte der Entnahmeeinheit und Dissektion wurden unter einem Präpariermikroskop, die nicht im Kulturabzugshaube durchgeführt. Hinweis: Wenn die Wurfgröße ist groß (&gt; 12 Embryonen), Prozess die Hälfte der Embryonen und starten Sie die Kultur oder setzen Sie sie in eine Schüssel mit Kulturmedium und legen Sie sie in einem CO 2-Inkubator bei 37 ° C Wenn Embryonen wurden außerhalb für längere Zeiträume (&gt; 35-40 min) links beobachteten wir den Herzschlag zu verlangsamen und dadurch die spätere Entwicklung in der Kultur beeinflussen. </li></ol> 4. Kultivierung Maus Embryonen <ol><li> Öffnen Sie die autoklaviert Kulturflaschen in der Kultur Kapuze und richtig beschriften. Übertragungs 3 ml Kulturmedium auf 37 ° C zu jedem ter Flaschen und dann die Maus-Embryonen sollte sanft in den Kulturflaschen mit sterilen Kunststofftransferpipetten übertragen werden. Die Kulturflaschen sollten dann mit den Gummiflaschenkorken, die die Kulturflaschen zur Walz Scheibe in der Kulturapparat halten helfen gekappt. Hinweis: Die Kulturflaschen mit den Medien vorbereitet und auf der Rollscheibe der Kultur Gerät gestellt werden, bevor die Mäuse euthanizing. Dies verkürzt die Zeit für den Transfer von Embryonen in den Kulturflaschen. Hinweis: Mäuseembryonen können einzeln oder als Co-Kulturen mit zwei oder drei Embryos in der gleichen Kulturflasche kultiviert werden. </li><li> Die Kulturflaschen aseptisch zu dem Kulturvorrichtung durchgeführt werden bei 37 ° C fest einrasten, um die Löcher in der Scheibe mit den Walzen Gummikorken. Schalten Sie den Rollscheibe mit einer konstanten Drehzahl von 35 Umdrehungen pro Minute (rpm), die das freie Aufschwimmen der embr ermöglicht drehenJos in den Medien und hilft auch bei der freien Gasaustausch durch die embryonalen Gewebe. Das Gas von dem Zylinder zu der Kulturkammer verbunden fließt durch den Rollscheibe und den Gummistopfen in den Kulturflaschen. </li><li> Kultur die Embryonen für 16-40 h und regelmäßig für den Gasaustritt und Kultur Kammertemperatur. Hinweis: Mouse Embryo Manipulation in der Kultur: Lassen Sie die Embryonen gehen zu den Kulturbedingungen für mindestens 30 min angepasst. Embryonen, die schlecht abschneiden und zeigt schwachen Herzschlag Dann kann verworfen werden und die restlichen Embryonen können zur weiteren Bearbeitung Studien genutzt werden. Embryo Manipulationen wie Elektroporation 5,9,16, 18 Mikroinjektionen, Perlen Implantation 16, medikamentöse Behandlung und andere Verfahren kann zu diesem Zeitpunkt durchgeführt werden. Wir erfolgreich durchgeführt Implantation von Affi-Gel-Agarose-Beads mit bestimmten Signalmoleküle behandelt, um ihre Rolle in der frühen Entwicklung des Auges zu studieren. Die Embryonen nachManipulationen wieder in ein frisches Medium zurückgegeben und in der Kultur fortgesetzt werden. </li><li> Ersetzen Sie die Kulturmedien vollständig mit frischem Medium in bestimmten Intervallen nach 9-10 h und 18-19 h der Kultur, als die Kultur wurde für 40 Stunden fortgesetzt. Hinweis: Die Kulturmedien Ersatz möglicherweise nicht erforderlich, wenn die Kultur von 16-18 h gestoppt werden. </li><li> Messlatten für den Erfolg in der Kultur: Embryonale Überleben in Kultur sollte durch sichtbare Herzschlag und den Blutkreislauf im Körper bestimmt wird, während embryonale Wachstum in der Kultur sollte durch Erhöhung der Körpergröße, Somitenzahl und morphologische Entwicklung von Kopf, Gliedmaßen, Herz und Augen beurteilt werden. </li><li> In utero entwickelten Embryonen E11.0 dpc (~ 40-41 s) und E12.0 dpc (~ 49-50 s) als Kontrollen für den Vergleich von Embryonen für 16-18 h und 38-40 h zuge kultiviert werden. </li><li> Embryonalentwicklung zu verschiedenen Zeitpunkten während der Kultur und in utero Stufen werden captunter Binokular gemessen. Spot-Imaging-Software wurde eingesetzt, um die Bilder zu erfassen und mit Hilfe von Bildbearbeitungssoftware später verarbeitet. </li></ol>

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Mitte der Schwangerschaft Stufe Maus-Embryonen wurden in einem Serum-freien Kulturmedien in einer Atmosphäre von 95% O 2/5% CO 2 in einer Rollflaschenkultur Vorrichtung bei 37 ° C kultiviert Entwicklung des Embryos ex utero war bei jedem Schritt kritisch abhängig von mehreren Faktoren während des Verfahrens ab dem Zeitpunkt der Uterus der Maus euthanasiert zur Vervollständigung der Kultur (1) isoliert. Der wichtigste Faktor, der die Entwicklung beeinflusst war die Zeit, um...

In-vitro-Kultur Verfahren, die ganze Embryonen sind gut geeignet, um zu studieren Signalmechanismen in der embryonalen Organentwicklung beteiligt, die sonst nur schwer zugänglich sind, in utero. Ganze Embryonen bieten die Gewebeintegrität und Unterstützung für die Gewebe-Wechselwirkungen, die von entscheidender Bedeutung für die rechtzeitige Auftreten von Signalmechanismen unerlässlich sind angemessen für verschiedene zelluläre Prozesse während der Organogenese. Während ganze Embryokulturen bieten eine Plattform für eine Vielzahl von Anwendungen, wie Transplantationsstudien, genetische Manipulationen und Gewebe-, Perl-Implantationsstudien, toxikologische Studien, etc. Sind derzeit genutzt Embryokultur-Systeme vor allem abhängig von Serum für die ordnungsgemäße Wachstum und die Erhaltung der Embryonen in der Kultur 1-9. Serum wurde als einer der Hauptbestandteile im Bereich von 10-100% der Kulturmedien 6-8, 10, 11 genutzt., Aber die Zusammensetzung von Serum ist nicht gut definiert und können von Tier zu Tier verschieden, und jedes Mal das Serum gesammelt. Während Laborherstellung von Serum ist zeitaufwendig und erfordert strengen Verfahren, Serum beschafft im Handel weist erhebliche Variabilität zwischen verschiedenen Lose und wirft Versuchskosten. Hinzu kann das Serum unbekannte Faktoren, wie Wachstumsfaktoren, Hormonen oder anderen Proteinen, die potenziell beeinflussen kann das Ergebnis bestimmter Versuche, insbesondere jene, die die Untersuchung von Signalmolekülen in Gewebe Wechselwirkungen wichtig einschliessen. Studien haben gezeigt, dass die Zugabe von Serum zu Kultur kann möglicherweise die intrazellulären Niveaus von bestimmten Signalmoleküle, wie z. B. zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) und Proteine ​​in mitogene Signalgebung und Phosphoinositid-3 beteiligt (PI-3)-Kinase-Signalwege 12-14 zu verändern. Im Gegensatz zu dieser liefert ein serumfreies Kultursystem die Vorteile der Antigen freien Umgebung,Abstinenz von biologisch aktiven Enzyme, die die Zellprozesse verändern und ermöglicht Konsistenz zwischen Experimenten. In der vorliegenden Untersuchung verwendeten wir ein serumfreies Kulturmedium aus kommerziell erhältlichen Stammzellkulturmedien Ergänzungen der Mitte der Schwangerschaft Stufe ganzen Embryos in einer Atmosphäre von 95% O 2/5% CO 2 in einer Rollflaschenkultur Vorrichtung hergestellt bei 37 ° C 15,16. Maus-Embryonen, die für 16 bis 40 Stunden unter diesen definierten Bedingungen kultiviert ausgestellt Progression in morphologische Entwicklung der gesamten embryonalen Körper und verschiedenen Strukturen wie Herz, Gliedmaßen, Gehirn und Augen anzeigt geeigneten Ebenen der zellulären Proliferation, Migration, Differenzierung und Gewebe-Wechselwirkungen. Die molekulare Analyse der embryonalen Entwicklung in der Kultur für eine der komplexen Organsystemen wie dem Auge zeigte die Augenentwicklung mit dem in dem Augengewebe in embr beobachtet, dassJos Entwicklung in utero (Kalaskar und Lauderdale, in Vorbereitung). So zeigen wir, dass Mäuseembryonen in der Mitte der Schwangerschaft Bühne kultiviert, zeigen progressive Wachstum und morphologische Entwicklung vergleichbar mit der in der Entwicklung Embryonen in utero beobachtet.

<table><tbody><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Ersatz</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Ergänzung</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Bestand: 100x</td></tr><tr><td>Albumin, aus Rinderserum</td><td>Sigma</td><td>A9418-50G</td><td>Bestand: 100%</td></tr><tr><td>Antibiotikum - Antimykotische Lösung</td><td>Cellgro</td><td>30-004-Cl</td><td>Bestand: Penicillin (10.000 IE/ml); Streptomycin (10.000 &Mikro; g/ml; Amphotericin (250 &micro; g/ml)&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM&nbsp; &nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Präzisions-Inkubatoreinheit</td><td>B.T.C. Engineering Milton Cambridge</td><td>England Id.No. 840-374</td><td></td></tr><tr><td>Glasflaschen für rotierende Einheit</td><td>B.T.C. Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silikonkautschuk Kork</td><td>B.T.C. Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% O2/5% CO2 Zylinder</td><td>AirGas Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV11 Apo Präpariermikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV6 Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator mit Wassermantel</td><td>Forma Scientific</td><td>Modell: 3110</td><td></td></tr><tr><td>Kulturhaube</td><td>Nuaire Biologische Sicherheitswerkbänke Klasse II TypA2</td><td>Modell: Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Fisher Scientific</td><td>IsoTemp205</td><td></td></tr><tr><td>Waage</td><td>Mettler Toledo</td><td>AG285</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen, 50 ml</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>Leichte Schere</td><td>zur Bedienung Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Bedienung Scharf-stumpf Schere&nbsp;</td><td>Roboz</td><td>RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodisparierzange, 4 Zoll</td><td>Roboz</td><td>RS-5211</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodisparierzange - Hudson (cWALD), 4-3/4 Zoll</td><td>Roboz</td><td>RS-5237</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodisparierpinzette (5/45)</td><td>Roboz</td><td>RS-5005</td><td>Modifiziert - Scharfe Enden wurden stumpf gemacht</td></tr><tr><td>Mikrodisparierpinzette (5)</td><td>Roboz</td><td>RS-5060</td><td>Modifiziert - Scharfe Enden wurden stumpf gemacht</td></tr><tr><td>Pinzette für Mikrodissektion (55)</td><td>Roboz</td><td>RS-5063</td><td>Modifiziert - Scharfe Enden wurden stumpf gemacht</td></tr><tr><td>Instrumentenablage</td><td>Roboz</td><td>RT-1401S</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentenablage Deckel</td><td>Roboz</td><td>RT-1401L</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale-100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>087571Z</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale-60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale-35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875711YZ</td><td></td></tr><tr><td>Filtersystem ( 0,22 & Mikro; m Celluloseacetat)-150 ml</td><td>Corning</td><td>431153</td><td></td></tr><tr><td>Filtersystem (0,22 & Mikro; m Celluloseacetat)-250 ml</td><td>Corning</td><td>430756</td><td></td></tr><tr><td>Filtersystem (0,22 & Mikro; m Celluloseacetat)-500 ml</td><td>Corning</td><td>430758</td><td></td></tr><tr><td>Pipettierhilfe</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>D57849</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette - 10 ml</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Einwegpipette - 25 ml</td><td>Corning</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette - 7,7 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>202-20S</td><td></td></tr></tbody></table>

maus embryonalen entwicklung in einem serum-freien whole embryo culture-system

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mitte der Schwangerschaft Bühne Maus-Embryonen kultiviert wurden unter Verwendung eines Serum-freien Kulturmedium aus kommerziell verfügbaren Stammzell Medien Ergänzungen in einer sauerstoffhaltigen Rollflaschenkultur System vorbereitet. Maus-Embryonen E10.5 wurden sorgfältig von der Gebärmutter mit intakten Dottersack isoliert und in einem Prozess, der eine präzise chirurgische Manöver wurden die Embryonen vorsichtig aus dem Dottersack nach außen gelegt, während die Gefäß Kontinuität der Embryo mit Dottersack. Im Vergleich zu Embryonen mit intakter Dottersack oder mit dem Dottersack entfernt vorbereitet, zeigten diese Embryonen überlegene Überlebensrate und Entwicklungsfortschritt unter ähnlichen Bedingungen, wenn kultiviert. Wir zeigen, daß diese Maus-Embryonen, wenn in einem definierten Medium in einer Atmosphäre von 95% O 2/5% CO 2 in einer Rollflaschenkultur Vorrichtung bei 37 ° C für 16-40 h kultiviert, morphologische Entwicklung und Wachstum vergleichbar die Embryonen in der Gebärmutter entwickeln. Wir glauben, thVerfahren ist nützlich für die Ermittler brauchen, um ganze Embryokultur nutzen, um Signal Wechselwirkungen in der embryonalen Organentwicklung wichtig zu studieren.

Entwicklung von Maus-Embryonen ex utero hängt von mehreren Faktoren ab dem Zeitpunkt der Uterus wird aus dem Körper zu der Zeit die Embryonen kultiviert isoliert. Wie in Fig. 1 dargestellt ist, beinhaltet das Verfahren eine Reihe von Schritten, einschließlich Abtrennung der graviden Uterus von dem Körper (1A), Isolierung der Embryonen mit intakter Dottersack (1B), Exteriorisation der Embryonen aus dem Dottersack ( 1C) Kultivierung der Embryonen...

Serum in Embryokulturen genutzt enthält unbekannte Komponenten, die das Ergebnis von Experimenten, vor allem in Studien mit Signal Wechselwirkungen beeinflussen können. Hier verwendeten wir eine Serum-freien Kultursystem mit Sauerstoff angereichert und zeigen, dass Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen für 16-40 h kultiviert morphologische Entwicklung vergleichbar zu entwickelnden Embryonen in utero.

Maus embryonalen Entwicklung in einem Serum-freien Whole Embryo Culture-System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein serumfreies sauerstoffreiches Kultursystem zu verwenden, um spezifische Aspekte der Embryonalentwicklung von Mäusen zu untersuchen und zu manipulieren. Dazu wird zunächst die Gebärmutter mit Embryonen der Muttermaus isoliert. Der zweite Schritt besteht darin, die Embryonen mit einem intakten Dottersack nach segmentaler Dissektion der Gebärmutter von der Plazenta-Dezidua zu trennen.Als nächstes sollten die Embryonen vorsichtig aus dem Dottersack ausgelagert werden, wobei die Integrität des embryonalen Gefäßsystems erhalten bleibt. Der letzte Schritt besteht darin, die Embryonen für eine bestimmte Zeit in einem serumfreien, sauerstoffhaltigen Rollflaschenkulturgerät bei 37 Grad Celsius zu kultivieren. Letztendlich kann dieses gesamte Embryokultursystem, das die Entwicklung verschiedener Strukturen sowohl auf morphologischer als auch auf molekularer Ebene unterstützt, für die Untersuchung der Entwicklung von Mausembryonen mit einer Vielzahl von Techniken verwendet werden.Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der Entwicklungsbiologie beantworten, wie z.B. die Rolle verschiedener Signalmechanismen bei der Sulfatspezifikation und der Gewebemorphogenese im sich entwickelnden Säugetierembryo. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Isolierung von Embryonen mit einem intakten Dottersack und nachfolgenden Isierungsschritten oder schwer zu erlernenden Beschädigungen des embryonalen Gefäßsystems oder des Osac-Gefäßsystems die Entwicklung des Embryos in der Kultur beeinträchtigen kann. Desinfizieren Sie zunächst alle Arbeitsflächen mit 70%igem Alkohol und sprühen Sie jeden Gegenstand ein, bevor Sie ihn in die Kulturhaube legen.Wenn Sie fertig sind, bereiten Sie das Nährmedium und alle für den Eingriff benötigten Nahrungsergänzungsmittel vor. Geben Sie zuerst das Albuminpulver in das Knockout-DMEM und mischen Sie es gründlich, bis es sich vollständig aufgelöst hat. Als nächstes fügen Sie das N zwei Ergänzungsmittel, KSR, hinzu und mischen Sie die Antibiotika gründlich und sterilisieren Sie sie. Lagern Sie das Medium in konischen 50-Milliliter-Röhrchen bei vier Grad Celsius, bis es gebrauchsfertig ist. Bevor Sie mit der Dissektion beginnen, erhitzen Sie die erforderlichen Lösungen auf 37 Grad Celsius und halten Sie sie während des gesamten Vorgangs warm.Zu diesem Zeitpunkt sollten auch die Kulturflaschen vorbereitet und in die Kulturapparatur gestellt werden, um sie vorzugasen und auf 37 Grad Celsius zu halten. Dies spart auch Zeit beim späteren Transfer der Embryonen. Legen Sie das eingeschläferte Tier zunächst auf eine sterile Arbeitsfläche und besprühen Sie die Bauchfläche mit Ethanol.Um zu verhindern, dass Haare an den Instrumenten kleben, öffnen Sie die Bauchhöhle, um die Gebärmutter zu lokalisieren. Heben Sie die Gebärmutter mit einer Pinzette an und schneiden Sie mit einer leichten Operationsschere in den Gebärmutterkörper und in die Spitzen der Gebärmutterhörner. Um es schnell zu trennen, spülen Sie die gesamte Gebärmutter mit warmem PBS aus, um jegliches Blut zu entfernen, und geben Sie sie sofort in eine mit warmem DMEM gefüllte Petrischale.Sterilisieren Sie die Instrumente mit 70 % Ethanol Bevor Sie unter einem Präpariermikroskop fortfahren, präparieren Sie die Gebärmutter segmental mit einer leichten Operationsschere, um auf beiden Seiten kleine Öffnungen zu erzeugen. Führen Sie vorsichtig eine stumpfe Mikro-Präparierpinzette ein, um die Öffnung zu erweitern, wobei die Plazenta-Laubzange freiliegt. Reißen Sie es vorsichtig mit einer Mikro-Präparierpinzette ab, um den parietalen Dottersack mit der Riker-Membran freizulegen.Verwenden Sie eine Kante der Pinzette, um beide vorsichtig zu durchstechen und sie vom darunter liegenden viszeralen Dottersack zu trennen. Um die Embryonen freizulegen. Bei intakten viszeralen Dottersäcken sollten die Dottersäcke sofort nach der Trennung von der Gebärmutter in ein warmes Kulturmedium überführt werden. Um die Entwicklung des Embryos in Kultur zu unterstützen, machen Sie mit einer scharfen Pinzette eine kleine Öffnung in den Dottersack, indem Sie vorsichtig in einen Bereich stechen, der an die Kopfregion angrenzt, und achten Sie darauf, große Blutgefäße zu vermeiden.Alternativ können zwei Paar stumpfe Pinzetten verwendet werden, um den Dottersack zu halten und vorsichtig zu reißen, um eine kleine Öffnung zu schaffen. Erweitern Sie die Öffnung mit der Pinzette auf eine Größe, die gerade so groß ist, dass sie in den embryonalen Kopf passt. Halten Sie die Amnionmembran fest, wickeln Sie den Embryo sanft vom Körper weg und reißen Sie ihn mit einer Pinzette ab, den Embryonalkopf und später sollte der gesamte Embryo vorsichtig aus dem Dottersack entfernt werden, während die Integrität des embryonalen Gefäßsystems erhalten bleibt.Jede Schädigung des Dottersack-Gefäßsystems kann die Entwicklung beeinträchtigen, und solche Embryonen sollten nicht für die Kultur verwendet werden. Untersuchen Sie anschließend die Embryonen und gruppieren Sie sie nach morphologischen Kriterien, einschließlich Körper- und Kopfgröße, Gliedmaßen- und Augenmorphologie. Inszenieren Sie sie, indem Sie die Anzahl der Somiten zählen.Übertragen Sie die Embryonen sofort in eine Petrischale mit frischem, warmem Kulturmedium und bringen Sie sie in die Kulturhaube, wo die Embryonen wieder in eine Petrischale übertragen werden sollten. Wenn sterile Kulturmedien in der Kulturhaube arbeiten, verwenden Sie eine sterile Plastikpipette, um einen Mausembryo in jede zuvor vorbereitete Flasche einzuführen. Tragen Sie anschließend die Kulturflaschen aseptisch zum Kulturgerät. Befestigen Sie sie an der Rollscheibe und schalten Sie die Drehung ein.Dies ermöglicht es den Embryonen, frei im Medium zu schweben und hilft auch beim freien Gasaustausch. Das Gas strömt aus einem nahegelegenen Zylinder in die Kammer und dann durch die Gummikorkkultur in die Flaschen. Die Embryonen werden 16 bis 40 Stunden lang gepackt und regelmäßig auf den Gasausfluss und die Temperatur der Kulturkammer überprüft.Die Nährmedien sollten in bestimmten Zeitabständen vollständig durch frische Medien ersetzt werden. Es ist am besten, die Embryonen mindestens 30 Minuten lang an die Kulturbedingungen anpassen zu lassen, bevor eine Manipulation durchgeführt wird. Embryonen, die eine schlechte Leistung erbringen und einen schwachen Herzschlag aufweisen, können verworfen werden, und die verbleibenden Embryonen, die einen guten Herzschlag aufweisen, können für weitere Studien verwendet werden. Diese Bilder zeigen, dass sich Embryonen in Kultur während der utero-Entwicklung vermehren.Etwa 58 % der kultivierten Embryonen weisen eine vergleichbare Entwicklung auf wie in utero. Eine Zwischenentwicklung ist bei etwa 28 % der Embryonen C zu beobachten, und 14 % der Embryonen zeigen eine schlechte Entwicklung in Kultur D.Entwicklungsunterschiede treten auf, wenn es sich bei Mausembryonen um kokultivierte Embryonen handelt, die zu Beginn der Kokultur A und B ähnlich aussehen, weisen Unterschiede in ihrer Embryonalentwicklung auf. Nach 16 Stunden, A und B Einmal gemeistert, kann diese Technik in 25 bis 30 Minuten für eine spätere Größe von 10 bis 12 Embryonen durchgeführt werden.Wir haben festgestellt, dass dieses Embryokultursystem eine wertvolle Ergänzung zu unseren envivo-Studien zur Embryonalentwicklung darstellt.

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