Name: Messung des Gesamtcalciums in Neuronen, die durch Elektronensonden-Röntgenmikroanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-20T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Lernen Sie die kryoanalytische Elektronenmikroskopie zur quantitativen Messung von Calcium in Neuronen mit subzellulärer Auflösung. Diese EPMA-Methode ermöglicht präzise Analysen der Calciumverteilung in Mitochondrien.

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Wir möchten Frau Christine A. Winters für hervorragende technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde durch das Grundneuroscience Programm der NINDS Interne Research Program, NIH (Z01 NS002610) unterstützt.

Der hier beschriebene Ansatz wurde mit spezifischen Instrumente, Tools und Software entwickelt. Da Labors werden nicht mit der gleichen Versuchsanordnung werden der Ansatz verallgemeinert, wo möglich. 1. Schnelles Einfrieren Die Analysemethode beschrieben ist absolut abhängig von kryogenen Ansätze: 1) der &quot;Kryofixation&quot; von Zellen oder Geweben in einer Weise, die quantitativ bewahrt die Verteilung der diffundierbaren Gewebekomponenten und chemische Elemente wie sie in lebenden Zellen zum Zeitpunkt des Einfrierens und 2) die Herstellung von ultradünnen Gefrierschnitten geeignet für in einer TEM-Abbildung und Analyse. Diese Techniken werden hier kurz beschrieben, aber notwendigen Angaben, um diese Verfahren in anderen Laboratorien reproduzieren würde den Rahmen dieses Artikels. Interessierte Leser sind, exzellenten Artikeln 9,14 bezeichnet. Achtung: Dieser Abschnitt beschreibt die Verwendung von liquefied Ethan, die leicht entzündliche und explosions ist, entsprechende Vorkehrungen getroffen werden sollten. Betreiber müssen ebenfalls mit flüssigem Stickstoff vertraut sein (LN 2) Sicherheitsmaßnahmen, einschließlich Schutzmantel, Gläser und cryoresistant Handschuhe. Hinweis: Hier und überall, alle Werkzeuge (Zange, etc.) für die Handhabung gefrorenen Proben müssen in LN 2 vor der Verwendung vorgekühlt werden, um ein versehentliches Auftauen zu vermeiden. Kultivierte Zellen auf Deckgläsern <ol><li> Bereiten Sie eine Tauchgefriergerät durch Kondensation von gasförmigen Ethan bei -160 ° C in der LN 2 gekühlten Zentral gut. Bis zur Marke auffüllen und decken die gut mit der Schwenk Alu-Deckel, wenn sie nicht in Gebrauch ist. </li><li> Mit Filterpapier Keile, unter geeigneten Bedingungen experimentell zu einem dünnen Wasserfilm tupfen Kunststoff-Deckgläser von kultivierten Zellen. Tupfen Sie von der Kante um zu vermeiden, berühren das Gewebe, das Ideal Restfilm, durch Versuch und Irrtum bestimmt wird, ist so dünn wie möglich, aber nicht so thim zu verdampfen und trocknen der Gewebeoberfläche. </li><li> Halten Sie das Deckglas durch die Kante mit Spannzangen, schnell in flüssigem Ethan eintauchen, entweder manuell oder mit Hilfe der Schwerkraft betriebene Kolben. </li><li> Legen Sie die gefrorenen Deckglas in einem nahe gelegenen Styropor-Schale mit LN 2, groß genug, um die gewünschte Anzahl von Deckgläsern in langfristige Lagerbehälter zu manipulieren. Aluminium-Schraubverschluss Dosen, die nicht unter LN 2 ergreifen, werden empfohlen. </li></ol> Schockgefrieren von kultivierten Hirnschnitten <ol start="5"><li> Unter einem Binokular, ansehen und Orient ein organotypischen Hippocampus-Scheibe, ungestört und immer noch auf die Kultur Membraneinsatz befestigt. Zeigen Markierungszeichen auf der Membran in der Nähe der Kante der Scheibe mit einem schwarzen Sharpie-Typ-Stift und Foto. </li><li> Noch unter dem Mikroskop, schneiden Sie ca.. 5 x 5 mm Membran Quadrate mit einzelnen Scheiben auf den Plätzen zentriert. Berühren Sie nicht die Scheibe oder Biegen der MembranE. </li><li> Montieren Sie einen Membran-gestützte Scheibe, durch eine im Durchmesser ¼ Agar-Pad gepolstert, auf einem kundenspezifischen Aluminiumscheibe, um einen cryoultramicrotome (siehe unten) passen. Schnell frieren die Scheibe durch pneumatisch treibt es gegen eine LN2-gekühlten Saphirblock mittels eines maßgeschneiderten &quot;slam Einfrieren&quot;-Gerät. </li><li> Bewegen Sie den Speicher für kultivierten Zellen beschrieben. </li></ol> 2. Kryoschneiden Vorab: Erfolgreich produzieren Trockenschnitt-Bänder von Ultradünnschnitten, während einfach und logisch, erfordert Übung, Geduld und erheblichen Praxis. <ol><li> Backen Sie einen cryoultramicrotome mit einem cryoattachment und kühl bis -135 ° C ausgestattet </li><li> Schneiden gefroren in ca. Deckgläser. 3 x 3 mm Quadrate mit einem scharfen, vorgekühlt Skalpell. Einbetten Stücke mit Kulturen nach oben in einer viskosen Flüssigkeit &quot;cryoglue&quot; (1:6 Gemisch aus Ethanol und 2-Propanol 11) auf Standard-3mm Durchmesser aus Aluminium entwickelt, um die Pins Mikrotom Probe Futter passen. Vermeiden undicht cryoglue auf Kulturfläche. Festigen cryoglue durch Absenken der Temperatur auf Kryoboxen -160 ° C ≤ <ul class="lalpha"><li> Für tiefgefrorene Hirnschnitten, sicher direkt befestigen Scheiben zu einem maßgeschneiderten Spannfutter Probe mittels einer Schraube Kragen. </li></ul></li><li> Trim ausgewählten Bereichen der gefrorenen Proben - zB Zellreichen Gebieten des Deckglases Stück oder den Bereichen von Scheiben - zu einer ca.. 250 x 250 um Block Gesicht und ~ 100 um Tiefe mit einem Diamantschneidwerkzeug. </li><li> Dry-Cut-Bänder von Dünnschnitten bei ca.. -160 ° C mit einer 35 ° Diamant cryoknife, im wesentlichen wie in referencs 4, 9 beschrieben. Schnittgeschwindigkeit und Messer Freiwinkel werden empirisch bestimmt, ein guter Ausgangspunkt ist 0,4 bis 0,6 mm / sec bei 9 °. Die Nenndicke, dh Probe voraus, von hydrierten Schnitte iist typischerweise 80 nm, obwohl Abschnitte tatsächlich 1,5-2.0x dicker, hauptsächlich aufgrund der Kompression. Für eine einwandfreie Schnitte, ist ein Antistatikvorrichtung notwendig. Setzen Sie den ionisierenden Spitze der Geräte 0,5-1 cm von der Messerkante und stellen Ausgangsleistung, bis eine zufriedenstellende Bänder von Abschnitten hergestellt werden. </li><li> Bereiten Wimpern Sonden durch Kleben (mit Epoxy) Wimpern Applikator Holz-Sticks. Mit einer solchen Sonde, Abholung und Transfer Abschnitte aus dem Messerrücken auf glow-entladen, Kohlenstoff-beschichteten Trägerfolien PIOLOFORM über 100-Mesh-Klappkupfergitter gegossen und auf einem Halb gefaltet Indiumfolie Umschlag auf einem Regal hinter ruhenden Arbeits das Messer. Falten Sie die obere Hälfte des Rasters und Umschlag, drücken Sie mit einem Kaltpresswerkzeug. </li><li> Übergitter eingewickelt in einem geeigneten Gitterbox und Speicher in einem Aluminium kann, wie in Schritt 1.4 beschrieben. </li></ol> 3. Schockgefrierungsobjekthalter von Proben in die Elektronen-Mikroskop Das Kerninstrument für die ESMAin diesem Labor ist eine analytische Elektronenmikroskop bei 120 kV betrieben und für Kryomikroskopie ausgestattet, das heißt, mit einem sauberen Vakuum, Probe-Gebiet anticontaminator, einer 2k x 2k hochempfindlichen Digitalkamera und Schockgefrierungsobjekthalter Probenhalter entworfen. Überprüfen Sie vorher, Mikroskop Ausrichtung und Betriebsbedingungen in beiden Low-und High-Vergrößerung Modi und bestätigen eine zufriedenstellende Spalte Vakuum, idealerweise ≤ 10 -7 Torr. Tune up wie nötig. <ol><li> Bestätigen Sie, dass die Vakuum-Isolierung der Dewar-Komponente des cryoholder ist zufriedenstellend. Pumpe nach Bedarf. </li><li> Kühlen Sie die cryoholder auf die Minimaltemperatur, mindestens -160 ° C, während im Hochvakuum innerhalb der Mikroskoptisch, nehmen Sie das Kabel, das den Halter, seine Steuereinheit. Kippen Sie die Goniometer 45 ° im Uhrzeigersinn, bevor Sie den Inhaber, LN 2 minimieren Verschütten auf Betreiber und Mikroskop Oberflächen. </li><li> Bereiten Sie die Tisch cryoworkstation durch Abkühlen des integralen isolierend-Schale auf 160 ° C ≤ </li><li> Transfer (quickly!) die gekühlte cryoholder von Mikroskop, um Cryo Workstation. Einfahren des Inhabers Frostschirm. </li><li> Rufen Sie unter LN 2 ein Raster-Sandwich von der Lagerung und Platz auf dem Arbeitstisch des cryoworkstation. Ein Haltering für des Inhabers Probe gut ist auch auf den Tisch gelegt. </li><li> Öffnen Sie die Indium-Umschlag und bewegen Sie den beiliegenden Klappgitter auf die Probe auch der cryoholder. Sichern Sie das Gitter mit Haltering mit dem Schraubenschlüssel Werkzeug ein und schließen Sie den Frostschutz. </li><li> Schnelles Entfernen der cryoholder vom cryoworkstation legen und in der Luftschleuse des Mikroskops und gehen durch die Pumpsequenz so schnell wie möglich. Beim Einsetzen, sollte minimale Unterbrechung der Säule Vakuum sein. </li><li> Zurück Goniometer auf 0 ° Neigung. Schließen Sie neue Energie tanken und das Kontrollkästchen und bestätigen, dass die Probentemperatur ≤ 150 ° C </li><li> Füllen Sie den Dewar derProbenhalter und ermöglichen Vakuum-und Temperatur vollständig erholen. </li></ol> 4. Visual Survey der § § <ol><li> Fahren Sie den Frostschirm des Inhabers zur Probe aussetzen und schalten Sie den Elektronenstrahl. </li><li> Visuelle Bewertung der Probe bei geringer Vergrößerung, in der Regel 250X und geringer Beleuchtung. Wie in Abbildung 1 dargestellt ist, sollte Abschnitte dünn und glatt, nicht gefaltet oder überlappenden, flach und gut auf die Trägerfolie angebracht sein, und in der Regel nicht durch Gitterstäbe verdeckt. </li><li> Optional fotografieren ausgewählten Abschnitten. (HINWEIS: Minimieren Belichtung, da tiefgefrorenen Abschnitte sind sehr anfällig für Strahl-induzierten Schäden.) Verwenden Sie die automatisierte digitale Goniometertisch, um die Koordinaten der ausgewählten Abschnitte zu speichern. </li></ol> 5. Die Gefriertrocknung der § § <ol><li> Gefrier trockenen Abschnitte durch die Erhöhung Halter Temperatur auf ca.. -100 ° C ~ 30 min. </li><li> Rückkühlung Halter bis -160 ° C oder darunter. </li><li&gt; Vor der Bildgebung, schalten Sie cryoholder Steuereinheit und physisch trennen Controller-Kabel für Bild Drift durch Temperaturwechsel und / oder Vibration Abholung zu vermeiden. </li></ol> 6. Imaging von Zellen und Organellen Strukturbilder von gefriergetrockneten Abschnitte werden bei ca. erhalten. -160 ° C als low-dose, Zero-Loss-Bilder mit einem 2k x 2k Slow-Scan CCD-Kamera durch entsprechende Software gesteuert digital aufgezeichnet. <ol><li> Aktivieren Sie die EM in hallo-mag-Modus. </li><li> Wählen und Bild bei ~ 2000 X (als TIFF-Dateien, siehe Abbildung 2) markierten Zellen und subzellulärer Bereiche von Interesse in hochwertigen Abschnitte, deren Standorte waren zuvor aufgezeichnet und gespeichert. (Anmerkung: Die getrockneten Abschnitte sind jetzt wesentlich weniger empfindlich und weniger anfällig für Beschädigungen Elektronenstrahl. </li><li> Bewerten Sie Bilder, um Regionen von Interesse (ROI) für die Röntgenanalyse auswählen. Dieser Schritt kann wahlweise off-line durchgeführt werden, in welchem ​​Fall die EM gedreht werden kannaus, und die Probe auf Raumtemperatur erwärmen. </li></ol> 7. Akquisition von Röntgenspektren Röntgenspektren mit einem aufgezeichnet werden mehrere kommerzielle oder kundenspezifische Röntgenanalysesysteme minimal aus einer energiedispersiven Röntgenanalyse (EDX)-Detektor, zugehörigen Impulsprozessor-Elektronik und kompatibel Erfassung und Anzeige-Software. (Der in dieser Übung verwendete System ist in Tabelle 1 beschrieben.) <ol><li> Konfigurieren des EM für die Röntgenaufnahmen durch Einsetzen des EDX-Detektor in der Kolonne (falls erforderlich), Abziehen der Objektivöffnung und Einführen und Zentrieren keine Streustrahlung Öffnungen. Einstellen der cryoholder der niedrigsten Temperatur, bei der Frost Verunreinigung der Probe vermieden wird, sondern zumindest unterhalb -100 ° C </li><li> Neigen Sie den Halter 20 ° in Richtung des Detektors. </li><li> Unter Weitfeldabbildungsbedingungen und unter Annahme einer beabsichtigt, die Matrix aus einer analysieren individual Mitochondrien, wählen Sie ein Mitochondrium für die Analyse, verschieben Sie sie in der Mitte des Feldes und den Schwerpunkt. </li><li> Zum Spot-Modus (bei ​​einigen Mikroskopen nur konvergieren den Strahl mit zweiten Kondensator Fokus) und erhöhen die Strahlstrom auf ca.. 3 nA (wie mit einem Faraday-Cup oder ähnlichen gemessen) in einer 100 nm Ort. </li><li> Starten Sie das Spektrum Erfassungssoftware und beginnen 100 sec Akquisitionen, die Live-Zeit auf dem Monitor betrachtet werden können. Sparen aufgenommene Spektrum (Abb. 2). Der Industriestandard EMSA-Format bevorzugt. </li><li> Fahren Sie den EM und übertragen Sie die Multiple-Spektren-Datei (en) zu einem (offline) Analyse-Workstation. </li></ol> 8. Analyse der Röntgenspektren Qualitative Analyse Eine EDX-Spektrum (Abbildung 2, Einschub) ist im Wesentlichen eine xy-Darstellung der Röntgenintensität vs Energie. Spectra enthalten qualitative und quantitative Informationen über die elementare Zusammensetzung von ter analysiert, Lautstärke, dass der &quot;charakteristischen&quot; Energie einer Spitzen identifiziert das Element, die zu diesem Gipfel, während die Intensität spiegelt die Menge dieses Elements. Die charakteristischen Peaks reiten auf einem sich langsam verändernden Hintergrund, der &quot;Kontinuum&quot;. (Die Legende zu Abbildung 2 weiter diskutiert hervorstechenden Details der EDX-Spektren.) Die Energie der Spitzen Verteiler für das gesamte Periodensystem werden durch die bekannten elektronischen Struktur von Elementen, wodurch alle EDX Software Links zu einer Datenbank, die automatisch identifiziert Komponenten definiert ein Analyt. In einem physiologischen Kontext, Elemente von allgemeinem Interesse, die gut auf EDX-Analyse sind, umfassen Na (K α bei 1,04 keV), P (2,01 keV), K (3,31 keV) und Ca (3,69 keV). <ol><li> Profitieren Sie von der verfügbaren Software-Datenbank und Spitzenpassenden Routinen, um wichtige Elemente in den Spektren zu identifizieren. In einer biologischen Probe zu erwarten Peaks für Na, Mg, P, S, Cl, K und Ca zu finden. (ACHTUNG:Die letzten beiden Elemente überlappen!) </li></ol> Quantitative Analyse Die quantitative Analyse der EDX-Spektren aus der Extraktion der integrierten Fläche der Peaks identifiziert und Konvertieren dieses Wertes in einer Konzentration. Für biologische Analyse ist die etablierten Ansatz der Hall Peak / Kontinuum Verfahren 4,7,10, die Nutzen aus der Tatsache, dass die Intensität des Kontinuums (oben und in Abbildung 2 definiert) ist proportional zu der Trockenmasse des analysierten Volumen nimmt . Somit ist das Verhältnis der Peakfläche / Kontinuum Bereich, verglichen mit dem gleichen Verhältnis in Spektren von Standards bekannter Zusammensetzung, gibt die Konzentration in der Ziel Zellkompartiment. Beachten Sie, dass dieser Ansatz Konzentrationen in Einheiten von Mol pro Gewicht, in der Regel als mmol / kg Trockengewicht ausgedrückt. Diese Einheit ist ungewöhnlich und für die Interpretation erfordern zusätzliche Umwandlung in zB mmol / L Nassgewicht oder mmol / mg Protein, wie beschrieben elsewhere 4,10. <ol start="2"><li> Extrahieren Peakflächen (und Fehlerschätzungen) biologischer Elemente zwischen Z = 10-20 (0,5-4,0 keV), dh Na, Mg, P, S, Cl, K, Ca und unter Verwendung einer der Routinen in den Fitting-Analyse-Software gebaut (siehe Tabelle 1, insbesondere Fußnote 4). Dieses Labor verwendet Simplex-oder Mehr kleinsten Quadrate. Beachten Sie, dass diese Montage erfordert eine sorgfältige Aufmerksamkeit auf die Lösung der Überlappung zwischen K-und Ca-Gipfel (siehe Abbildung 2). </li><li> Integrieren Sie das Kontinuum zwischen 1,45-1,61 keV. Alternative störungsfreien Bereiche können verwendet werden. </li><li> Berechnen Peak / Kontinuum Verhältnisse und dann Konzentrationen im Vergleich zu Standards. Propagieren Fehler während der gesamten Analyse. </li><li> Verwenden Sie Standard-Statistik-Software und Formeln, um Durchschnittswerte, die biologische Variabilität widerspiegeln schätzen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren berichten, keine Interessenkonflikte.

Die hier vorgestellte Elektronenmikroskop-basierten Analysemethode ermöglicht die Detektion, Identifizierung und Quantifizierung von mehreren Elementen von biologischem Interesse, einschließlich Na, K, P, insbesondere Ca. Diese Analysen können bei subzellulärer geführt werden, dh, intra-Organellen, die Auflösung aufgrund der Fähigkeit, zu lokalisieren und zu identifizieren Strukturen von Interesse in Bildern hoher Qualität von Gefrierschnitten aus rasch eingefroren Proben vorbereitet. Beachten Sie, dass keine F...

Calciumionen sind wohl die wichtigsten und vielseitigsten Zellsignalisierungseinheit in der Biologie, spielen eine wesentliche Rolle in der normalen Prozesse so vielfältig wie die synaptische Transmission und Genexpression. Auf der anderen Seite, ist Calcium in Zelltod ebenso wichtig. Insbesondere ist ein Schlüsselfaktor in der neuronalen Verletzungen in der Schlaganfall-Kalzium Deregulierung, Parkinson, Alzheimer und anderen neurodegenerativen Erkrankungen 3,5. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, um quantitativ zu verstehen, wie Calcium in den Zellen verteilt und wie diese Veränderungen nach physiologischen oder pathophysiologischen Stimuli. Frei in Lösung oder an ein Substrat gebunden - - und das zelluläre Calciumkonzentrationen über mehrere Größenordnungen als Folge der Stimulation verändern Dieses Ziel wird durch die Tatsache, dass Kalzium wird dynamisch zwischen zwei physikalische Zustände verteilt kompliziert. Zwar gibt es mehrere Methoden für die erweiterte Analyse fr verfügbaree intrazellulären Calcium ist die Bestimmung der Gesamtcalciumkonzentrationen in definierten intrazellulären Kompartimenten realistisch auf einem Ansatz, nämlich Elektronenstrahlmikroanalyse (ESMA) begrenzt. EPMA ist eine Technik, die Paare ein Röntgenspektrometer mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM). Die TEM-Elektronenkanone konzentriert sich eine stationäre, Submikron Elektronensonde auf subzellulärer Region von Interesse und den elementspezifischen Röntgenstrahlen als Folge der Elektronenbeschuss emittiert werden, werden gesammelt und analysiert (siehe Referenzen 7, 4 für technische Detailbewertung). Vorteile der ESMA sind einzelne Organellen-Level-Auflösung und Empfindlichkeit submillimolaren. In der Praxis jedoch, ESMA erfordert spezielle cryotechniques und Instrumente für die Probenvorbereitung und Analyse. Hier werden die Werkzeuge, Techniken und Instrumente für die Messung von intrazellulären Kalzium mittels ESMA entsprechende beschrieben. Intramitochondrialen Kalzium ist besonders interest wegen der entscheidenden Rolle, dass die mitochondriale Calciumüberladung spielt bei neurodegenerativen Erkrankungen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENZIEN/MATERIALIEN</td></tr><tr><td>Thermanox Kunststoff-Deckgläser</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>72280</td><td></td></tr><tr><td>Kultureinsätze</td><td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>Für 6-Well-Platten</td></tr><tr><td>Kryopins</td><td>Leica Microsystems</td><td>16701952</td><td></td>Rillenholzapplikatoren</tr><tr><td></td><td>EM Sciences</td><td>72300</td><td></td></tr><tr><td>Faltbare EM-Gitter</td><td>Ted Pella</td><td>4GC100/100</td><td>100</td></tr><tr><td>Mesh Indiumfolie</td><td>Alfa Aesar</td><td>13982</td><td>0,25 mm dick</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Plunge Gefriergerät</td><td>Leica Microsystems</td><td>KF-80</td><td></td></tr><tr><td>Slam Gefriergerät</td><td>LifeCell</td><td>CF-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Kryoaufsatz für Mikrotome</td><td>Leica Microsystems</td><td>FC6</td><td></td></tr><tr><td>Diamant-Kryotrimmwerkzeug</td><td>Diatome</td><td>Cryotrim 45</td><td></td></tr><tr><td>Diamant-Kryomesser</td><td>Diatome</td><td>Cryo 35</td><td></td></tr><tr><td>Antistatikgerät</td><td>Diatome</td><td>Hauf Static Line</td><td></td></tr><tr><td>Kryo-Elektronenmikroskop</td><td>Carl Zeiss Mikroskopie</td><td>EM912 Omega</td><td></td></tr><tr><td>EM-Kryo-Probenhalter</td><td>Gatan</td><td>CT3500</td><td></td></tr><tr><td>CCD-Kamera mit langsamer Abtastung, 2k x 2k</td><td>Troendle (TRS)</td><td>Sharpeye</td><td></td></tr><tr><td>Bilderfassungssoftware</td><td>Olympus SIS</td><td>iTEM Suite</td><td></td></tr><tr><td>ED-Röntgendetektor</td><td>Oxford Instruments</td><td>Linksystem Pentafet</td><td></td></tr><tr><td>Pulse Processor</td><td>Oxford Instruments</td><td>XP-3</td><td></td></tr><tr><td>PCI-Backplane Karte</td><td>4pi Systems</td><td>Spectral Engine II</td><td></td></tr><tr><td>Desktop-Computer</td><td>Apple</td><td>Jedes OS9-kompatible Modell</td><td></td></tr><tr><td>Röntgenanalysesoftware</td><td>NIST</td><td>DTSA, DTSA II</td><td></td></tr><tr><td>Tabellenkalkulationssoftware</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> <ol> <li>Der CF100 wird nicht mehr im Handel verkauft, obwohl das Gerät an vielen akademischen Einrichtungen erhältlich ist, und Komplette Maschinen oder Teile finden Sie online.</li> <li>Ein Video-Tutorial für den Kryotransferhalter CT3500 finden Sie unter <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li> <li>Der SEII ist veraltet; Die Universal Spectral Engine ist ein späteres, PC-kompatibles Produkt mit vergleichbarer Funktionalität. 4pi hat die Produktion und den Vertrieb eingestellt, bietet aber weiterhin technischen Kundensupport an. Gebrauchte Systeme sind oft online zu finden.</li> <li>Das ursprüngliche DTSA ist mittlerweile veraltet. NIST bietet einen aktualisierten Nachfolger in der Public Domain an, DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li> </ol> </td></tr></tbody></table>

messung des gesamtcalciums in neuronen, die durch elektronensonden-röntgenmikroanalyse

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

In diesem Artikel werden die Werkzeuge, Techniken und Instrumente für quantitative Messungen der intrazellulären Elementgehalt falls unter Verwendung der Technik, die als Elektronenstrahl-Mikroanalyse (ESMA) bekannt sind, beschrieben. Intramitochondrialen Kalzium ist ein besonderer Schwerpunkt wegen der kritischen Rolle, dass die mitochondriale Calciumüberladung spielt bei neurodegenerativen Erkrankungen. Die Methode basiert auf der Analyse der Röntgenstrahlen erzeugt in einem Elektronenmikroskop (EM) durch Wechselwirkung eines Elektronenstrahls mit der Probe berechnet. Um die native Verteilung der diffusionsfähigen Elemente in der Elektronenmikroskopie Proben zu erhalten, erfordert ESMA &quot;Kryofixation&quot; von Gewebe, gefolgt von der Herstellung von ultradünnen Gefrierschnitten. Schockgefrieren von kultivierten Zellen oder organotypischen Kulturen wird durch Eint Einfrieren in flüssigem Ethan oder durch Einfrieren Slam gegen einen kalten Metallblock bzw. durchgeführt. Cryoschnitte nominell 80 nm dick sind trocken mit einem Diamantmesser bei ca. geschnitten. -16076, C, auf Kohlenstoff / PIOLOFORM beschichteten Kupfergitter montiert und cryotransferred in eine Kryo-EM mit Hilfe eines speziellen cryospecimen Halter. Nach der visuellen Mapping-Umfrage und die Lage bei ≤ 160 ° C und niedriger Elektronendosis, sind tiefgefrorenen Gefrierschnitten gefriergetrockneten bei -100 ° C ~ 30 min. Organell Stufenbilder von getrockneten Kryoabschnitte aufgezeichnet sind, auch bei niedrigen Dosis mittels einer Slow-Scan-CCD-Kamera und subzellulären Regionen von Interesse für die Analyse ausgewählt. Röntgenstrahlen von einem stationären, konzentriert, mit hoher Intensität Elektronensonde von ROIs emittiert werden, von einer energiedispersiven Röntgenanalyse (EDX)-Spektrometer, um die zugehörige Elektronik verarbeitet und als Röntgenspektrum präsentiert gesammelt, das heißt, ein Grundstück von Röntgenintensität vs Energie. Zusätzliche Software erleichtert: 1) Identifizierung von elementaren Komponenten durch ihre &quot;charakteristisch&quot; Spitzen Energien und Fingerabdruck, und 2) die quantitative Analyse durch Extraktion der Peakflächen / Hintergrund. Das Papier schließt mit zwei Beispiele, die veranschaulichen typischeEPMA-Anwendungen, in denen eine mitochondriale Calciumanalyse vorgesehen kritischen Einblick in Mechanismen der exzitotoxischen Schädigung und eine andere, die die Grundlage der Ischämie Beständigkeit zeigte.

Gehirnzellen zu erhalten in der Regel exzitotoxische Verletzungen als Folge des pathologischen Neurotransmitter-Freisetzung, die unter ischämischen Bedingungen auftritt. ESMA war entscheidend für die Entdeckung, wie die Fähigkeit der neuronalen Mitochondrien, riesige Mengen an Kalzium zu maskieren zugrunde liegt, den Mechanismus der Verletzung. Die elektronenmikroskopische Aufnahme in Fig. 3 veranschaulicht das Aussehen von Mitochondrien in gefriergetrockneter Gefrierschnitten von kultivierten hippocamp...

Dieses Papier beschreibt die Anwendung von cryoanalytical Elektronenmikroskopie auf die quantitative Messung der Gesamtkalziumgehalt und die Verteilung auf subzellulärer Auflösung in physiologisch definierte biologische Proben.

Messung des Gesamtcalciums in Neuronen, die durch Elektronensonden-Röntgenmikroanalyse

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe der analytischen Elektronenmikroskopie die Konzentration von biologisch wichtigen Elementen wie Kalzium in subzellulären Auflösungen in kultivierten Neuronen quantitativ zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst lebende Zellkulturen schnell eingefroren und ultradünne Kryoschnitte vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, Kryoschnitte in ein analytisches Elektronenmikroskop zu überführen und sie gefriertrocken zu trocknen.Als nächstes werden Bilder und Röntgenspektren aus ausgewählten subzellulären Regionen, einschließlich neuronaler Mitochondrien, benötigt. Der letzte Schritt besteht darin, die Röntgenspektren quantitativ zu analysieren, um lokalisierte Elementkonzentrationen zu bestimmen. Letztendlich wird dieser Ansatz, der als EPMA bekannt ist, verwendet, um Veränderungen der Kalziumkonzentrationen und -verteilung aufzudecken, die der intrazellulären Kalziumsignalisierung zugrunde liegen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber verwandten Methoden wie Fluoreszenz, Mikroskopie, Radioisotopenaufnahme oder Flammenphotometrie ist die Auflösung auf Einzelorganellenebene und die Empfindlichkeit im sub-millimolaren Bereich. Das Verfahren wird von Dr. Natalia pva, einer leitenden Wissenschaftlerin in unserem Labor, demonstriert. Zu Beginn bereiten Sie ein Gefrierbad vor, indem gasförmiges Ethan bei minus 160 Grad Celsius in der Mittelvertiefung eines mit flüssigem Stickstoff gekühlten Systems kondensiert wird.Tupfen Sie dann den Rand eines Deckglases mit anhaftenden Zellen ab, um alles bis auf einen dünnen Flüssigkeitsfilm zu entfernen. Achten Sie darauf, dass die Probe nicht austrocknet. Halten Sie dann den Deckglas an den Rand und tauchen Sie die Probe schnell in das flüssige Ethan.Entfernen Sie nach zwei bis drei Sekunden den Deckglas vom Ethan und legen Sie es in eine Styroporschüssel mit flüssigem Stickstofftransfer. Die gefrorene Abdeckung gleitet in ein Kryo-Mikrotom, das auf minus 135 Grad Celsius vorgekühlt wird. Schneiden Sie die gefrorenen Deckgläser mit einem scharfen, vorkühlen Skalpell in drei mal drei Millimeter große Quadrate.Betten Sie sie dann mit der Vorderseite nach oben auf einen Aluminiumstift mit drei Millimetern Durchmesser in eine Kryoklebermischung ein, die aus einem Teil Ethanol und sechs Teilen besteht. Isopropanol. Verfestigen Sie den Kryokleber, indem Sie die Temperatur der Kryobox auf minus 160 Grad Celsius senken. Schneiden Sie als Nächstes die zellreichen Bereiche des Deckblatts auf eine Blockfläche von etwa 250 x 250 Mikrometern und eine Tiefe von 100 Mikrometern ab.Schneiden Sie mit einem Diamant-Trimmwerkzeug Bänder mit dünnen Schnitten bei minus 160 Grad Celsius mit einem 35-Grad-Diamant-Kryomesser trocken, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Übertragen Sie dann die Abschnitte auf eine glühentladene, kohlenstoffbeschichtete Peola-Form. Trägerfolien gießen über 100 Mesh faltbare Kupfergitter, die in einem offenen Indiumumschlag sitzen.Das Gitter ist geschlossen. Dann werden die Hülle und das Sandwich mit einem gekühlten Presswerkzeug gepresst, bevor die Proben zum Kryo-Transfer in das Elektronenmikroskop gebracht werden. Kühlen Sie den Kryohalter unter Hochvakuum im Mikroskoptisch auf seine Mindesttemperatur von mindestens minus 160 Grad Celsius ab.Kippen Sie dann das Goniometer um 45 Grad im Uhrzeigersinn und entfernen Sie die Halterung. Übertragen Sie den gekühlten Kryo-Halter schnell vom Mikroskop auf die gekühlte Kryo-Workstation und ziehen Sie den Frostschutz des Halters ein. Übertragen Sie dann die Probe in den Kryohalter.Befestigen Sie das Gitter mit dem Sicherungsring mit dem mitgelieferten Schraubenschlüssel und schließen Sie den Frostschutz. Entfernen Sie anschließend schnell den Kryohalter von der Kryo-Workstation und setzen Sie ihn in die Luftschleuse des Mikroskops ein. Führen Sie die Pumpsequenz so schnell wie möglich durch, während der Kryohalter für die Probe an Ort und Stelle ist.Stellen Sie das Goniometer auf eine Neigung von null Grad zurück. Schließen Sie die Steuerbox wieder an und vergewissern Sie sich, dass die Probentemperatur weniger als oder gleich minus 150 Grad Celsius beträgt. Befüllen Sie abschließend den Doer des Probenhalters wieder und lassen Sie das Vakuum und die Temperatur vollständig wiederherstellen.Bewerten Sie zunächst die Probe visuell bei 250-facher Vergrößerung und geringer Beleuchtung. Ausgewählte Abschnitte sollten dünn und glatt sein, nicht gefaltet oder überlappend. Außerdem sollten sie flach und gut mit der Trägerfolie verbunden sein und generell nicht durch Gitterstäbe verdeckt werden.Verwenden Sie den digitalen Goniometertisch, um die Koordinaten der ausgewählten Schnitte zu speichern. Erhöhen Sie anschließend die Temperatur des Halters für 30 Minuten auf minus 100 Grad Celsius, um die Abschnitte gefriertrocknen zu können, um sie zu stabilisieren und den Kontrast zu verbessern. Dann werden die Proben wieder auf minus 160 Grad Celsius oder darunter zurückgeworfen.Vor der hochauflösenden Bildgebung. Schalten Sie die Steuereinheit des Kryohalters aus und trennen Sie das Controller-Kabel, um Bilddrift aufgrund von Temperaturschwankungen und/oder Vibrationsaufnahmen zu vermeiden. Aktivieren Sie dann das Elektronenmikroskop im Modus mit hoher Vergrößerung.Untersuchen Sie subzelluläre Regionen mit etwa 2000-facher Vergrößerung, die sich in ausgewählten Abschnitten befinden, deren Positionen zuvor gespeichert wurden. Zeichnen Sie TIFF-Bilder von vielversprechenden Gebieten auf und speichern Sie sie. Werten Sie dann die Bilder aus, um die für die Röntgenanalyse interessanten Bereiche auszuwählen und zu kommentieren.Nachdem Sie die interessierenden Regionen ausgewählt haben, konfigurieren Sie das Elektronenmikroskop für die Röntgenaufnahme, indem Sie den EDX-Detektor in die Säule einsetzen, die Objektivblende zurückziehen und alle Streustrahlungsöffnungen einsetzen und zentrieren. Kippen Sie den Halter im Spot-Modus um 20 Grad in Richtung des Detektors. Erhöhen Sie den Strahlstrom auf etwa drei Nanoampere, gemessen an einem 100-Nanometer-Spot.Erhöhen Sie dann die Temperatur des Kryohalters auf minus 100 Grad Celsius oder darunter, um eine Frostkontamination unter Weitfeld-Bildgebungsbedingungen zu vermeiden. Wählen Sie einen Mitochondrien für die Analyse. Kehren Sie in den Spot-Modus zurück.Starten Sie die Frequenzerfassungssoftware und beginnen Sie mit der 102. Akquisition. Speichern Sie die aufgezeichneten Spektren im Standard-EMSA-Dateiformat. Nehmen Sie genügend Proben von Mitochondrien in verschiedenen Zellen, um einen statistisch signifikanten Datensatz zu gewährleisten.Um ein EDX-Spektrum qualitativ zu analysieren, verwenden Sie eine verfügbare Softwaredatenbank und eine Peak-Matching-Routine wie DTSA, um die Hauptelemente in den Spektren zu identifizieren. Identifizieren Sie die Elemente anhand der charakteristischen Energiepositionen ihrer Peaks. Biologische Proben enthalten in der Regel Natrium, Cassium, Phosphor, Schwefel, Chlor, Kalium und Kalzium.Achten Sie besonders auf die Kalzium- und Kaliumpeaks, da sie sich für die quantitative Analyse überlappen. Beginnen Sie mit der Extraktion des integrierten Bereichs der identifizierten Peaks unter Verwendung eines von mehreren Standardanpassungsalgorithmen, wie z. B. der in DTSA integrierten Simplex-Methode, um die Trockenmasse zu schätzen, indem Sie das Kontinuum zwischen 1,45 und 1,61 Kiloelektronenvolt integrieren. Alternative interferenzfreie Bereiche, z. B. 4,0 bis 5,0 Kiloelektronenvolt, können verwendet werden, um fremde nicht-biologische Signale im primären Kontinuumsbereich zu vermeiden.Berechnen Sie abschließend die Peak-über-Kontinuums-Verhältnisse und konvertieren Sie sie durch Vergleich mit Standards in Konzentrationen. Dieser Ansatz ist als Hall-Peak-over-Continuum-Methode bekannt. Hier ist eine Mikroaufnahme eines kultivierten Hippocampus-Neurons zu sehen, das nach der Exposition gegenüber einem zytotoxischen Stimulus, der zur Öffnung von Ionenkanälen und Kalziumfluss führt, schnell eingefroren wurde.Die meisten der hier gezeigten Mitochondrien erscheinen strukturell geschädigt, da sie stark geschwollen sind und kleine, dunkle Einschlüsse enthalten. Die Elektronensonden-Mikroanalyse wurde dann verwendet, um eine Elementaranalyse innerhalb und außerhalb der mitochondrialen Einschlüsse durchzuführen. Die Studie zeigte, dass Einschlüsse zu einem großen Teil aus extrem hohen Mengen an Kalzium und Phosphor bestehen.Dies erklärt ihre außergewöhnliche Kalziumpufferkapazität und warum die Überforderung dieses Puffermechanismus zu einem durch Kalziumüberladung ausgelösten Zelltod führt. Der Hippocampus, ein Bereich des Gehirns, der für das Lernen und das Gedächtnis entscheidend ist, ist ein Hauptort für Verletzungen nach Ischämie. Die funktionell unterschiedliche Region mit der Bezeichnung CA drei ist weitaus weniger anfällig für ischämische Verletzungen als die benachbarte synaptisch verbundene Elektronensonde mit einer Region. Die Mikroanalyse der Elektronensonde nach toxischen Stimuli dieser Schichten zeigte viel größere Kalziumerhöhungen in vulnerablen CA 1-Neuronen als in resistenten CA 3-Neuronen.Folglich weisen CA one Mitochondrien umfangreiche Verletzungen und Dysfunktionen auf, was darauf hindeutet, dass die durch Kalziumüberladung induzierte mitochondriale Dysfunktion ein bestimmender Faktor für die selektive Vulnerabilität von CA one Neuronen ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Konzentration von Gesamtkalzium in einzelnen Mitochondrien kultureller Neuronen mithilfe der Mikroanalyse der Sammelsonde messen können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Neurowissenschaften

Spontane Aktivitäten zu entwickeln neuronalen Netzen kann mit Hilfe AM-Ester Formen von Calcium-sensitiven Indikator Farbstoffe werden. Änderungen der intrazellulären Calcium, was darauf hinweist neuronale Aktivierung, werden als vorübergehende Veränderungen in Indikator Fluoreszenz mit ein-oder Zwei-Photonen-Imaging nachgewiesen werden. Dieses Protokoll kann für eine Reihe von entwicklungs-abhängige neuronale Netze angepasst...

Functional Calcium Imaging in Entwicklungsländern Kortikale Netzwerke

Wir zeigen, wie Veränderungen in der intrazellulären freien Calciumkonzentration und synaptische Wirksamkeit gleichzeitig in einem Ganglion Herstellung...

Überwachen von Änderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration und Synaptic Wirksamkeit in der Muschel<em&gt; Aplysia</em

Dieses Video stellt die Konzepte hinter der Kalziumbildgebung vor und enthält ein Beispielprotokoll für die Zeitrafferbildgebung von Würmern, die in geformten Agarose-Vertiefungen enthalten sind.

Calcium Imaging: Eine Methode zur Visualisierung der neuronalen Aktivität in lebenden C. elegans

Mit seinem kleinen transparenten Körper, gut dokumentierte Neuroanatomie und einer Vielzahl von zugänglicher genetischen Techniken und...

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

Es werden Verfahren beschrieben, um gleichzeitige Aufzeichnungen des Membranpotentials oder -stroms und Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration durchzuführen. Neuronen des suprachiasmatischen Kerns werden mit dem Kalziumindikator Bis-Fura-2 unter Verwendung einer Patch-Clamp-Elektrode in der Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration gefüllt.

Gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnung und Calcium-Bildgebung von Neuronen des suprachiasmatischen Kerns

Wir präsentieren Ihnen eine Methode, die Kombination von ganzen Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen und zwei-Photon imaging um Ca2 + Transienten im neuronalen Dendriten in akuten Hirnschnitten zu erfassen.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Wir präsentieren ein zweiteiliges Protokoll, das fluoreszierende Calcium-Bildgebung mit In-situ-Hybridisierung kombiniert, so dass der Experimentator Muster der Calciumaktivität mit Genexpressionsprofilen auf einzelzelligem Niveau korrelieren kann.

Fluoreszierende Calcium-Bildgebung und anschließende In-Situ-Hybridisierung zur neuronalen Vorläufercharakterisierung bei Xenopus laevis

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Die aktuellen Methoden beschreiben einen nicht-ratiometrischen Ansatz für die hochauflösende, subkompartimentelle Kalziumbildgebung in vivo in Caenorhabditis elegans unter Verwendung leicht verfügbarer genetisch kodierter Kalziumindikatoren.

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

Das vorgeschlagene Protokoll beinhaltet einen globalen Ansatz zur Bewertung der Knochenbildung im Rahmen der Knochenregeneration mit Hilfe multimodaler Analysen. Ziel ist es, qualitative und quantitative Informationen über die Knochenneubildung bereitzustellen und so die Strenge und Validität grundlegender und präklinischer Untersuchungen zu verbessern.

Umfassende Charakterisierung der Gewebemineralisierung in einem ex vivo Modell

Lernen Sie die kryoanalytische Elektronenmikroskopie zur quantitativen Messung von Calcium in Neuronen mit subzellulärer Auflösung. Diese EPMA-Methode ermöglicht präzise Analysen der Calciumverteilung in Mitochondrien.

Messung des Gesamtcalciums in Neuronen, die durch Elektronensonden-Röntgenmikroanalyse

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